Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Послеродовые гнойно-септические заболевания и система врожденного иммунитета. обзор литературы
1.1. Послеродовые гнойно-септические осложнения как одна из главных проблем современного акушерства 12
1.2. Послеродовый эндометрит: современные аспекты этиологии и патогенеза 16
1.3. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета как первая линия распознавания патогенов 29
1.4. Роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений 35
Глава 2. Материалы и методы 4 4
2.1. Объект исследования. 44
2.2. Клиническое обследование и сбор материала 46
2.3. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование 48
2.4. Количественная ПЦР 50
2.5. Статистическая обработка результатов 52
Результаты собственных исследований
Глава 3. Социально-биологический статус женщин с послеродовыми гнойно-септическими заболеваниями .
Глава 4. Антиинфекционная защита репродуктивного тракта женщины и её роль в патогенезе послеродового эндометрита.
4.1. Особенности микробиоценоза у беременных высокой степени инфекционного риска.
3 4.2 Экспрессия мРНК TLR 1, TLR 2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у пациенток высокой степени инфекционного риска на сроке 75
4.2.1. Экспрессия мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у беременных высокой степени инфекционного риска на сроке гестации 38-41 нед.
4.2.2. Экспрессия мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов женщин I и II групп в послеродовом 78 периоде.
4.3. Прогнозирование гнойно-септических заболеваний в послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии TLR 86
Обсуждение результатов исследования 90
Выводы 103
Практические рекомендации 1 05
Список литературы
- Послеродовый эндометрит: современные аспекты этиологии и патогенеза
- Роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений
- Бактериоскопическое и бактериологическое исследование
- Экспрессия мРНК TLR 1, TLR 2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у пациенток высокой степени инфекционного риска на сроке
Послеродовый эндометрит: современные аспекты этиологии и патогенеза
Послеродовый эндометрит – это воспаление слизистой оболочки матки, возникающее в послеродовом периоде. Данное осложнение пуэрперия следует считать проявлением раневой инфекции в связи с тем, что внутренняя поверхность матки после отделения последа представляет собой обширную рану. В большинстве случаев, причиной эндометрита является активация собственной условно-патогенной флоры, в частности, восходящая инфекция влагалища, частота которой в популяции варьирует от 15 до 30% [6,16, 81, 86, 105, 108]. По классификации послеродовых инфекционных заболеваний С.В.Сазоноваи А.В.Бартельса [1973], послеродовый эндометрит - это первый этап развития послеродовых гнойно септических заболеваний, при котором инфекция ограничивается областью родовой раны. Послеродовый эндометрит - это начальное локализованное проявление динамически развивающегося септического процесса. В структуре гнойно-воспалительных заболеваний пуэрперия послеродовый эндометрит наблюдается более чем в 40% случаев и сохраняет лидирующее положение [16,71, 108, 213]. После нормальных родов частота послеродового эндометрита достигает 7-8% по данным А.Н. Стрижакова (2009) и 3-8% по данным В.Н. Серова (2011) [48, 103]. После патологических родов этот показатель возрастает до 10-20% [72, 78, 211]. По данным В.И.Краснопольского с соавт. (2013), в сравнении с родами через естественные родовые пути вероятность развития эндометрита после кесарева сечения увеличивается в несколько раз [56). Проблема послеродового эндометрита является актуальной не только в связи с большой распространенностью и экономическими потерями. Существует высокий риск возникновения репродуктивных осложнений, вплоть до полной утраты генеративной функции [56]. При прогрессировании воспалительного процесса эндометрит может приводить к развитию осложнений - несостоятельности швов на матке, пельвиоперитонита, перитонита, тазового тромбофлебита, инфекционно-токсического шока, сепсиса, что в свою очередь ухудшает показатели материнской и заболеваемости и смертности [56, 179]. Однако в настоящее время в ранней диагностике послеродового эндометрита имеют место значительные сложности. Происходит видоизменение клинической симптоматики в сторону стертых и атипичных форм, что приводит зачастую к поздней диагностике и запоздалому началу лечения[6, 68]. Так, отличительными особенностями клинической картины послеродового эндометрита в последние годы являются его поздняя манифестация, несоответствие общей реакции организма и степени тяжести местного патологического процесса [6, 46, 56, 80]. По утверждению Кучеренко М.А. (2011), наиболее частыми клиническими проявлениями эндометрита в настоящее время являются субинволюция матки и патологический характер лохий [60].
Достаточно актуальной проблемой инволюции матки в пуэрперии является нарушение её сократительной деятельности. Субинволюция матки в современном акушерстве не имеет однозначного определения. Некоторые авторы рассматривают данное осложнение как предстадию эндометрита [15, 119]. По данным В.Е Радзинского (2011), субинволюция матки является завуалированной формой эндометрита [92]. Имеются публикации, где рассматривают это осложнение как эндометрит, протекающий бессимптомно [77, 110,].
Кроме того, диагноз «субинволюция матки» не отражает состояние родильницы, это приводит к повторному поступлению женщины в стационар, неадекватному и несвоевременному лечению пуэрперальных осложнений. Связано это с тем, что нередко субинволюция матки служит единственным симптомом, предшествующим клиническим проявлениям «отсроченного» эндометрита и сепсиса [108]. Такое течение заболевания приводит к запоздалой диагностике, несвоевременному началу лечения и генерализации процесса [3]. Классические симптомы послеродового эндометрита, такие как нарушение общего самочувствия, лихорадка, лейкоцитоз, лимфопения, встречаются в настоящее время менее чем у половины родильниц [6, 56].
По мнению других авторов, рост числа стертых форм эндометрита происходит в связи с внедрением в акушерскую практику значительного арсенала профилактических средств. Прогрессивно растёт количество нозокомиальных штаммов микроорганизмов [5, 44, 75].
Возбудителями послеродового эндометрита в большинстве случаев являются условно-патогенные микроорганизмы [6, 185]. Очевидна тенденция к постоянному изменению видового состава микробной флоры с возникновением агрессивных и антибиотикоустойчивых форм бактериальной инфекции [90, 162, 209].
Широкое использование в клинической практике превентивного введения антибактериальных препаратов привело не к снижению частоты послеродовых осложнений, а к возникновению резистентных штаммов бактерий [89].
По данным других авторов, у пациенток, не получавших агрессивную антибиотикотерапию, частота развития послеродовых инфекционно-воспалительных заболеваний не превышает таковую в популяции [92]. В формировании послеродового эндометрита важным фактором является его полимикробная этиология. В настоящее время ведущая роль принадлежит ассоциации аэробных и анаэробных неспорообразующих условно-патогенных микроорганизмов (80—90%),которые составляют нормальную микрофлору половых путей у женщин [84, 120].
Роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений
Рядом авторов описана роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе самопроизвольных выкидышей ранних сроков. Так, invitro было установлено, что активация TLR5 в клетках эндометрия препятствует адгезии трофобласта [206]. Было показано, что к такому же эффекту приводит стимуляция белка сигнального пути TLR NF-kB [146]. Invivo на модели животных было выявлено, что активация гетеродимеров TLR1/TLR2 или TLR2/TLR6 приводит к индукции воспалительного ответа, что является причиной невынашивания беременности [130]. В то же время, V. Abrahamsetal (2008) установили, что TLR6, напротив, обладает протективным действием, переключая иммунный ответ c индукции апоптоза трофобласта на синтез провоспалительных цитокинов, что способствует элиминации патогенных микроорганизмов [220]. Стимуляция TLR 3 полицитидиловой кислотой во время беременности у нормальной линии мышей приводит к ее прерыванию на ранних сроках [222].
Существуют работы, свидетельствующие о ведущей роли активации TLR в патогенезе преждевременных родов [172]. Также было показано, что в случае преждевременных родов c развитием хорионамнионита в плаценте и децидуальной оболочке наблюдается повышенная экспрессия TLR2 и TLR4. На основании этого было предложено определять экспрессию TLR2 в качестве маркера преждевременных родов [99].
Человеческая плацента экспрессирует все типы TLR, при этом наблюдается увеличение уровней TLR 2 и TLR 5 перед родами. Интересно, что способность TLR4 реагировать на липополисахариды, выражающаяся в достоверно большем синтезе фактора некроза опухоли-, наблюдалась в плацентарной ткани, полученной у пациенток, родивших самостоятельно, по сравнению с группой женщин после кесарева сечения [159]. По-видимому, этот факт может иметь значение в патогенезе послеродовых эндометритов, которые чаще встречаются после оперативных родов.
Исследований, касающихся роли TLR в развитии послеродовых гнойно-септических заболеваний у женщин, не проводилось. Есть доказательства роли TLR в патогенезе послеродового эндометрита у коров. При введении липополисахаридов грамотрицательных бактерий в полость послеродовой матки наблюдалось увеличение продукции провоспалительных цитокинов и простагландинов, на основании чего авторы делают вывод о том, что данные изменения являются TLR 4 - опосредованными. Так как под влиянием прогестерона и эстриола продукция простагландинов, вызванная липополисахаридами, снижалась, можно предположить, что экспрессия TLR4 зависит от концентрации половых гормонов [150, 160]. Аналогичный эффект наблюдался при введении липопептидов грамположительных бактерий, что свидетельствует о вовлечении в иммунный ответ TLR 1, TLR 2 и TLR 6 [214].
Известно, что активация системы врожденного иммунитета влечет за собой запуск других биохимических процессов, в частности, антиоксидантной системы [137]. Антиоксидантная система осуществляет защиту от оксидативного стресса, обеспечивает защиту от свободных радикалов, тем самым влияя на тяжесть воспалительного процесса и степень деструкции тканей. Наиболее распространенной классификацией на сегодняшний день является деление антиоксидантной системы на основании каталитической активности антиоксидантов, т.е. на ферментативные и неферментативные [51, 202,210]. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенной формы активных форм кислорода, специфичностью клеточной и органной локализации и использованием в качестве катализаторов металлов (Cu, Zn, Mn, Fe, Se).
Представителями этой системы являются супероксиддисмутаза (SOD), каталаза, глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза, и все ферменты аскорбат-глутатионового цикла, а также трансферазы. Неферментативная система защиты представлена соединениями-антиоксидантами, такими как каротиноиды, аскорбиновая кислота, восстановленный глутатион, -токоферол, флавоноиды и др. Все эти соединения способны с помощью ферментов или не используя последние нейтрализовать активные формы кислорода.
Наиболее важными ферментами антиоксидантной системы являются супероксиддисмутаза и каталаза. Супероксиддисмутаза (SOD) – это фермент, катализирующий превращение супероксида в кислород и перекись водорода. Существует 3 типа SOD – цитоплазматическая (SOD1), митохондриальная (SOD2) и внеклеточная (SOD3). Супероксиддисмутаза обладает самой высокой известной каталитической скоростью реакции из всех известных ферментов с антиоксидантной активностью [143]. Каталаза является ферментом, катализирующим разложение перекиси водорода на воду и кислород [227].
Снижение активности антиоксидантных ферментов приводит к повышенной деструкции тканей и также может играть роль в патогенезе послеродового эндометрита.
Таким образом, ранняя диагностика и прогнозирование послеродового эндометрита на доклинической стадии не может базироваться только на данных объективного обследования и результатах бактериологического, бактериоскопического методов исследования. Необходим поиск и разработка новых высокоинформативных и прогностически значимых критериев прогноза и ранней диагностики гнойно-воспалительных послеродовых заболеваний с учётом иммунореактивности организма.
Так как послеродовый эндометрит в большинстве случаев возникает в результате активации собственной условно-патогенной флоры, наибольший интерес представляет изучение роли TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 распознающих бактериальные лиганды. Отсутствие в отечественной и зарубежной литературе данных о роли TLR в патогенезе послеродового эндометрита и возможностей их использования в качестве прогностических маркеров послеродовых гнойно-септических осложнений определило необходимость проведения этого исследования.
Бактериоскопическое и бактериологическое исследование
На основании проведенного исследования экспрессии мРНК TLR, белков их сигнального пути, а так же антиоксидантных ферментов, были выявлены следующие закономерности: - экспрессия мРНК TLR 1, TLR 2, TLR 4 и TLR 5 в поздние сроки гестации (39-41 нед.) у беременных с развившимся впоследствии эндометритом, была аналогична таковой у родильниц с послеродовым эндометритом, обследованных на 3 сутки послеродового периода; -экспрессия мРНК TLR 1 и TLR2 в поздние сроки гестации (39-41 нед.) у беременных с развившимся впоследствии эндометритом, и у родильниц с послеродовым эндометритом, обследованных на 3 сутки пуэрперия, достоверных различий не имела, при этом в поздние сроки гестации (39-41 нед.) уровень экспрессии мРНК TLR1 был незначительно ниже, а TLR2 – незначительно выше, чем в послеродовом периоде; - в группе с развившимся послеродовым эндометритом имело место достоверное снижение экспрессии мРНК TLR 4, TLR 5 и белка их сигнального пути NF-kB как во время беременности (39-41 нед.), так и на 3 сутки пуэрперия; - снижение экспрессии мРНК TLR4 и TLR5 и белка их сигнального пути NF-kB сопровождалось снижением экспрессии мРНК антиоксидантного фермента - внеклеточной супероксиддисмутазы 3.
При неосложнённом течении послеродового периода отмечена высокая корреляционная связь NF-kB с мРНК TLR1, а также умеренная корреляционная связь TLR2 и TLR4. Уровень экспрессии супероксиддисмутазы имела высоко значимую корреляцию с TLR4, TLR5 и отрицательную корреляцию с уровнем TLR2. Уровень каталазы имел высокую корреляционную связь с экспрессией TLR4, а также умеренную связь с уровнями TLR1.
При эндометрите выявлена высокая корреляционная связь между мРНК TLR1 и TLR2, мРНК TLR1 и NF-kB, мРНК TLR4 и TLR5, однако отсутствовала значимая корреляция между экспрессией мРНК TLR4 и TLR5 и NF-kB. Уровень супероксиддисмутазы при эндометрите имел высокую корреляционную связь с уровнями TLR4, TLR5 и MyD88. Таким образом, снижение экспрессии мРНК TLR4, TLR5 и белка их сигнального пути NF-kBу беременных высокой степени инфекционного риска в поздние сроки гестации (39-41 нед.), является прогностически значимым фактором риска развития послеродового эндомерита. Кроме того, снижение экспрессии мРНК антиоксидантного фермента - внеклеточной супероксиддисмутазы 3 так же может указывать на участие её в развитии послеродового эндометрита.
Прогнозирование гнойно-септических заболеваний в послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии Толл-подобных рецепторов.
Следующей задачей исследования являлась разработка способа прогнозирования и ранней диагностики гнойно-септических заболеваний на поздних сроках беременности и послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии TLR, пригодного для применения в условиях стационара.
Техническим результатом использования данного способа явилось получение критериев оценки риска развития послеродового эндометрита. Это позволит определить клинический прогноз, тактику ведения женщины в послеродовом периоде, а так же снизить экономические затраты за счет уменьшения количества койко-дней пребывания и лечения пациенток в послеродовом отделении.
В главе 4.2 было показано, что у пациенток с послеродовым эндометритом наблюдается снижение экспрессии мРНК сигнальных рецепторов врожденного иммунитета, в частности, TLR 4, TLR 5 и NF-kB. Такая же закономерность прослеживалась и у пациенток на поздних сроках беременности. Следовательно, экспрессию мРНК TLR 4, TLR 5 и NF-kB на поздних сроках беременности можно использовать для прогноза развития послеродового эндометрита.
В соответствии с поставленной задачей был разработан алгоритм прогнозирования развития послеродового эндометрита, включающий: -cбор клеток эпителия цервикального канала у женщин на поздних сроках беременности (38-41нед.) в женских консультациях, при поступлении в акушерский стационар с помощью цитощетки; -выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала; -обратную транскрипцию с получением кДНК; -количественную полимеразную цепную реакцию; -прогнозирование развития послеродового эндометрита на оcновании снижения экспрессии TLR 4, TLR 5 и NF-kB ниже нормальных значений; -назначение антибактериальной терапии с учётом чувствительности микрофлоры сразу после родоразрешения.
Способ прогноза и ранней диагностики основан на определении изменения экспрессии и NF-kB в эпителии цервикального канала шейки матки. Снижение местной иммунореактивности, определяемое по снижению экспрессии вышеуказанных факторов, обеспечивает активацию собственной условно-патогенной флоры, а также приводит к увеличению бактериальной обсемененности половых путей, что в свою очередь приводит к развитию эндометрита.
Новизна способа заключается в том, что в настоящее время не имеется возможности прогнозирования послеродового эндометрита на основании определения экспрессии TLR 4,TLR5 и нуклеарного фактора-kB. Предлагаемый способ прогноза развития послеродового эндометритадостаточно прост в исполнении, выполняется на стандартном оборудовании, с использованием имеющихся в клинической практике и широко используемых методиках (табл. №20).
Экспрессия мРНК TLR 1, TLR 2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у пациенток высокой степени инфекционного риска на сроке
В настоящее время ведется дискуссия о причинах, способствующих снижению экспрессии TLR. Одной из вероятных причин этого явления считают длительное воздействие на TLR бактериальных эндотоксинов. Так, в ряде исследований было описано отсутствие иммунного ответа у моноцитов и нейтрофилов при длительной экспозиции эндотоксинов и показано, что этот механизм реализуется через систему сигнальных рецепторов [154, 157, 190]. Этот феномен носит название «эндотоксиновой толерантности». Кроме того, было показано, что нарушение экспрессии TLR способствует хронизации любых инфекционных процессов [216]. Напротив, у пациентов с циррозом печени исходно сниженный уровень TLR4 восстанавливается при терапии антибиотиками [156], что косвенно подтверждает эту гипотезу.
Было также проведено исследование экспрессии мРНК антиоксидантных ферментов каталазы и супероксиддисмутазы и их взаимосвязи с экспрессией образраспознающих рецепторов врожденного иммунитета.
Выявлено, что у пациенток с послеродовым эндометритом наблюдалось достоверное снижение уровня экспрессии мРНК супероксиддисмутазы, имея при этом высокую корреляционную связь с уровнями TLR4, TLR5 и MyD88. Уровень экспрессии мРНК каталазы достоверно не изменялся.
Полученные результаты соотносятся с исследованиями, проведенными на животных. Так, в эксперментах на грызунах и приматах было показано, что индуцированная флагеллином экспрессия TLR5 ассоциирована с гранулоцитопоэзом и антиапоптозным эффектом супероксиддисмутазы [137]. По этой же причине агонист TLR5 флагеллин способствует уменьшению деструкции почечной ткани при острой почечной недостаточности [129]. 100 Результаты нашего исследования показали, что у родильниц с послеродовым эндометритом наблюдается значительное снижение уровней TLR4 и TLR5, а также белков MyD88 и NF-kB, являющихся сигнальными путями от вышеуказанных рецепторов. Данная закономерность определяется и у беременных с высокой степенью риска развития послеродовых гнойно септических заболеваний. Кроме того, у родильниц с послеродовым эндометритом наблюдается значительное снижение уровня супероксиддисмутазы, являющейся ферментом антиоксидантной системы и препятствующей развитию деструкции тканей в результате воспаления. Стимуляция экспрессии TLR5 приводит к увеличению продукции супероксиддисмутазы и защите тканей от деструкции активными кислородными радикалами. По-видимому, снижение экспрессии TLR4 и TLR5 является одним из основных механизмов развития послеродового эндометрита. Так как для передачи сигнала с TLR4 и TLR5 служит MyD88-зависимый путь, то снижение уровня MyD88 и NF-kB у этих пациенток является закономерным. Снижение экспрессии NF-kB, по-видимому, приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов на поверхности слизистых, что может способствовать инвазии возбудителя даже при небольшом количестве патогена.
Таким образом, не всегда на основании клинических, лабораторных, бактериоскопических данных, результатах бактериологических исследований можно спрогнозировать развитие послеродового эндометрита.
Такие клинические проявления эндометрита как нарушение общего самочувствия, гипертермия, лейкоцитоз, ускорение СОЭ, а также болезненность матки и изменение её консистенции при бимануальном исследовании, согласующиеся с литературными данными, являются несомненными, но присутствующими далеко не в каждом случае эндометрита. Кроме того, субинволюция матки и патологический характер лохий, являющиеся в настоящее время, по данным некоторых авторов, 101 типичным признаком эндометрита, приводит к запоздалой диагностике этого осложнения[6,46,56,80].
Развитие послеродового эндометрита иногда не связано с наличием условно патогенных микроорганизмов или высокой бактериальной обсеменённостью. Степень обсемененности может не коррелировать с риском развития инфекционного процесса[6,10,104,174].
Поэтому, учитывая полученную закономерность снижения уровней TLR4, TLR5 и NF-kB у пациенток с эндометритом, как на поздних сроках гестации (38-41 нед), так и в послеродовом периоде, мы пришли к заключению, что развитие послеродового эндометрита обусловлено состоянием местного врожденного иммунитета. Снижение экспрессии TLR4, TLR5, NF-kB и антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы являются прогностически значимыми и могут быть использованы в поздние (38-41нед) сроки гестации. У пациенток с низкой экспрессией вышеуказанных факторов, выявленной на сроке гестации 38-41 неделя целесообразно назначение антибактериальной терапии. В связи с отсутствием возможности проведения полноценного курса терапии во время беременности лечение следует начинать с первых суток послеродового периода, принимая во внимание данные бактериологического исследования с определением антибиотикочувствительности.
Для этого был разработан и предложен способ индивидуального прогнозирования и ранней диагностики послеродового эндометрита на основании определения маркёров местного врожденного иммунитета у беременных и родильниц высокой степени риска развития гнойно-септических осложнений. Данный способ индивидуален, малоинвазивен, не требует больших затрат времени, прост в исполнении, высокоинформативен, и поэтому доступен в стационарах высокого риска.
Предложенный метод, заключающийся в определении экспрессии TLR4 и TLR5 в эпителии цервикального канала, позволит прогнозировать развитие послеродовых гнойно-воспалительных осложнений и 102 совершенствовать профилактику септического процесса. Разработанный алгоритм прогнозирования и ранней диагностики послеродового эндометрита, начиная с поздних сроков беременности (38-41 нед), позволяет повысить эффективность прогнозирования послеродового эндометрита в 2,7 раза (на 43,3%) и его раннюю диагностику в 3,4 раза (на 58,3%),что в свою очередь и дает возможность своевременного начала лечения этого осложнения пуэрперия.
![Ранняя диагностика эндометрита у родильниц и гнойно-воспалительных осложнений у новорожденных [Электронный ресурс]](/i/i/4360/211943.png "Ранняя диагностика эндометрита у родильниц и гнойно-воспалительных осложнений у новорожденных [Электронный ресурс] Балданова Бэлигма Дандаровна")
