Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные подходы к диагностике и терапии воспалительных заболеваний кишечника у детей 15
1.1. Особенности этиологии, патогенеза и клинические проявления воспалительных заболеваний кишечника у детей 15
1.2. Диагностика воспалительных заболеваний кишечника 19
1.3. Принципы лечения воспалительных заболеваний кишечника 22
1.4. Особенности цитокинового профиля при воспалительных заболеваниях кишечника 24
1.5. Патогенетическая роль и информативность исследования клеточного иммунитета при воспалительных заболеваниях кишечника у детей 27
1.6. Диагностика митохондриальной дисфункции при воспалительных заболеваниях кишечника у детей 31
ГЛАВА 2. Объем и методы исследования 37
2.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных 37
2.2. Метод мультиплексного количественного определения цитокинов с использованием проточной цитометрии 41
2.3. Иммуноцитохимический метод определения митохондриальной активности лимфоцитов 47
2.4. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлуориметрии 53
2.5. Исследование содержания антител к гликопротеину 2 методом твердофазного иммуноферментного анализа. 56
2.6. Статистические методы исследования 58
ГЛАВА 3. Результаты исследования 59
3.1. Цитокиновый профиль как предиктор эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК 59
3.2. Оценка состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК 70
3.3. Динамика иммунологических показателей у пациентов с ВЗК в процессе лечения инфликсимабом 84
3.4. Лабораторные маркеры своевременного назначения биологической терапии у детей с ВЗК. 105
3.5. Критерии прогнозирования эффективности блокаторов TNF- у пациентов с ВЗК 124
Заключение 139
Выводы 163
Практические рекомендации 165
Список сокращений 166
- Диагностика воспалительных заболеваний кишечника
- Патогенетическая роль и информативность исследования клеточного иммунитета при воспалительных заболеваниях кишечника у детей
- Иммуноцитохимический метод определения митохондриальной активности лимфоцитов
- Оценка состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК
Введение к работе
Актуальность темы
Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), объединенные понятием воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), в настоящее время являются одной из самых актуальных проблем детской гастроэнтерологии во всем мире [Abraham C. et al., 2009]. Хронический рецидивирующий характер течения, высокий риск оперативных вмешательств, наличие серьезных осложнений обуславливают потребность в совершенствовании подходов к диагностике и лечению ВЗК [Zhang Y. et al., 2014].
Выявление высоких концентрации провоспалительных цитокинов, главным образом фактора некроза опухоли альфа (TNF-), в биоптатах кишечника пациентов с ВЗК позволило разработать патогенетическую стратегию лечения данных заболеваний – биологическую терапию, включающую применение моноклональных антител, селективно блокирующих TNF- [Vermeire S. 2009, . et al., 2008].
Внедрение биологических препаратов в схему лечения ВЗК позволило значительно увеличить долю пациентов, достигающих стабильной ремиссии в короткие сроки. Однако у 30% пациентов не удается добиться снижения активности заболевания на фоне применения блокаторов TNF-, более чем у 50% пациентов наблюдается потеря эффективности терапии в течение первого года лечения [Sanchez-Muoz F. et al., 2008]. К числу причин, вызывающих развитие толерантности к блокаторам TNF-, относят выработку собственных антител к препарату, а также вовлечение TNF--независимых путей патогенеза ВЗК.
Персонифицированный подход к выбору биологического препарата и ранний прогноз недостаточной эффективности терапии позволяет провести своевременную коррекцию схемы лечения, тем самым существенно увеличить клиническую и экономическую эффективность лечения данных заболеваний [Свитич О.А., 2013].
В настоящее время выявлен ряд показателей, обладающих прогностической значимостью при оценке эффективности биологической терапии. К клинико-анамнестическим предикторам относят продолжительность заболевания, форму патологии [Vermeire S. et al., 2002], наличие у пациента в анамнезе хирургического вмешательства по поводу осложнений ВЗК [Orlando A. et al., 2005]. Прогностические возможности лабораторных тестов были показаны на примере определение сывороточного содержания антинейтрофильных антител [Taylor K. et al., 2001]. В настоящее время широко изучаются способы прогнозирования эффективности инфликсимаба, основанные на оценке фармакокинетических параметров, таких как остаточная сывороточная концентрация инфликсимаба [Maser E. et al., 2006].
Перечисленные прогностические параметры обладают рядом ограничений, так как не позволяют оценить прогноз биологической терапии до ее начала, исключают возможность построения прогноза в динамике лечения и разрабатывались для взрослых пациентов с ВЗК.
Имеются данные о прогностической значимости определения содержания ряда цитокинов до начала лечения инфликсимабом у взрослых пациентов с ВЗК. Так в работах . et al., 2012, Di Sabatino A. et al., 2010 в качестве предикторов эффективности биологической терапии предложены сывороточные концентрации IL-23, IL-17А, IFN-, IL-6 и TGF-.
В настоящее время активно изучается диагностическая и прогностическая значимость определения маркеров аутоиммунного воспаления у пациентов с ВЗК. Выявлена информативность определения антител к Saccharomyces cerevisiae, к экзокринной части поджелудочной железы, антител к гликопротеину 2 (anti-GP2) в оценке воспалительной активности ВЗК [Bogdanos D. et al., 2012, Roggenbuck D. et al., 2012].
Исследование содержания и функциональной активности популяций лимфоцитов, играющих важную роль в развитии ВЗК, прежде всего Th17-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов (Тreg) и активированных Т-хелперов, выявило диагностическую значимость данных показателей при оценке воспалительной активности заболевания [Saruta M. et al., 2007, Di Sabatino A. et al., 2010]. Интенсивно изучается роль популяций В-лимфоцитов и информативность их определения в диагностике ВЗК [El-Hodhod M. et al., 2013, Mishima Y. et al., 2009]. Единичные работы посвящены анализу прогностической значимости показателей клеточного иммунитета при ВЗК, показана информативность определения количества циркулирующих Treg лимфоцитов в прогнозе эффективности инфликсимаба у взрослых пациентов с БК [Di Sabatino A. et al., 2010].
В настоящее время получены убедительные доказательства роли митохондриальной дисфункции в патогенезе ВЗК [Alzoghaibi M., 2013, Santhanam S. et al., 2012]. Выявление прямых и косвенных признаков оксидативного стресса в клетках слизистой оболочки кишки и лейкоцитарных инфильтратах непосредственно свидетельствует о нарушении нормальной работы митохондриального аппарата у пациентов с ВЗК [Sifroni K. et al., 2010, Roessner A. et al., 2008, Rezaie A. et al., 2007]. Ключевым ферментом, отражающим активность работы митохондрий, является сукцинатдегидрогеназа (СДГ). Доказана диагностическая значимость определения СДГ при различных патологических состояниях [Сухоруков В.С., 2011, Измайлова Т.Д. и др., 2012, Rutter J. et al., 2010]. Выявлена информативность определения активности СДГ в периферических лимфоцитах при ВЗК и других патологиях ЖКТ у детей. [Семенова Г.Ф. и др., 2007, Климова С.В. и др., 2010].
Таким образом, определение цитокинового профиля, исследование состояния популяций лимфоцитов и их функциональной активности является перспективным в связи с потенциальной возможностью выявления новых лабораторных маркеров прогноза эффективности биологической терапии у пациентов с ВЗК.
Цель исследования – разработать лабораторные критерии прогноза эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК.
Задачи исследования
-
Выявить особенности цитокинового профиля у детей с ВЗК при различной эффективности биологической терапии.
-
Определить информативность показателей клеточного иммунитета и митохондриальной активности популяций лимфоцитов в прогнозе эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК.
-
Оценить динамику иммунологических показателей у детей с ВЗК в течение первого года биологической терапии.
-
Выявить лабораторные предикторы своевременного назначения биологической терапии у детей с ВЗК.
-
Разработать многопараметрический алгоритм прогнозирования эффективности биологической терапии у детей с ВЗК на основании лабораторных показателей.
Научная новизна
Впервые оценено значение содержания широкого спектра циркулирующих цитокинов (IL-1, IL-2, IL-8, IFN-, TNF-, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23, TGF-) в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК. Определены пороговые уровни концентраций TNF-, IL-4, IFN-, IL-12p70, TGF-, позволяющие с высокой точностью прогнозировать эффективность терапии инфликсимабом у детей с ВЗК.
Показана информативность комплексной оценки состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета у пациентов с ВЗК в прогнозе эффективности биологической терапии. Выявлена прогностическая значимость определения исходного содержания В-лимфоцитов, Th17-лимфоцитов, активированных Т-хелперов у детей с ВЗК при оценке эффективности биологической терапии.
Впервые исследована активность сукцинатдегидрогеназы в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей с ВЗК и доказана информативность определения активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах в прогнозе эффективности инфликсимаба у детей с ВЗК.
Проведено длительное, более одного года, динамическое наблюдение расширенного цитокинового профиля, данных иммунофенотипа лимфоцитов, показателей митохондриальной активности популяций лимфоцитов периферической крови и содержания anti-GP2 антител у детей с ВЗК, имеющих различный терапевтический ответ на инфликсимаб.
На основании патогенетически значимых иммунологических показателей разработана комплексная модель прогнозирования эффективности блокаторов TNF- у детей с ВЗК.
Теоретическая и практическая значимость
В работе показана значимость определения концентрации TNF- у детей с ВЗК до начала лечения препаратами, селективно блокирующими TNF-, позволяющая персонифицировать подбор тактики лечения.
Доказана информативность комплексной оценки состояния клеточного иммунитета у пациентов с ВЗК до начала биологической терапии с целью прогнозирования ее эффективности и проведения своевременной коррекции.
Выявлена значимость определения СДГ в популяциях Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах периферической крови при оценке эффективности терапии инфликсимабом.
Исследованы закономерности изменения цитокинового профиля, количественных характеристик и митохондриальной активности популяций лимфоцитов периферической крови, содержания anti-GP2 антител на фоне биологической терапии, позволяющие оценить характер влияния блокаторов TNF- на лабораторные иммунологические показатели у детей с разным эффектом терапии.
В работе продемонстрированы объективные доказательства необходимости раннего назначения биологической терапии у детей с ВЗК с целью повышения ее эффективности.
Разработан многопараметрический алгоритм прогнозирования эффективности биологической терапии у детей с ВЗК, позволяющий персонифицировано подходить к выбору тактики лечения и, тем самым, существенно улучшить качество жизни пациента.
Личный вклад соискателя
Автором выполнен сбор и обработка клинических данных, проведены оценка концентрации циркулирующих цитокинов количественным мультиплексным методом с использованием проточной цитометрии, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови, определение активности СДГ в популяциях лимфоцитов иммуноцитохимическим методом, исследование содержания anti-GP2 антител, осуществлена статистическая обработка полученных данных.
Внедрение в практику
Разработанные алгоритмы прогноза эффективности терапии блокаторами TNF- у детей с ВЗК с 2012 г. успешно внедрены в практику гастроэнтерологического отделения с гепатологической группой НИИ Педиатрии им. Г.Н. Сперанского и отделения восстановительного лечения детей с болезнями органов пищеварения НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН г. Москвы. Получено положительное решение о заявке на получение патента «Способ прогнозирования эффекта терапии инфликсимабом у детей с болезнью Крона» (от 11.07.2013 входящий № 047833, рег.№ 2013132028).
Апробация работы состоялась на совместном заседании лабораторного отдела, гастроэнтерологического отделения с гепатологической группой НИИ Педиатрии им. Г.Н.Сперанского, а также НИИ Профилактической педиатрии ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, ФГБУН Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского, ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, кафедры Клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН 23 декабря 2013 года.
Основные положения диссертации были доложены на научно-практических конференциях: 4th European Congress of paediatricians – Europaediatrics-2009 (Москва, 2009), XVI Российская Гастроэнтерологическая Неделя (Москва, 2010), XVII Всероссийская научно-практическая конференция «Интеграция в лабораторной медицине» (Москва, 2012), III Российская конференция с международным участием «Проблемы нарушения клеточной энергетики - Митохондриальная патология» (Москва, 2012), XVIII Российская Гастроэнтерологическая Неделя (Москва, 2012), 8th Congress of ECCO Inflammatory Bowel Diseases (Vienna, Austria, 2013), Объединенный иммунологический форум (Нижний Новгород, 2013), Congress of pediatrics - ICP 2013 (Melbourne, Australia, 2013), XVII форум «Национальные дни лабораторной медицины (Москва, 2013), 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), 9th Congress of ECCO Inflammatory Bowel Diseases (Copenhagen, Denmark 2014).
Проведение диссертационного исследования одобрено локальным независимым этическим комитетом при ФГБУ «НЦЗД» РАМН, протокол №11 от 14 ноября 2011 г.
Публикации по теме диссертации: по материалам исследования опубликовано 22 печатные работы, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диагностика воспалительных заболеваний кишечника
Воспалительные заболевания кишечника у детей Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым, согласно МКБ 10 (Класс ХI), относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) представляют собой хронические, рецидивирующие неинфекционные заболевания желудочно кишечного тракта, приводящее к необратимому нарушению его структуры и функции [40]. Примерно у 30% пациентов манифестация ВЗК происходит до достижения 18-летнего возраста [7]. В детском возрасте ВЗК отличаются тяжестью течения, большим количеством осложнений, негативным влиянием на рост и развитие организма [42]. Нозологии включенные, в ВЗК, различаются глубиной, распространенностью и локализацией воспалительного процесса. БК характеризуется трансмуральным гранулематозным воспалением с сегментарным поражением ЖКТ [5]. Воспалительный процесс при БК локализуется преимущественно в кишечнике, однако может поражаться любой отдел пищеварительного тракта. ЯК представляет собой диффузное воспаление слизистой оболочки толстой кишки с ее язвенно-деструктивными повреждением. Характерной особенностью ЯК является инициация воспалительного процесса в прямой кишке с последующим распространением в проксимальном направлении толстой кишки [21,39,97]. В настоящее время парадигма деления ВЗК на БК и ЯК подвергается сомнению, в виду распространенности промежуточных патологических форм. Так, утверждается о существовании множества подтипов ВЗК, патогенетически отличающихся по ведущему иммунологическому механизму и фенотипически соответствующих разным формам патологии [54,130,177]. Эпидемиология
Распространенность ВЗК в различных странах варьирует в широких пределах, наибольшая частота встречаемости наблюдается в северной Европе и северной Америке. По данным эпидемиологических исследований последних лет частота ЯК в мире колеблется от 30 до 240 на 100 тыс. населения, в России составляет 22,3 на 100 тыс. Распространенность БК в мире варьирует от 10 до 150 на 100 тыс. населения, в России –3,5 на 100 тыс. населения [21,41,56].
Распространенность ВЗК среди детского населения в мире составляет 2,2-6,8 на 100 тыс. населения. У детей младше 10 лет чаще встречается ЯК, чем БК, при этом отмечается тенденция к неуклонному росту со значительным "омоложением" обеих патологий [42,56].
Гендерное распределение отражает бльшую распространенность БК среди мальчиков, в случае ЯК частота встречаемости у детей обоих полов одинакова. Этиология и патогенез ВЗК Этиопатогенез ВЗК в настоящего времени до конца не известен, тем не менее, очевидно, что развитие хронического воспаления происходит в результате срыва толерантности иммунной системы к микробиоте кишечника под действием триггерных факторов. Несостоятельность эпителиального барьера кишечника приводит к тесному контакту антигенпрезентирующик клеток (АПК) с бактериальными антигенами микрофлоры, ограниченному в норме рядом защитных факторов [1,5,116, 146,153]. Активация АПК сопровождается мощным выбросом провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-1, IL-6, IFN- и др.), которые привлекают в очаг нейтрофилы и Т-лимфоциты [43]. Инициация Т клеточного ответа при ВЗК характеризуется синтезом расширенного спектра провоспалительных цитокинов, интенсивной пролиферацией активированных Т хелперов и Th17-лимфоцитов, что в сочетании с подавлением функций регуляторных Т-лимфоцитов и ингибированием продукции противовоспалительных медиаторов ведет к последующей активации АПК и потенцированию воспалительного процесса [43,153]. Значимую роль в развитии неконтролируемого хронического воспаления при ВЗК играет генетическая предрасположенность индивида [58,116]. В пользу наследственных факторов свидетельствует частое выявление болезни у однояйцевых близнецов и родных братьев [133]. Примерно в 20 % пациентов с ВЗК имеются близкие родственники, страдающие данными заболеванием. К настоящему времени существует целый ряд генов-кандидатов ассоциированных с развитием ВЗК. Наиболее изученным являются гены, регулирующие работу иммунной системы, например, локус гена NOD2/CARD15 – IBD1 (16 хромосома). У пациентов с БК выявлена повышенная частота мутаций данного гена, кодирующего синтез антимикробного цитозольного пептида NOD2, секретируемого в макрофагах, нейтрофилах, дендритных клетках. Наличие в структуре данного белка лейцин-богатых повторов облегчает распознавание мурамил-дипептида – пептидогликанового компонента бактериальной стенки – и, тем самым, позволяет индуцировать адекватный иммунный ответ [63,103,181].
Показана роль врожденных дефектов фагоцитарной системы нейтрофилов, системы компонента комплемента в патогенезе ВЗК [21,179]. Признание существенного вклада патологии врожденного иммунитета в развитии БК и ЯК послужило основой для возникновения альтернативного взгляда на этиологию ВЗК – рассмотрение данной нозологии как формы врожденного иммунодефицита [178].
Другая иммунологическая теория ассоциирует возникновение ВЗК с развитием аутоиммунных процессов, приводящих к перекрстным реакциям с клетками кишечного эпителия. В пользу данной теории свидетельствует обнаружение высоких титров аутоантител в биологических материалах, полученных от больных с ВЗК, например антинейтрофильных антител, антител к Saccharomyces cerevisiae, антител к экзокринной части поджелудочной железы, антител к гликопротеину 2(anti-GP2), антитела к бокаловидным клеткам [60,147].
Иным направлением этиологического поиска стало исследование роли оксидативного стресса в развитии хронического воспаления при БК и ЯК. К данным, подтверждающим наличие оксидативного стресса у пациентов с ВЗК, относят снижение активности ферментов дыхательной цепи в клетках слизистой оболочки кишки, обнаружение высоких концентраций активных форм кислорода и продуктов их окисления в различных биологических материалах (сыворотка и плазма крови, слюна, материалы биопсии), полученных от пациентов с ВЗК, обнаружение дефицита антиоксидантов, таких как витамин С, витамин Е, каротин, глутатион [102,119,144,160,169]. Выявлены случаи сочетания генетически-доказанной первичной митохондриальной недостаточности и БК [143]. Таким образом, в настоящее время активно обсуждается ведущая этиологическая роль митохондриальной дисфункции и оксидативного стресса в формировании патогенетического каскада ВЗК.
Патогенетическая роль и информативность исследования клеточного иммунитета при воспалительных заболеваниях кишечника у детей
Цитокины являются ключевыми сигнальными молекулами, регулирующими работу интестинальной иммунной системы и обеспечивающие поддержание так называемого «контролируемого воспаления» в кишечнике [153]. Важную роль в формировании интестинального барьера играют IL-12 , IL-1, TNF-, IFN-, TGF , IL-17, IL-22, IL-23. Цитокиновый баланс слизистой оболочки кишечника строго регулируется клетками иммунной системы, прежде всего макрофагами собственной пластинки, дендритными клетками и Т-лимфоцитами. У пациентов с ВЗК наблюдается сдвиг естественного баланса цитокинов, приводящий к потере иммунологической толерантности к комменсальной микрофлоре кишечника. В основе развития аберрантного иммунного ответа на микробиоту лежит гиперпродукция провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-1, IL-8, IL-6, IL-12) активированными дендритными клетками и макрофагами слизистой оболочки [116,153]. Нарушение синтеза цитокинов антигенпрезентирующими клетками является триггерным фактором для формирования аутоагрессивных и эффекторных Т-лимфоцитов, что в сочетании с активацией Th17-лимфоцитов и подавлением Treg лимфоцитов приводит к формированию воспалительного лимфоцитарно-плазмоцитарного инфильтрата и гранулем [43,146,153].
Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют, что иммунопатогенеза БК и ЯК отличаются между собой уровнем дифференцировки и активации Т-клеточного звена иммунитета [40], однако новейшие исследования ставят под сомнение парадигму о делении ВЗК на две нозологические формы. Обсуждается существование множества подтипов воспалительных заболеваний кишечника, отличающихся по ведущему патогенетическому механизму и, соответственно, реализующихся в различные фенотипические формы патологии. Согласно такому представлению ВЗК следует дифференцировать по глубине и степени поражения слизистой оболочки кишечника, преобладающему фенотипу, а также наличию внекишечных проявления [130]. В настоящее время известно, что цитокиновый профиль пациентов с БК и ЯК характеризуется гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (TNF-, IL 1, IL-12, IL-6,INF-, IL-23) на фоне снижения синтеза иммуносупрессивных цитокинов, например IL-10 и TGF-. Экспериментально показано, что синтетическая активность Т-лимфоцитов, полученных из слизистой оболочки толстой кишки пациентов с ЯК, характеризуется увеличением продукции IL-5, IL 4, IL-13, что типично для Тh2-опосредованного иммунного ответа [92]. Доминирующим типом иммунного ответа при БК считается Th1-опосредованный ответ, сопряженный с гиперпродукцией IL-2, IFN-, IL-12, IL-15, IL-23 [92,127,146,153]. В последнее время активно изучается роль IL-17 и продуцирующих его Th17-лимфоцитов в патогенезе ВЗК. Согласно данным исследований содержание Th17-лимфоцитов в стенке кишки пациентов с БК значительно увеличено – это приводит к увеличению синтеза IL-17, который в свою очередь является мощным хемоаттрактантом для нейтрофилов и индуктором синтеза IL-6 и TNF- [92]. Особенности цитокинового профиля у детей с ВЗК были показаны в работе Pak и др. (2012), выявивших, что у детей с БК, так же как у взрослых, наблюдается гиперпродукция TNF- и IL-4 CD4+ Т-лимфоцитами периферической крови, при этом концентрации продуцируемых цитокинов у взрослых в два раза превосходила таковую у детей. Полученные данные позволили авторам предположить вовлечение альтернативных патогенетических путей при развитии ВЗК в детском возрасте [135].
Диагностическая значимость цитокинового профиля в оценке тяжести состояния пациентов с ВЗК в настоящее время активно изучается. Показаны корреляции сывороточной концентрации IL-8, IL-6 и IL-22 с клинико лабораторной и эндоскопической активностью ВЗК, содержанием TGF- и наличием фиброза у пациентов с БК и др. [130]. Особый интерес представляет оценка информативности определения концентрации TNF- в рамках поисках новых лабораторных маркеров активности воспалительного процесса. Изучению данного вопроса посвящено множество научных работ, данные которых зачастую противоречат друг другу [64,113,129,141]. В ряде исследований показана значимая зависимость между клинико-эндоскопической активностью заболевания и содержанием TNF- в сыворотке пациентов с БК [64,141]. Данные других исследований не подтверждают увеличение концентрации TNF- у пациентов с ВЗК в период обострение по сравнению с ремиссией заболевания, в том числе на фоне применения инфликсимаба [113,129].
Сравнение концентрации циркулирующих цитокинов у пациентов с ВЗК и условно здоровых людей в настоящий момент не дало однозначного представления о характере сдвига лабораторных показателей при БК и ЯК. Большая часть исследователей выявили значительное увеличение содержания провоспалительных цитокинов на фоне снижения концентраций противовоспалительных медиаторов в сыворотке пациентов с ВЗК по сравнению с нормальными значениями, что отражает изменения баланса цитокинов в очаге поражения ЖКТ [79,85,108]. Некоторые ученые не подтверждают изменения концентрации циркулирующих цитокинов у пациентов с ВЗК по сравнению со здоровыми людьми [101,132].
Иммуноцитохимический метод определения митохондриальной активности лимфоцитов
Исследование проводилось в период с 2008 по 2013 год в лаборатории цитохимии (заведующая лабораторией - докт. биол. наук, проф. С.В. Петричук) и гастроэнтерологическом отделении с гепатологической группой (заведующий отделением - докт. мед. наук, проф. А.С.Потапов) ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН (директор – академик РАН проф., А.А. Баранов).
Для решения поставленных задач было обследовано 100 детей с ВЗК в возрасте от 10 до 17,9 лет (55 мальчиков и 45 девочек). Болезнь Крона была диагностирована у 67 детей, 33 ребенка страдали язвенным колитом. Диагнозы устанавливались на основании анамнестических, клинико-лабораторных, эндоскопических и гистологических данных. Длительность заболевания на момент обследования варьировала от 1 месяца до 13 лет и в среднем составила 4 года. Все пациенты комплексно обследовались в динамике заболевания на фоне проводимого лечения от 1 до 27 раз. Длительность наблюдений составила от 1 месяца до 5 лет.
Контрольную группу составили 45 практически здоровых детей (25 мальчиков и 20девочек) в возрасте от 12 до 16 лет. Клиническую активность ВЗК определяли согласно международным рекомендациям, используя педиатрический индекс активности болезни Крона (Pediatric Crohn s Disease Activity Index – PCDAI) и педиатрический индекс активности язвенного колита PUCAI (Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index). При подсчете PCDAI и PUCAI учитывались физикальные данные (выраженность кишечных симптомов, нарушение общего самочувствия, наличие внекишечных проявлений и др.), а также ряд лабораторных показателей (гематокрит, СОЭ, сывороточное содержание альбумина) [100,166].
Эндоскопическая активность заболевания оценивалась с помощью простого эндоскопического индекса БК (Simple Endoscopic Score for Crohn s Disease) - SES 38 CD и эндоскопического индекса активности ЯК по Рахмилевич (Rachmilewitz endoscopic activity index – EAI) [104,117]. Эндоскопические методы исследования проводились в эндоскопическом отделении НЦЗД РАМН (зав. - д.м.н. А.А.Шавров). Эзофагогастродуоденоскопию проводили с использованием гибких эзофагогастродуоденоскопов GIF-10 и GIF 40 (Olympus, Япония). Колоноскопия с забором биопсийного материала слизистой оболочки из всех отделов тонкой и толстой кишки (лестничная биопсия) проводилась фиброскопами EC-410 HI и EC-485 ZW (Fujinon, США).
Колоноскопия проводилась под общим обезболиванием или с применением анальгетических и седативных препаратов. Некоторым пациентам, с целью верификации диагноза была выполнена видеокапсульная эндоскопия (ВЭК) желудочно-кишечного тракта с помощью диагностической системы GivenR Imaging Ltd (США).
Гистологические исследования биоптатов кишечника выполнялись в патологоанатомической лаборатории НЦЗД РАМН (зав.-д.м.н., проф. А.Г.Талалаев) и в патоморфологической лаборатории ФГБУ «Государственный научный центр колопроктологии» Министерства здравоохранения РФ (зав.-д.м.н., проф. Л.Л.Капуллер).
Оценка цитокинового профиля, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и иммуноцитохимическое исследование проводилось в лаборатории цитохимии НЦЗД РАМН (зав.- д.б.н., проф. С.В. Петричук). Клиническое и биохимическое исследование крови было выполнено в центральной клинико-диагностической лаборатории НЦЗД РАМН (зав.- д.м.н. Е.Л. Семикина), анализ кала на кальпротектин, определение содержания анти-GP2 антител проводились в лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии НЦЗД РАМН (зав.-д.м.н. Н.А.Маянский).
Биологические образцы были получены с использованием системы для взятия венозной крови BD Vacutainer. Исследование выбранных лабораторных параметров в динамике биологической терапии проводилась непосредственно перед инфузией препарата и на следующие сутки после.
Исследование проведено в соответствии с этическими нормами и Правилами клинической практики РФ. При обследовании детей было получено информированное добровольное согласие родителей на медицинское вмешательство. Определение концентрации циркулирующих цитокинов проводилось мультиплексным количественным методом с использованием проточной цитофлуориметрии. Биологические образцы (плазму крови) получали методом центрифугирования цельной крови и хранили при температуре -70С.
Мультиплексный анализ предназначен для одновременного количественного определения концентрации нескольких аналитов (цитокинов) в одном биологическом образце. Принцип метода Мультиплексный метод количественного определения цитокинов основан на принципе иммуноанализа типа «сэндвич», в котором антитела к соответствующему аналиту связаны с поверхностью микрочастиц (микросферы).
В методике используются 2 типа микрочастиц, отличающихся по размеру: популяция А - 5,5 мкм , популяция В - 4,4 мкм. Разделение частиц по размерам осуществляется по прямому светорассеянию. Частицы типа A и типа B также различаются по интенсивности флуоресценции, что позволяет разделить частицы типа A на 11 популяций, а частицы типа B на 9 (длина волны испускания – 690нм, длина волны возбуждения – 488 нм, аргоновый лазер). Это позволяет легко идентифицировать популяции микрочастиц на проточном цитометре (Рис 2.1).
Оценка состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК
Исходное содержание Т-лимфоцитов соответствовало значениям контрольной группы и не отличалось между группами наблюдения, увеличение относительного количества Т-лимфоцитов имело перераспределительный характер и было наиболее выраженно у пациентов с нестабильным эффектом лечения. Митохондриальная активность основных популяций Т-лимфоцитов была существенно снижена у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба, при этом у детей со стойким положительным ответом на препарат активность СДГ соответствовала нормальным значениям.
Анализ популяций Т-лимфоцитов выявил существенное увеличение содержания активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, Treg лимфоцитов и Th2-лимфоцитов у всех пациентов с ВЗК до начала терапии вне зависимости от ее эффективности. Группа пациентов с минимальным терапевтическим ответом на инфликсимаб характеризовалась увеличением исходного содержания активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, Treg лимфоцитов и Th2 лимфоцитов по сравнению с пациентами со стойкой эффективностью препарата. Митохондриальная активность большинства минорных популяций Т-лимфоцитов соответствовала нормальным значениям, за исключением популяции Th17-лимфоцитов, активность которых была снижена у всех детей, достигая минимальных значений у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба. Группа пациентов со стойким положительным ответом на биологическую терапию характеризовалась исходно более высокой активностью СДГ в популяции Treg по сравнению с пациентами, имеющими нестабильный эффект инфликсимаба.
Все дети с ВЗК до начала терапии имели повышенное содержание активированных Т-лимфоцитов и NKT-лимфоцитов на фоне сниженного количества NK-клеток, при сохранении нормальной митохондриальной активности данных популяций
Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании эффективности терапии блокаторами TNF- был проведен ROC-анализа данных иммуноцитохимического исследования и иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови до начала лечения. Определение исходного содержания Th17-лимфоцитов, активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах соответствовало высокой вероятности правильного прогноза эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (интервал AUC 0,8-0,9; p 0,05) (Рис. 3.2.6).
Оценка исходного содержания активированных Т-хелперов (%CD3+CD4+) и показателей активности СДГ в них, относительного количества В-лимфоцитов и активности СДГ в них, определение активности СДГ в популяциях Т-лимфоцитов, Th17-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, В2-лимфоцитах, активированных Т-хелперах и активированных Т-лимфоцитах характеризовалась хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8; p 0,05) (Табл. 3.2.7, Табл. 3.2.8).
Анализ прогностических моделей, построенных на измерении активности СДГ и количества NK-клеток, оценке абсолютного содержания В-лимфоцитов, соотношение популяций В1- и В2-лимфоцитов (% от CD19+), определении количества активированных Т-хелперов (% от ЛФ), Тreg лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов выявил средний уровень прогностической модели AUC(0,6-0,7; p 0,05).
Вероятность правильного прогноза эффективности терапии инфликсимабом на основе определения количественных характеристик и митохондриальной активности других популяций лимфоцитов не превышала вероятности случайных событий. Таблица 3.2.7
Уровень порогового значения (cut-off) был определен для наиболее значимых иммунологических показателей – относительного содержания Th17-лимфоцитов (% от CD3+CD4+), активности СДГ в популяциях Тreg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах (Табл. 3.2.9).
При выборе уровня cut-off учитывалась важность прогнозирования нестабильного ответа на терапию блокаторами TNF-, что соответствовало бльшему значению специфичности. Таблица 3.2.9
Значение относительного количества Тп17-лимфоцитов (% от СОЗ+С04+лимфоцитов), превышающее 18,6%, позволяет прогнозировать нестабильный эффект от инфликсимаба с вероятностью 87%. Снижение митохондриальной активности Treg лимфоцитов ниже 207 у.е. соответствует прогнозу минимального терапевтического ответа на препарат с вероятностью 88%. Вероятность правильного прогноза эффективности биологической терапии, построенного на исследовании исходной активности СДГ в популяции Т-хелперов составила 79%, при этом снижение митохондриальной активности в данной популяции менее чем 197 у.е. является предиктором нестабильности терапевтического ответа. Значение исходной активности СДГ в популяции В1-лимфоцитов ниже 177 у.е. соответствует прогнозу минимального терапевтического ответа на инфликсимаб с вероятностью 75%.
