Введение к работе
Актуальность проблемы. Сдвиги в системе гемостаза занимают одно из центральных мест среди общепатологических процессов. С ними связаны различные виды кровоточивости, тромбозы, инфаркты и ишемии органов, синдромы диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и полиорганной недостаточности, нарушения микроциркуляции и ряд других широко распространенных видов патологии (М.С.Мачабели, 1972-1986; З.С.Баркаган, 1980-1989; В.П.Балуда и др., 1981-1984; М.Ферстрате, Ж.Фермилен, 1986; И.Н.Бокарев и др., 1989; Д.Д.Зербино, Л.Л.Лукасевич, 1989; В.Г.Лычев, 1993;" o.D.flat-noff, Ch.D.?orbes, 1934; R.Z.Bick, 1985; u.U.Seghatchian et al., 1996 и др.). Ваьное место эти нарушения занимают в патогенезе критических и терминальных состояний, ряда форм акушерской патологии, атеросклероза, метастазировании опухолей и многих других широко распространенных видов патологии (З.С.Баркаган, I960, 1996; O.K. Гаврилов, 1981; А.Д.Макацария, 1981; Л.П.Папаян, 1982; Е.И.Чазов, 1983; Д.М.Зубаиров, 1985; Е.Ю.Васильева, 1992; А.В.Чупрова, 1994; E.P.IJaaraen et al. , 1983; H.Callender, S, J.Hapaport, 1993; T.Bar-b'ul et al., 1995; Asherson et al. , 1996).
Развитие современного учения о системе гемостаза, как и совершенствование диагностики ее нарушений на всем своем протяжении было неразрывно связано с изучением аффектов и использованием в клинической практике гетерогенных коагулаз и других активаторов и ингибиторов различных звеньев этой системы. Это относится как к содержащимся в бактериальных клетках и грибах компонентам (стреп-токиназа, стафиллокоагулаза и др.), так и к таковым в продуктах животного происхождения (гирудин, гепарин, коагулазы и ингибиторы из змеиных ядов и др.)
В трудах зарубежных авторов (K.W.E.Denaon et al., 1971;
B.R.Pranza et al., 1975; E.Sakuragawa et al., 1975; W.Kisiel et al. , 1976; D.ilebs, 1973; S.S.Bajwa et al., 1930, 1931; F.Korna-lik et al., 1933; 1983; K.P.Stocker, J.Meier, 1988 ), а такте В отечественных работах, в том числе нашей группы (З.С.Баркаган и др., 1977*1996; Л.П.Цывкина, 1977-1985; Л.П.Цывкина и др., 1977-1991; Г.А.Глазунова и др., 1983; Г.А.Глазунова, 1988; Т.П.Угарова, 1989) были расшифрованы точки приложения и механизмы действия гемокоагулирующих змеиных ядов и разработаны на этой основе оригинальные методы диагностики ряда нарушений гемостаза, В, частности, показана возможность с помощью герпетотоксинов выявлять дефицит ряда факторов свертывания, оценивать содержание в плазме тромбинорезистентных компонентов фибриногенового пула, диагностировать ряд предтромботических состояний. Эти методы диагностики прошли широкое клиническое испытание, успешно внедрены в повседневную диагностическую практику, фигурируют в руководствах по лабораторной диагностике (В.П.Балуда и др., I960; Под ред. М.А. Базарновой, 1982; В.Г.Михайлов, Г.А.Алексеев, 1986; Под ред. В.В.Меньшикова, 1987; Иванов Е.П., 1991).
Установлено также, что использование герпетотоксинов и содержащихся в них протеаз базируется не столько на сходстве, сколько на фундаментальных отличиях этих энзимов от естественных компонентов свертывающей системы крови (З.С.Баркаган, Л.П.Цывкина, 1961; Л.П.Цывкина, 1935 и др.).
Последнее десятилетие ознаменовалось значительным прогрессом учения о механизмах свертывания крови, разработкой матричной теории этого процесса (Ц. М.Зубаиров, I98U; Д. М.Зубаиров и др.,1985-1991; О.А.Терсенов, А.Ш.Бышевский, 198а; А.Ш.Бышезский и пр.. 1993 и др.), открытием большого числа ранее неизвестных видов патологии системы гемостаза, в том числе большого числа наследственных и приобретенных тромбофилий (З.С.Баркаган, 1991, 1996). В связи
с этим возникла необходимость выяснения степени участия плазменных фосфолипицных мембран (П$М) и их аналогов в самих ядах в реализации гемокоагулирующего действия этих энзимов, возможности использования ядов змей отечественной фауны в диагностике ряда вновь выявленных видов патологии, в том числе антифосфолипидного синдрома (АФС) и других тромбофилий, нарушений полимеризации мономеров фибрина, в частности при геморрагических мезенхимальных дисплаэиях, выявления в сыворотке "заблокированного" фибриногена при ДВС синдромах.
В настоящей работе, являющейся частью крупномасштабных исследований по проблеме диагностики и терапии нарушений гемостаза,проводимых в Алтайском государственном медицинском университете и зональном гематологическом центре под руководством члена-корреспондента РАМН, доктора мед. наук, профессора З.С.Баркагана, обобщаются результаты наших многолетних исследований по изучению механизмов действия и использованию в диагностике герпетотоксинов отечественной фауны.
Цель работы. Дальнейшее изучение механизмов действия гемокоа-гулирующих змеиных ядов и их фракций на систему гемостаза, определение возможностей их использования в диагностике ряда видов патологии системы гемостаза, в том числе вновь открытых форм геморрагических мезенхимальных дисплазий и тромбофилий, разработка коа-гулометрических вариантов этих методик и создание на этой основе новых диагностикумов.
Задачи исследования.
I. Провести дальнейшее изучение влияния змеиных ядов и входящих в их состав компонентов на разные звенья системы гемостаза с учетом их взаимодействия с компонентами системы гемостаза на плазменных фосфолипидных мембранах и аналогичных надмолекулярных сое-
динениях, содержащихся в самих ядах. Разграничить на этой основе коагулазы ядов на фосфолипид-зависимые и фосфолипид-независимые.
2. Определить влияние гемокоагулирующих змеиных ядов отечест
венной фауны на конечный неферментативный этап свертывания крови
- полимеризацию мономеров фибрина, уточнить значение этого влияния на показания коагуляционных тестов в норме и при различных нарушениях гемостаза, в том числе при геморрагических мезенхималь-ных цисплазиях.
-
Разработать на основе кинетического способа методику определения некоагулирующих (заблокированных) компонентов фибриногено-вого пула, в том числе тромбинорезистентных, с помощью ядовой коагулазы с целью создания нового теста для распознавания ДОС синдрома. Сопоставить его результаты с показаниями новых количественных методов определения РФЖ и ранних ЦДФ - ортофенантролинового теста (0-ФТ) и сывороточного теста склеивания стафилококков (ТСС).
-
Изучить с помощью реагентов из змеиных ядов и оригинального образца эталонной плазмы без фактора У возможности создания доступных диагностических тестов для распознавания ряда наиболее распространенных тромбофилий - резистентности к протеину С, анги-фосфолипицного синдрома и др.
-
Дать сравнительную характеристику влияния нефракционирован-ного и низкомолекулярных гепаринов на гемокоагулирующие эффекты ядов змей отечественной фауны, обосновать использование этих гетерогенных коагулаз для дифференциации различных видов гипокоагуля-ции - коагулопатии потребления, гепариновой и др.
-
Адаптировать ядовые диагностические тесты для их выполнения на коагулометрах разных конструкций, дать сравнительный анализ мануальных и аппаратных вариантов методик.
-
Создать на основе проведенных исследований новые диагностические наборы.
d. Провести широкую клиническую апробацию ядовых тестов при различных видах патологии системы гемостаза, определить их информативность и возможности использования для проведения экспресс-диагностики.
Научная новизна.
-
Впервые изучено влияние плазменных фосфолипидных мембран и надмолекулярных компонентов, содержащихся в самих змеиных ядах на гемокоагулирующие эффекты этих токсинов. Обосновано разделение всех ядовых коагулаз на фосфолипид-зависимые и фосфолипид-незави-симые. Разработана методология использования коагулаз змеиных ядов для оценки степени фосфолипидной активации процесса свертывания крови и блокады ее антифосфолипицными антителами.
-
Выявлено неодинаковое влияние нефракпионированного гепарина (НГ) и низкомолекулярных гепаринов (НМГ) на гемокоагулирующие эффекты змеиных ядов. Показано, что чувствительность гетерогенных коагулаз к НМГ раскрывает новые возможности терапевтического воздействия на токсигенные ДВС синдромы.
-
Впервые показана возможность использования гемокоагулирую-щих ядов змей отечественной фауны для выявления эффектов различных видов антикоагулянтов волчаночного типа, диагностики антифосфоли-пидного синдрома.
-
Выявлено ранее неизвестное тормозящее влияние змеиных ядов на конечный этап свертывания крови - полимеризацию мономеров фибрина, что может служить основой для разработки новых методов использования этих токсинов для выявления дисфибриногенемией и оценки степени активации фактора ХШ.
о. Разработан (совместно с А.Н.Мамаевым) новый вариант методики распознавания с помощью реагента из змеиного яда тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Ya к активированному протеи-
ну С. Впервые показана высокая частота этой аномалии в российской популяции Сибири (Приоритетная справка на изобретение "Способ диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Уа к активированному протеину С", ^ 96ІІ6Ц0, 1996 г. Россия).
6. Показана возможность определения с помощью ядов песчаной и многочешуйчатой эфы.;содергания в сыворотке крови растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и других производных фибриногена (Авторское свидетельство на изобретение ?? П46002, 1984 г. СССР).
?. Впервые установлена высокая частота мезенхимальной дисплазии, сочетающейся с нарушениями полимеризации мономеров фибрина у значительной части больных гемофилией.
Практическое значение.
Разработаны оригинальные методики диагностики нарушений гемостаза и дефицита ряда факторов свертывания крови (X, П, I) с помощью ядовых коагуляционных проб. Разработан новый способ диагностики антифосфолипидного синдрома ( АФС ).:.'.-. с помощью теста с разведенным ядом гюрзы (совм. с И.Я.Цеймах). Создан совместно с А.Н.Мамаевым доступный метод фенотипической диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С.
Показана возможность использования ядовых тестов для выявления нарушений конечного этапа свертывания крови - полимеризации мономеров фибрина и определения пула заблокированного фибриногена в сыворотке крови, диагностики этих нарушений при ГМД и ДВС синдромах. Установлена возможность диагностики с помощью, ядовых тестов гииеркоагуляши, в т.ч. замаскированной гепаринотерапией.
Разработан (совм. с И.Я.Цеймах) автоматизированный вариант выполнения коагуляционных тестов с ядами змей и проведено сравнительное изучение их показаний в мануальном исполнении и на опти-
веском и шариковом коагулометрах. Определены нормативные показатели этих тестов.
Разработана планшетная технология создания яцовых диагностических наборов, предназначенных для выявления нарушений в системе гемостаза, что упрощает методику и значительно уменьшает затрату времени и реагентов на выполнение исследований.
Внедрение в практику.
Разработанные методы и диагностические наборы внедрены в практику работы в лаборатории гемостаза Алтайского краевого гематологического центра, Алтайской краевой клинической больницы, гематологического центра РАШ (г. Москва), клинико-диагностической лаборатории НИИ Педиатрии и детской хирургии МЗ России (г. Москва), лаборатории гемостаза Тульской областной больницы и других научно-исследовательских и лечебных учреждений РФ и СНГ.
Нала*.ен выпуск соответствующих диагностикумов фирмой "Технология-Стандарт" (г. Барнаул).
Предложенные способы диагностики изложены в следующих методических рекомендациях:
-
Диагностика нарушений гемостаза с помощью змеиных ядов. МЗ СССР, М., 1968. - 21 с. (совм . с З.С.Баркаганом, И.Б.Калмыковой, В.А.Макаровым и др.).
-
Антикоагулянты волчаночного типа. Клиническое значение, диагностика, лечение. Барнаул, 1993. - 18 с. (совм. с З.С.Баркаганом,. Г.В.Сердюк, А.Е.Дороховым).
По результатам НИР получены авторские свидетельства на изобретения:
-
Способ количественного определения фибриногена в плазме крови. V- Ц46002, 1964, СССР. (совм. с З.С.Баркаганом).
-
Способ определения пригодности змеиных ядов для коагулоло-
гических исследований, f 1628698, 1990, СССР (совм. с З.С.Баркага-ном, И.Б.Калмыковой, В.А.Макаровым, Т.М.Шелеповой).
3. Получена приоритетная справка по заявке на изобретение "Способ диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Ya к активированному протеину С" (совм. с З.С.Баркаганом, А.Н.Мамаевым) »' 96II6II0, 1996, Россия.
Результаты выполненных исследований получили частичное отражение в следующих руководствах и монографиях:
-
Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. "Лабораторные методы исследования системы гемостаза" Томск, 1980.
-
Руководство по клинической лабораторной диагностике /под ред. М.А.Базарновой. Киев, 1982.
-
Михайлов В.Г., Алексеев Г.А. "Исследование системы гемостаза". Ташкент, 1986.
-
Лабораторные методы исследования в клинике /под ред. В.В. Меньшикова. М., 1987.
-
Иванов Е.П. "Руководство по гемостазиологии", Минск ,1991.
Основные положения работы доложены и обсуждены: на 9-м Европейском симпозиуме по животным, растительным и бактериальным токсинам (Лохусалу, Эстония, 1990); 26-м Гамбургском симпозиуме по свертыванию крови (1993); УІ Международном симпозиуме по антифос-фолипидным антителам (Левен, Бельгия, 1994); II Всемирном конгрессе по животным , растительным и микробным токсинам (Тель-Авив, Израиль, 1994); 14 Международном конгрессе по тромбозам (Монпелье, Франция, 1996); ХУІ Международном конгрессе по тромбозам и гемостазу (Флоренция, Италия, 1997). На Всесоюзных конференциях: "Про-тивотромботическая терапия в клинической практике. Новое в терапии, диагностике, лечении" (М., 1986); 6 и 7-й Всесоюзных герпетологических конференциях (Ташкент, 1985; Киев, 1989); Конференции "Биологически активные вещества" (Вильнюс, 1988); "физиология и патология
гемостаза" (Полтава, І99Г); 3-м Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Киров, 1991); 2-й Всесоюзной токсинологической конференции (Ашхабад, 1991); на Республиканской научно-практической конференции работников службы крови РФ (Кемерово, 1986); Съезде гематологов и трансфузиологов Грузии (Боржоми, 1988); Всероссийском съезде терапевтов (Горький, 1989); Конференции врачей-лаборантов Эстонии ,"Актуальные вопросы лабораторной диагностики" (Таллин, 1989); Российских конференциях "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995); "Тромбозы и геморрагии, ДВС синдром. Проблемы лечения" (М., 1997).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 39 работ, из них 2 в центральной и 8 - в зарубежной печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 256 стр. машинописи, иллюстрирована 72 таблицами и 21 рисунком. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав с изложением результатов собственных наблюдений и исследований, заключения, выводов и списка литературы (363 источника).
