Содержание к диссертации
Введение Глава 1. Современный взгляд на иммунологические факторы нарушения мужской репродуктивной функции
Причины нарушения мужской репродуктивной функции
Роль инфекции в развитии мужского бесплодия
Нарушения организации генетического материала сперматозоидов
Развитие аутоиммунных процессов репродуктивного тракта
Ингибин В - маркер сперматогенеза
1.6 Роль цитокинов в регуляции сперматогенеза
1.7. Способы оценки нарушений мужской репродуктивной
функции Глава 2. Материалы и методы исследования
Характеристика обследуемых групп
Методы исследования
Преаналитический этап исследований
Аналитический этап исследований
2.3. Статистическая обработка полученных данных
Глава 3. Результаты собственных исследований
Качественно-количественные показатели эякулята
Структурная организация половых клеток у мужчин с нормоспермией и патоспермией
Исследование антиспермального иммунитета у мужчин с нормоспермией и патоспермией
Исследование уровней медиаторов в сыворотке крови и семенной плазме
Корреляционные взаимосвязи исследованных
Стр.
показателей
3.6. Способ диагностики нарушений сперматогенеза у
80 мужчин с нормоспермиеи
Заключение 83
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Список литературы 95
ПЕРЕЧЕНЬ
условных обозначений и сокращений, используемых в работе АСАТ - антиспермальные антитела ВПГ - вирус простого герпеса
ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии ГТБ - гематотестикулярный барьер ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ ЛГ- лютропин
ПЦР - полимеразная цепная реакция ФСГ- фоллистатин CRP - С-реактивный белок
DFI (DNA Fragmentation Index) - индекс фрагментации ДНК HDS (high DNA stainable cells) - клетки с высокой способностью к окрашиванию IB - ингибин В
ICSI - инъекция сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ИКСИ) IFN - интерферон Ig - иммуноглобулин IL - интерлейкин
SCSA (sperm chromatin structure assay) - анализ структуры хроматина сперматозоидов TNF - фактор некроза опухоли
Введение к работе
В структуре бесплодного брака тенденция к росту мужского фактора и ухудшению качества спермы диктует необходимость пристального изучения существующей проблемы [6, 7, 45, 71, 77, 78, 81].
Признанным интегральным критерием состояния мужской репродуктивной функции является исследование эякулята, включающее в себя оценку концентрации, подвижности и морфологии сперматозоида. Результаты исследования, рекомендованного ВОЗ, не всегда надежны т.к. фертильность бывает сохранена даже при значительных отклонениях показателей спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться и у мужчин с нормоспермией [52, 67, 84].
В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений в исследовании нарушений репродуктивной функции мужчин является изучение аномалий структурной организации хроматина мужских гамет, которые могут быть обусловлены эндогенными разрывами молекулы в процессе компактизации хроматина ядер сперматозоидов, инициацией процесса апоптоза в ходе сперматогенеза, окислительным стрессом в результате действия избыточной концентрации активных форм кислорода [28, 81, 86, 139]. Другим механизмом нарушения фертильности считается развитие аутоиммунных реакций против собственных сперматозоидов [31, 57].
Регуляция мужской репродуктивной функции является многоуровневой, с вовлечением не только эндокринной, но и других систем, в частности иммунной. Нормальное протекание процессов гаметогенеза обеспечивается взаимодействием большого количества клеток различного типа, которое осуществляется не только при непосредственных межклеточных контактах, но и за счет сложной системы цитокинов [44, 62].
На сегодняшний день отсутствует целостное представление о взаимодействии цитокиновых сигналов и процесса сперматогенеза. Ряд авторов придерживается точки зрения, что изменение уровня цитокинов
ассоциируется не с эффективностью сперматогенеза, а, главным образом, с воспалительным процессом в мужском репродуктивном тракте, в других работах демонстрируется тесная корреляционная взаимосвязь уровня цитокинов с рутинными показателями спермограммы: концентрацией, подвижностью, морфологией [46, 62, 87, 95, 98].
Таким образом, определение роли иммунной системы в сперматогенезе является перспективной, так как появление новых знаний в этой области позволяет усовершенствовать диагностику и предложить новые методические подходы к анализу причин нарушения репродуктивной функции мужчины [31, 48].
Цель исследования: определить иммунологические факторы нарушения сперматогенеза у мужчин с бесплодием.
Задачи исследования
Выявить особенности структурной организации хроматина сперматозоидов у мужчин из супружеских пар с бесплодием.
Определить содержание цитокинов в сыворотке крови и эякуляте мужчин из бесплодных супружеских пар и здоровых фертильных мужчин.
Оценить взаимосвязь между иммунологическими параметрами и нарушением степени компактизации хроматина сперматозоидов мужчин из супружеских пар с бесплодием.
Разработать алгоритм обследования мужчин из числа бесплодных супружеских пар на основе наиболее информативных иммунологических показателей.
Научная новизна , Определены особенности структурной организации хроматина половых клеток методом проточной цитометрии у мужчин из бесплодных супружеских пар. Установлено снижение степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышение уровня дефектных клеток в эякуляте пациентов как при нормо-, так и при патоспермии.
Показано, что нарушение организации хроматина сперматозоидов сопровождается статистически значимым снижением концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышением уровня антиспермальных антител в эякуляте.
Выявлена общая направленность ряда цитокиновых сигналов: повышение синтеза IL-1|3, IL-8, TNF-a, IL-10 в спермальной плазме и возрастание концентрации IL-1RA и IL-8 в сыворотке крови, что позволяет дифференцировать пациентов из супружеских пар с бесплодием и фертильных мужчин.
Установлено, что у пациентов с нормоспермией при снижении степени компактизации хроматина сперматозоидов и/или повышении уровня дефектных клеток в эякуляте, наряду с выявленными общими признаками в продукции цитокинов, имеет место повышение концентраций IFN-y и TNF-a в сыворотке крови, а также концентрации CRP и ростового фактора TGF-р в спермоплазме.
Развитие патоспермии сопровождается усилением локальной продукции IL-2, IL-4 и IFN-y на фоне снижения концентрации IL-6.
Выявлены наиболее информативные показатели: степень компактизации хроматина сперматозоидов D/s, относительное содержание дефектных клеток HDS, концентрация ингибина В, на основании которых выведена формула определения диагностического индекса для оценки нарушений сперматогенеза у мужчин с нормоспермией, вошедшая в основу новой медицинской технологии (ФС № 208/248 от 19.11.2008).
Получен патент №2262107 на изобретение «Способ определения зрелости сперматозоидов» и приоритетная справка на изобретение «Способ диагностики мужского бесплодия» №2008115047.
Практическая значимость
Установлены наиболее информативные параметры для оценки нарушений сперматогенеза - степень компактизации хроматина
сперматозоидов D/s, относительное содержание дефектных клеток HDS, концентрация ингибина В.
Разработан алгоритм лабораторного обследования пациентов из бесплодных супружеских пар при нормоспермии.
Использование разработанных критериев позволяет повысить эффективность диагностики нарушений мужского репродуктивного потенциала.
Основные положения, выносимые на защиту
Нарушение организации хроматина сперматозоидов имеет место у пациентов из бесплодных супружеских пар не только при пато-, но и при нормоспермии.
Снижение концентрации ингибина В в сыворотке крови и повышение уровня антиспермальных антител у мужчин из супружеских пар с бесплодием сопровождается снижением степени компактизации хроматина сперматозоидов и повышением относительного количества дефектных клеток в эякуляте.
В зависимости от выраженности степени нарушений организации мужских половых клеток наблюдается изменение продукции цитокинов на локальном и системном уровнях.
Особенности структурной организации хроматина, содержание дефектных клеток в эякуляте и концентрация ингибина В в сыворотке крови могут служить дополнительными иммунологическими маркерами оценки репродуктивной функции мужчин.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий», научно-практических конференциях ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» (2007-2008г.г.). Материалы диссертации представлены на III съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006г.); Республиканской научно-практической конференции «Инновационные технологии в охране репродуктивного
здоровья женщины» (Екатеринбург, 2007г.), VI конференции иммунологов Урала (Ижевск, 2007г.), Международной научно-практической конференции «Репродуктивное здоровье населения Урала и Сибири» (Екатеринбург, 2008г.).
Публикации и внедрение
По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 6 публикаций в печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Результаты исследований, представленные в диссертации, внедрены в практику научной поликлиники ФГУ «НИИ ОММ Росмедтехнологий» г. Екатеринбурга; Центра семейной медицины г. Екатеринбурга; поликлиники «Ваш семейный доктор» г. Екатеринбурга; Свердловского областного центра планирования семьи и репродукции г. Екатеринбурга.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных сокращений и библиографического указателя, включающего 152 источника, в том числе 72 иностранных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками.
