Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Послеродовые гнойно-септические заболевания и система врожденного иммунитета. обзор литературы
1.1. Послеродовые гнойно-септические осложнения как одна из главных проблем современного акушерства 12
1.2. Послеродовый эндометрит: современные аспекты этиологии и патогенеза 16
1.3. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета как первая линия распознавания патогенов 29
1.4. Роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений 35
Глава 2. Материалы и методы 4 4
2.1. Объект исследования. 44
2.2. Клиническое обследование и сбор материала 46
2.3. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование 48
2.4. Количественная ПЦР 50
2.5. Статистическая обработка результатов 52
Результаты собственных исследований
Глава 3. Социально-биологический статус женщин с послеродовыми гнойно-септическими заболеваниями.
Глава 4. Антиинфекционная защита репродуктивного тракта женщины и её роль в патогенезе послеродового эндометрита .
4.1. Особенности микробиоценоза у беременных высокой степени инфекционного риска.
3 4.2 Экспрессия мРНК TLR 1, TLR 2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у пациенток высокой степени инфекционного риска на сроке 75
гестации 38-41нед и в послеродовом периоде.
4.2.1. Экспрессия мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у беременных высокой степени 75 инфекционного риска на сроке гестации 38-41 нед .
4.2.2. Экспрессия мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов женщин I и II групп в послеродовом 78 периоде.
4.3. Прогнозирование гнойно-септических заболеваний в послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии TLR 86
Обсуждение результатов исследования 90
Выводы 103
Практические рекомендации 1 05
Список литературы
- Послеродовый эндометрит: современные аспекты этиологии и патогенеза
- Роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений
- Бактериоскопическое и бактериологическое исследование
- Экспрессия мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у беременных высокой степени 75 инфекционного риска на сроке гестации 38-41 нед
Послеродовый эндометрит: современные аспекты этиологии и патогенеза
Снижение материнской заболеваемости и смертности в период с 2000 по 2015год является одной из важнейших задач международного сообщества (Резолюция 55 Генеральной Ассамблеи Организации Объединенных Наций, 2000). По данным Всемирной организации здравоохранения, одно из значимых мест среди причин материнской смертности в мире занимают послеродовые гнойно-воспалительные осложнения [226]. Несмотря на использование огромного арсенала медикаментозных средств, в последние десятилетия частота ГСЗ послеродового периода составляет от 5% до 20% [103] и остаётся одной из актуальных проблем современного акушерства [59].
Ежегодно в мире от септических акушерских осложнений умирает 150 000 родильниц [6]. Отмечено, что на развивающиеся страны Африки, Азии, Латинской Америки и Карибского бассейна приходится большая часть материнской смертности от послеродовых гнойно-септических заболеваний.
Постоянное совершенствование и внедрение новых диагностических и лечебных технологий позволило существенно снизить, число послеродовых воспалительных заболеваний, количество тяжелых форм и летальность от них [58,104], однако, гнойно-септические заболевания пуэрперия остаются нерешённой проблемой в современном акушерстве и занимают в настоящее время четвертое место в структуре материнской заболеваемости и смертности [6,92,53,142].В развитых странах на 1000 родов приходится 0,1 13 0,6 случая послеродовых септических осложнений [186]. Немаловажен тот факт, что как в развитых, так и в развивающихся странах послеродовые гнойно-септические осложнения являются значимой причиной развития тяжелой полиорганной недостаточности у едва не умерших женщин – near-missed women [61, 192, 57, 69, Claire E.etal., 2013]. Инфекция была, есть и будет главным бичом беременности, родов и послеродового периода [92].
Последствия перенесенных гнойно-воспалительных заболеваний представляют опасность для репродуктивного здоровья женщины, являясь впоследствии причиной бесплодия, невынашивания беременности, эктопической беременности [56]. Формирование у родильниц таких гнойных осложнений, как пельвиоперитонит, инфекционно-токсический шок, тазовый тромбофлебит, сепсис, септический эндокардит, является следствием прогрессирующего метроэндометрита [55, 94, 179, 199,142]. Акушерский перитонит, сепсис, развившиеся на фоне послеродового эндометрита и являющиеся показанием для пангистерэктомии, приводят к окончательной утрате женщиной репродуктивной функции [56, 141]. Осложнения эндометрита, приводящие к генерализации послеродовой инфекции, являются одной из главных причин материнской смертности в послеродовом периоде [6, 17, 20, 55, 58, 72, 185].
Немаловажен и тот факт, что каждый случай послеродового эндометрита требует стационарного лечения. Это не только отражается на эмоциональном состоянии женщины, способствует снижению или прекращению лактации, но и требует больших экономических затрат на лечение в стационаре [42, 126].
В Российской Федерации послеродовые гнойно-воспалительные заболевания в структуре материнской смертности составляют 12% среди всех ее причин [104, 121], а среди факторов материнской смертности после самопроизвольных родов – 26% , несмотря на постоянное совершенствование методик и использование современных технологий в ведении беременности, родов, послеродового периода, проведение антибиотикопрофилактики [87, 187]. По данным Серова В.Н. и соавт. [72], частота послеродового эндометрита у родильниц составляет 3-8% после самопроизвольных родов и 10-20% после кесарева сечения. Вариабельность статистических данных частоты ГСЗ послеродового периода свидетельствуют об отсутствии единой схемы постановки диагноза и определения критериев гнойного осложнения, при наличии которых можно было бы четко дифференцировать стертую и классическую формы ПЭ. Значимость проблемы послеродовых гнойно-воспалительных заболеваний связана с низким социально-экономическим статусом, увеличением частоты оперативного родоразрешения путём кесарева сечения, селекцией нозокомиальных штаммов микроорганизмов с поливалентной устойчивостью, ростом экстрагенитальной патологии у беременных и родильниц[6,9, 207, 213].
Увеличение числа кесаревых сечений в среднем на 1% в год привело к относительному снижению перинатальных потерь [6]. Однако некоторые авторы считают бездоказательной прямую корреляционную зависимость частоты кесарева сечения и перинатальной смертности [54]. Вместе с тем [20, 200] отмечают, что с расширением показаний к КС увеличивается частота и тяжесть послеродовых гнойно-септических заболеваний [20, 200]. Так, несмотря на прогресс в технике операции: применение поперечного разреза в нижнем сегменте матки, широкое использование синтетического шовного материала, совершенствование методов наложения шва на матку, профилактическое назначение антибактериальных препаратов широкого спектра действия, число гнойно-воспалительных заболеваний в раннем послеоперационном периоде и в отдаленные сроки после кесарева сечения остается значимым, достигая 3,3—54,3% и зависит от уровня инфекционного риска [6, 77, 104,185]. У женщин с высоким инфекционным риском этот показатель достигает 85 % [6]. При этом причиной развития послеродового эндометрита гораздо чаще является экстренное кесарево сечение [56, 58, 207].
Роль Толл-подобных рецепторов в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений
Всем обследуемым проводилось анкетирование согласно специально разработанному опроснику (приложение 1), данные лабораторных и инструментальных методов исследования вносили в анкету путем выкопировки из обменной карты и истории родов.
Всем женщинам проводилось общеклиническое обследование. Общий анализ крови исследовали на автоматическом гематологическом анализаторе «LH 500», общий анализ мочи – на анализаторе мочи «Uriscanpro», биохимический анализ крови (общий белок, билирубин и его фракции, АЛТ, АСТ, мочевина, креатинин) – на биохимическом анализаторе «Olympus AU 640»,исследование коагулограммы. Эхографическое исследование и допплерометрия были выполнены на аппарате «ESAOTEMyLab 20» (Нидерланды). При проведении ультразвукового исследования в послеродовом периоде на 3 сутки от момента родоразрешения оценивалась длина, ширина, саггитальный размер матки, переднезадний размер полости матки, а так же наличие в её полости наличие тех или иных патологических включений. Гистологическое исследование плаценты проводилось в ОГКУЗ «Белгородском патологоанатомическом бюро», отделении детской патологии.
Для вынесения патоморфологического заключения проводилось макроскопическое и микроскопическое исследование препаратов плаценты, оболочек, остатка пуповины. Критериями отбора в исследуемые группы служило выявление при микроскопическом исследовании интенсивной лейкоцитарной инфильтрации, охватывающей все слои плодных оболочек, диффузными (серозный хориодецидуит) или крупноочаговыми (гнойный амниохориодецидуит) скоплениями полиморфноядерных лейкоцитов. Поражения децидуальной оболочки учитывались как изолированно, так и с вовлечением в воспалительный процесс других отделов последа с более глубокими деструктивными изменениями дистрофического и циркуляторного характера.
Материалом для определения экспрессии TLR 1, TLR 2, TLR 4 и TLR 5 с целью диагностики послеродовых гнойно-септических заболеваний являлись клетки эпителия цервикального канала.
Сбор материала производили на доношенном сроке беременности и на 3 сутки послеродового периода. Шейку матки обнажали в зеркалах, стерильным тампоном удаляли слизь и лохии из цервикального канала. Затем с помощью цитощетки производили забор материала в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл., содержащую 500 мкл. консервирующей среды RNAlater (Ambion, США).
После помещения материала в раствор RNAlater пробирки оставляли в холодильнике при температуре +4С на 1 сутки, затем помещали в морозильную камеру и в дальнейшем хранили при температуре – 28 С. Исследование выполнялось согласно инструкции производителя.
Сбор материала из цервикального канала для бактериологического исследования производили стерильным тампоном после удаления цервикальной слизи. Тампоны помещали в угольную транспортировочную среду Amies («NuovaAptaka», Италия). Преимущество этой среды заключается в том, что в ней глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, а метиленовый синий - фармакологическим активированным углем. Увеличенное количество кальция и магния поддерживает проницаемость клеточной мембраны. Среда поддерживает жизнедеятельность таких микроорганизмов, как Trichomonas sp., Neisseria sp., Haemophilus sp., Corinebacteriа sp., Streptococсus, Enterobacteriaceae и др. У каждой пациентки материал собирали в 2 пробирки – одну помещали ванаэростат Becton DickinsonGasPak - 100, снабженный газогенераторными пакетами. В дальнейшем из этой пробирки выделяли анаэробные микроорганизмы. Из второй пробирки делали посев на среды для выявления аэробных микроорганизмов. Полученный материал в течение часа транспортировали в бактериологическую лабораторию.
Бактериоскопическое и бактериологическое исследование Бактериоскопическое и бактериологическое исследование проводилось в бактериологической лаборатории Белгородской ОКБ Святителя Иоасафа (заведующая лабораторией Тафинцева Г.А.).
Бактериоскопическое исследование содержимого влагалища и цервикального канала проводили после окрашивания мазков по Граму.
Для верификации видов аэробных и анаэробных микроорганизмов был использован бактериологический метод исследования в соответствии с методикой действующего Приказа МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 и методическими рекомендациями Б.А. Ефимова с соавт. (2002) [36].
Подсчет колониеобразующих единиц производили по методу Коха [37]. Аэробные микроорганизмы культивировали в суховоздушном термостате ТВ-80-1 («Касимовский завод», Россия). Исследование анаэробных микроорганизмов проводили проводили в бескислородных условиях в термостате - анаэростате MCO-15AC («Sanyo», Япония). Посев аэробных микроорганизмов первоначально производили на 5% кровяной агар с последующим отсевом на селективные среды. Для выделения энтерококков использовали селективный Bileesculinazidagar, позволяющий дифференцировать их от других стрептококков на основании его способности расти в присутствии желчи.
Для выделения стафилококков применяли желточно-солевой агар Staphylococcusagar. Дифференциальную диагностику между эпидермальным и золотистым стафилококком проводили на основании способности последнего к плазмокоагуляции.
Для обнаружения кишечной палочки производили посев на среду Эндо. Культивирование энтеробактерий, клебсиеллы, протея, синегнойной палочки проводили на среде MacConkey с последующей микроскопической идентификацией и верификацией на основании определения оксидазной, каталазной, лецитиназной активности.
Лактобактерии культивировали на среде MRS, на которой они росли в виде белых гладких или шероховатых колоний и не обладали оксидазой и каталазой активностью. Бифидобактерии высевались на твердой среде Блаурокка в течение 72 часов. Они имели типичный вид «куриной косточки» при бактериоскопическом исследовании колоний. Для обнаружения грамположительных спорообразующих клостридий посевы проводили на среду Columbiaagarebase с добавлением 5% крови и 24-х часовой анаэробной инкубацией. Бактероиды высевали на селетивной среде Bacteroides Bileesculinagar.
Бактериоскопическое и бактериологическое исследование
На основании проведенного исследования экспрессии мРНК TLR, белков их сигнального пути, а так же антиоксидантных ферментов, были выявлены следующие закономерности: - экспрессия мРНК TLR 1, TLR 2, TLR 4 и TLR 5 в поздние сроки гестации (39-41 нед.) у беременных с развившимся впоследствии эндометритом, была аналогична таковой у родильниц с послеродовым эндометритом, обследованных на 3 сутки послеродового периода; -экспрессия мРНК TLR 1 и TLR2 в поздние сроки гестации (39-41 нед.) у беременных с развившимся впоследствии эндометритом, и у родильниц с послеродовым эндометритом, обследованных на 3 сутки пуэрперия, достоверных различий не имела, при этом в поздние сроки гестации (39-41 нед.) уровень экспрессии мРНК TLR1 был незначительно ниже, а TLR2 – незначительно выше, чем в послеродовом периоде; - в группе с развившимся послеродовым эндометритом имело место достоверное снижение экспрессии мРНК TLR 4, TLR 5 и белка их сигнального пути NF-kB как во время беременности (39-41 нед.), так и на 3 сутки пуэрперия; - снижение экспрессии мРНК TLR4 и TLR5 и белка их сигнального пути NF-kB сопровождалось снижением экспрессии мРНК антиоксидантного фермента - внеклеточной супероксиддисмутазы 3.
При неосложнённом течении послеродового периода отмечена высокая корреляционная связь NF-kB с мРНК TLR1, а также умеренная корреляционная связь TLR2 и TLR4. Уровень экспрессии супероксиддисмутазы имела высоко значимую корреляцию с TLR4, TLR5 и отрицательную корреляцию с уровнем TLR2. Уровень каталазы имел высокую корреляционную связь с экспрессией TLR4, а также умеренную связь с уровнями TLR1.
При эндометрите выявлена высокая корреляционная связь между мРНК TLR1 и TLR2, мРНК TLR1 и NF-kB, мРНК TLR4 и TLR5, однако отсутствовала значимая корреляция между экспрессией мРНК TLR4 и TLR5 и NF-kB. Уровень супероксиддисмутазы при эндометрите имел высокую корреляционную связь с уровнями TLR4, TLR5 и MyD88. Таким образом, снижение экспрессии мРНК TLR4, TLR5 и белка их сигнального пути NF-kBу беременных высокой степени инфекционного риска в поздние сроки гестации (39-41 нед.), является прогностически значимым фактором риска развития послеродового эндомерита. Кроме того, снижение экспрессии мРНК антиоксидантного фермента - внеклеточной супероксиддисмутазы 3 так же может указывать на участие её в развитии послеродового эндометрита.
Прогнозирование гнойно-септических заболеваний в послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии Толл-подобных рецепторов.
Следующей задачей исследования являлась разработка способа прогнозирования и ранней диагностики гнойно-септических заболеваний на поздних сроках беременности и послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии TLR, пригодного для применения в условиях стационара.
Техническим результатом использования данного способа явилось получение критериев оценки риска развития послеродового эндометрита. Это позволит определить клинический прогноз, тактику ведения женщины в послеродовом периоде, а так же снизить экономические затраты за счет уменьшения количества койко-дней пребывания и лечения пациенток в послеродовом отделении.
В главе 4.2 было показано, что у пациенток с послеродовым эндометритом наблюдается снижение экспрессии мРНК сигнальных рецепторов врожденного иммунитета, в частности, TLR 4, TLR 5 и NF-kB. Такая же закономерность прослеживалась и у пациенток на поздних сроках беременности. Следовательно, экспрессию мРНК TLR 4, TLR 5 и NF-kB на поздних сроках беременности можно использовать для прогноза развития послеродового эндометрита.
В соответствии с поставленной задачей был разработан алгоритм прогнозирования развития послеродового эндометрита, включающий: -cбор клеток эпителия цервикального канала у женщин на поздних сроках беременности (38-41нед.) в женских консультациях, при поступлении в акушерский стационар с помощью цитощетки; -выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала; -обратную транскрипцию с получением кДНК; -количественную полимеразную цепную реакцию; -прогнозирование развития послеродового эндометрита на оcновании снижения экспрессии TLR 4, TLR 5 и NF-kB ниже нормальных значений; -назначение антибактериальной терапии с учётом чувствительности микрофлоры сразу после родоразрешения.
Способ прогноза и ранней диагностики основан на определении изменения экспрессии и NF-kB в эпителии цервикального канала шейки матки. Снижение местной иммунореактивности, определяемое по снижению экспрессии вышеуказанных факторов, обеспечивает активацию собственной условно-патогенной флоры, а также приводит к увеличению бактериальной обсемененности половых путей, что в свою очередь приводит к развитию эндометрита.
Новизна способа заключается в том, что в настоящее время не имеется возможности прогнозирования послеродового эндометрита на основании определения экспрессии TLR 4,TLR5 и нуклеарного фактора-kB.
Предлагаемый способ прогноза развития послеродового эндометритадостаточно прост в исполнении, выполняется на стандартном оборудовании, с использованием имеющихся в клинической практике и широко используемых методиках (табл. №20).
Экспрессия мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 и антиоксидантных ферментов у беременных высокой степени 75 инфекционного риска на сроке гестации 38-41 нед
Результаты нашего исследования показали, что у родильниц с послеродовым эндометритом наблюдается значительное снижение уровней TLR4 и TLR5, а также белков MyD88 и NF-kB, являющихся сигнальными путями от вышеуказанных рецепторов. Данная закономерность определяется и у беременных с высокой степенью риска развития послеродовых гнойно септических заболеваний. Кроме того, у родильниц с послеродовым эндометритом наблюдается значительное снижение уровня супероксиддисмутазы, являющейся ферментом антиоксидантной системы и препятствующей развитию деструкции тканей в результате воспаления. Стимуляция экспрессии TLR5 приводит к увеличению продукции супероксиддисмутазы и защите тканей от деструкции активными кислородными радикалами. По-видимому, снижение экспрессии TLR4 и TLR5 является одним из основных механизмов развития послеродового эндометрита. Так как для передачи сигнала с TLR4 и TLR5 служит MyD88-зависимый путь, то снижение уровня MyD88 и NF-kB у этих пациенток является закономерным. Снижение экспрессии NF-kB, по-видимому, приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов на поверхности слизистых, что может способствовать инвазии возбудителя даже при небольшом количестве патогена.
Таким образом, не всегда на основании клинических, лабораторных, бактериоскопических данных, результатах бактериологических исследований можно спрогнозировать развитие послеродового эндометрита.
Такие клинические проявления эндометрита как нарушение общего самочувствия, гипертермия, лейкоцитоз, ускорение СОЭ, а также болезненность матки и изменение её консистенции при бимануальном исследовании, согласующиеся с литературными данными, являются несомненными, но присутствующими далеко не в каждом случае эндометрита. Кроме того, субинволюция матки и патологический характер лохий, являющиеся в настоящее время, по данным некоторых авторов, 101 типичным признаком эндометрита, приводит к запоздалой диагностике этого осложнения[6,46,56,80].
Развитие послеродового эндометрита иногда не связано с наличием условно патогенных микроорганизмов или высокой бактериальной обсеменённостью. Степень обсемененности может не коррелировать с риском развития инфекционного процесса[6,10,104,174].
Поэтому, учитывая полученную закономерность снижения уровней TLR4, TLR5 и NF-kB у пациенток с эндометритом, как на поздних сроках гестации (38-41 нед), так и в послеродовом периоде, мы пришли к заключению, что развитие послеродового эндометрита обусловлено состоянием местного врожденного иммунитета. Снижение экспрессии TLR4, TLR5, NF-kB и антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы являются прогностически значимыми и могут быть использованы в поздние (38-41нед) сроки гестации. У пациенток с низкой экспрессией вышеуказанных факторов, выявленной на сроке гестации 38-41 неделя целесообразно назначение антибактериальной терапии. В связи с отсутствием возможности проведения полноценного курса терапии во время беременности лечение следует начинать с первых суток послеродового периода, принимая во внимание данные бактериологического исследования с определением антибиотикочувствительности.
Для этого был разработан и предложен способ индивидуального прогнозирования и ранней диагностики послеродового эндометрита на основании определения маркёров местного врожденного иммунитета у беременных и родильниц высокой степени риска развития гнойно-септических осложнений. Данный способ индивидуален, малоинвазивен, не требует больших затрат времени, прост в исполнении, высокоинформативен, и поэтому доступен в стационарах высокого риска.
Предложенный метод, заключающийся в определении экспрессии TLR4 и TLR5 в эпителии цервикального канала, позволит прогнозировать развитие послеродовых гнойно-воспалительных осложнений и 102 совершенствовать профилактику септического процесса. Разработанный алгоритм прогнозирования и ранней диагностики послеродового эндометрита, начиная с поздних сроков беременности (38-41 нед), позволяет повысить эффективность прогнозирования послеродового эндометрита в 2,7 раза (на 43,3%) и его раннюю диагностику в 3,4 раза (на 58,3%),что в свою очередь и дает возможность своевременного начала лечения этого осложнения пуэрперия.
![Ранняя диагностика эндометрита у родильниц и гнойно-воспалительных осложнений у новорожденных [Электронный ресурс]](/i/i/4360/211943.png "Ранняя диагностика эндометрита у родильниц и гнойно-воспалительных осложнений у новорожденных [Электронный ресурс] Балданова Бэлигма Дандаровна")
