Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе СЗРП 9
1.2. Иммунологические нарушения на системном и локальном уровнях у беременных женщин с СЗРП 19
1.3. Роль апоптоза в патогенезе СЗРП 22
1.4. Роль плацентарных белков и АФП в патогенезе СЗРП 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Клинические группы наблюдений 38
2.2. Методы исследования ... 39
Глава 3. Клиническая характеристика обследуемых женщин '. 46
Глава 4. Характеристика иммунного апоптоза и его регуляция при синдроме задержки развития плода 73
4.1. Особенности системного апоптоза лимфоцитов в 3 триместре беременности при СЗРП 73
4.2. Параметры апоптоза лимфоцитов лейкоцитарного инфильтрата децидуалыюй оболочки зрелой плаценты при СЗРП 81
4.3. Содержание растворимых факторов, регулирующих апоптоз, в периферической крови при СЗРП 86
4.4. Содержание растворимых факторов, регулирующих апоптоз, в децидуалыюй оболочке зрелой плаценты при СЗРП 92
4.5. Роль АФП в регуляции иммунного апоптоза при СЗРП 99
Глава 5. Содержание специфических плацентарных белков и афп в сыворотке крови у женщин с неосложненнои и осложненной развитием сзрп беременностью 104
5.1. Исследование ТБГ у женщин с нормально протекающей и осложненной развитием СЗРП беременностью 104
5.2. Исследование ПАМГ- 2 у женщин с нормально протекающей и осложненной развитием СЗРП беременностью 110
5.3 Исследование ПАМГ-1 у женщин с нормально протекающей и осложненной развитием СЗРП беременностью 112
5.4. Исследование АФП у женщин с нормально протекающей и осложненной развитием СЗРП беременностью 115
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 118
Выводы 144
Практические рекомендации 146
Список литературы 147
- Современные представления об этиологии и патогенезе СЗРП
- Роль апоптоза в патогенезе СЗРП
- Методы исследования
- Особенности системного апоптоза лимфоцитов в 3 триместре беременности при СЗРП
Введение к работе
Синдром задержки развития плода занимает важное место в структуре перинатальной заболеваемости и смертности и является актуальной проблемой современного акушерства. Этот синдром, по данным разных авторов, встречается от 2,4 - 31,1% случаев (42, 19). Репродуктивные потери и затраты на комплексное лечение детей, рожденных с задержкой развития, причиняют значительный социальный и экономический ущерб.
В развитии синдрома внутриутробной задержки роста плода (СЗРП) большое внимание уделяется роли иммунной системы (69, 104, 31, 33, 43, 47). Установлено, что физиологические реакции, обеспечивающие развитие плода, находятся под контролем иммунных механизмов, которые в большей степени проявляются на локальном уровне (255, 133). Изучается роль апоптоза в развитии СЗРП (117,195,153, 128,179,1 54). Рядом авторов показано, что при СЗРП как на системном, так и на локальном уровнях снижается готовность лимфоцитов к апоптозу (104). Апоптогенный сигнал одновременно активирует сигнальные каскады как гибели, так и выживания клетки (249). Процессы апоптоза тесно связаны с процессами ангиогенеза. Известно, что СЗРП определяется нарушениями ангиогенеза в системе маточію-плацентарного кровообращения (44, 42, 73). Важную роль в плацентарном анпюгенезе играет васкуло-эндотелиальный фактор роста (VEGF). Имеются данные, что с изменением продукции VEGF связано развитие плацентарной недостаточности и СЗРП (Ahmed и Perkins, 2000). Однако в литературе нет единого мнения о характере экспрессии VEGF при СЗРП. Рядом авторов было показано снижение уровня VEGF в плацентах при СЗРП по сравнению с таковыми при неосложненном развитии плода (232, 176). В других исследованиях не отмечалось существенных различий в экспрессии мРНК VEGF и в продукции самого белка в плацентах при неосложненном развитии плода и при СЗРП (194, 176).
Изучение плацентарных белков в крови беременных женщин представля-
ет большую ценность в диагностике нарушений состояний плода (98). Обнаружена связь между низкой концентрацией ТБГ и ПАМГ-2 в сыворотке крови в ранние сроки беременности, а также высоким уровнем ПАМГ-1 в поздние сроки и развитием СЗРП (256,60,104). Важную роль при беременности играют не только местно действующие факторы материнского происхождения, но и факторы, продуцируемые клетками плода, такие как АФП. Известно, что низкий уровень АФП характеризует задержку развития плода (73). Показано регулирующее действие ТБГ, ПАМГ-1 и АФП на экспрессию активационных маркеров иммунокомпетентными клетками децидуальной оболочки, которое зависело от характера течения беременности и меняло свою направленность при СЗРП (104). В связи с этим, можно предположить, что плацентарные белки могут регулировать процессы апоптоза. Тем не менее, остаются неизученными особенности регуляции параметров апоптоза децидуальных лимфоцитов альфа-фетопротеином при физиологической беременности и СЗРП.
Не раскрыты механизмы взаимодействия активирующих и негативных сигналов, контролирующих тот или иной каскадный путь апоптоза, эндогенной регуляции роста и ангиогенеза плаценты, что может иметь значение в патогенезе формирования СЗРП. Цель работы:
На основании выявления закономерностей нарушения апоптоза лимфоцитов крови и плаценты, его эндогенной регуляции установить новые патогенетические механизмы формирования СЗРП и разработать иммунологические критерии для прогнозирования эффективности лечения беременных женщин с данной патологией.
Задачи исследования: 1. Дать оценку функционального состояния фето-плацентарной системы по показателям плацентарных белков (ТБГ, ПАМГ-1, ПАМГ-2) и АФП у женщин с СЗРП и выделить наиболее значимые факторы риска рождения ребенка с задержкой развития.
Выявить особенности различных стаднії апоптоза иммунокомпетентных клеток и их эндогенной регуляции, в том числе АФП, на системном и локальном уровнях при беременности, осложненной СЗРП различной степени тяжести.
Установить особенности содержания растворимых факторов, регулирующих процессы роста, апоптоза и ангиогенеза плаценты при СЗРП различной степени тяжести.
Разработать новые иммунологические критерии для прогнозирования эффективности лечения беременных женщин с СЗРП.
Научная новизна:
Впервые определены особенности апоптоза лимфоцитов периферической крови беременных женщин и плаценты, а также его эндогенной регуляции при СЗРП.
Выявлены закономерности изменения параметров иммунного апоптоза у женщин с СЗРП на системном и локальном уровнях, проявляющиеся усилением апоптоза периферических лимфоцитов и экспрессии на их поверхности FasL в 3 триместре беременности при одновременном увеличении в децидуальной оболочке плаценты CD95+ лимфоцитов.
Установлено, что иммунные механизмы развития СЗРП на фоне гестоза отличаются от таковых при СЗРП без гестоза усилением экспрессии Fas лиган-да на децидуальных лимфоцитах.
Определено, что количество вступивших в апоптоз периферических лимфоцитов и децидуальных лимфоцитов, экпрессирующих Fas лиганд, увеличивается при 3 степени тяжести СЗРП.
Выявлены особенности продукции растворимых факторов, регулирующих процессы роста и апоптоза, при СЗРП в III триместре беременности, характеризующиеся на системном уровне - снижением сывороточного содержания TNFa как при наличии, так и отсутствии гестоза, увеличением содержания сывороточного bcl-2 при отсутствии гестоза; на локальном уровне - повышением уровней VEGF и р53 при отсутствии гестоза, снижением содержания VEGF при его наличии.
В эксперименте in vitro установлено, что белковый препарат АФП и его синтетический аналог АФП14-20 усиливают готовность к апоптозу децидуальных лимфоцитов у женщин при неосложненном течении беременности и с СЗРП. Синтетический аналог АФП14-20 ингибирует экспрессию FasL и предотвращает выход клеток в необратимый апоптоз только у женщин с неосложненной беременностью.
Показано, что снижение содержания у беременных женщин периферических лимфоцитов, находящихся на поздних этапах апоптоза, повышение уровня Ьс1-2 и р53 в экстрактах децидуальной ткани плаценты являются маркерами благоприятного развития плода при СЗРП и рождения ребенка с нормальной массой тела.
Практическая значимость:
*
Предложен новый способ прогнозирования эффективности традиционной
терапии женщин с СЗРП на основании определения показателя AnnexinV+PI+
«
лимфоцитов в периферической крови.
Основные положения, выносимые на защиту:
Формирование СЗРП у беременных женщин, независимо от наличия или отсутствия у них гестоза, сопровождается нарушением апоптоза и его регуляции на системном и локальном уровнях, а также изменением сывороточного содержания плацентарных факторов. Задержка развития плода на фоне гестоза и степень ее выраженности ассоциируются с усилением экспрессии Fas лиганда децидуальными лимфоцитами, кроме того, тяжесть СЗРП определяется усилением апоптоза периферических лимфоцитов. АФП и его синтетический аналог АФП14-20 оказывают влияние на параметры апоптоза децидуальных лимфоцитов беременных женщин.
Определение относительного содержания AnnexinV+PI+ лимфоцитов в периферической крови беременных женщин с синдромом задержки развития плода позволяет с точностью 77,8% прогнозировать эффективность проводимой терапии и рождение ребенка с нормальной массой тела.
Современные представления об этиологии и патогенезе СЗРП
Синдром задержки внутриутробного развития плода (СЗРП) является актуальной проблемой перинатологии, поскольку представляет собой одну из основных форм перинатальной заболеваемости, оказывающей влияние на последующее развитие ребенка, становление всех функций его организма (42, 14). СЗРП по данным разных авторов встречается от 2,4% до 17,6% случаев, чаще развивается при инфекционно-воспалительных заболеваниях матери и гестозе (42,19,45).
СЗРП — это патологическое состояние, которое характеризуется не только уменьшением массы, но и снижением остальных параметров физического раз-вития - длины тела, окружностей головы и туловища, размеров внутренних органов, а также признаками морфофункциональной незрелости ряда органов и систем, существенно отличающимися (в сравнении со здоровыми детьми) показателями крови и метаболизма, сниженной иммунологической реактивностью и адаптационными резервами (3). В периоде новорожденности у этих детей имеют место признаки функциональной незрелости органов и систем, а также симптомы родовой и гипоксической травмы. Более половины детей с СЗРП, переживших неонатальный период, впоследствии являются «часто болеющими» и отстают от своих сверстников в физическом развитии (3, 46). Скорость восстановления физической формы после рождения во многом определяется видом и степенью тяжести СЗРП. Так, новорожденные с симметричной формой СЗРП дольше отстают в развитии, в то время как при асимметричной форме, в большинстве случаев, в первые 6 месяцев их физические параметры нормализуются (42,46).
У детей, родившихся с СЗРП, с раннего возраста наблюдаются патологические особенности нервной системы, для которых характерно сочетание нескольких неврологических синдромов, раннее появление и длительное течение синдрома двигательных нарушений, а также впоследствии снижение интеллектуальных способностей (5, 46, 144, 168, 4). Доказано, что даже к 7 годам жизни у этих детей сохраняются изменения неврологического статуса (42).
Кроме задержки психического и физического развития, у этих детей отмечаются особенности становления функций многих органов и систем. В связи с нарушениями иммунологического статуса на первом году жизни у них отмечается склонность к повышенной заболеваемости острыми респираторными и кишечными инфекциями, пневмониями, экссудативным диатезом, анемией, рахитом. В 45% наблюдений выявляется позднее прорезывание зубов (59). Нередко наблюдаются инвалидизирующие состояния, такие как слепота и детский церебральный паралич (3,46).
Таким образом, длительное воздействие неблагоприятных внутриутробных факторов создает в конечном итоге суммарное нарушение общего развития и изменение качества всей последующей жизни ребенка. Дети, родившиеся с признаками задержки развития, требуют длительного диспансерного наблюдения и при необходимости проведения соответствующей корригирующей тера- пии (42).
СЗРП возникает вследствие воздействия тех или иных патологических факторов. Факторы риска развития СЗРП очень разнообразны. Некоторые исследователи называют три основные группы причин СЗРП: материнские, ма-точно-плацентарные и плодовые (211, 42). По мнению других авторов, все факторы риска по развитию СЗРП можно разделить на 5 групп: 1- социально-бытовые (возраст 15-17 лет и более 35 лет, беременность вне брака, профессиональные вредности, тяжёлый физический труд, эмоциональное перенапряжение, недостаточное или неадекватное питание, курение, алкоголизм (139, 141), наркомания; 2 - соматические (хронические специфические и неспецифические инфекции (79, 102), экстрагенитальные заболевания, такие как артериальная ги-пертензия (25, 114), хронические заболевания лёгких (39, 108), почек; 3- аку-шерско-гинекологические (инфантилизм, нарушение менструальной функции, первичное бесплодие, гинекологические заболевания и операции, самопроизвольные выкидыши, привычное невынашивание (81), рождение детей с малой массой тела, врождёнными пороками развития, случаи перинатальной смертности в анамнезе, осложнённое течение предыдущей беременности и родов); 4-факторы, связанные с беременностью (гестозы первой и второй половины, угроза прерывания беременности, многоплодная беременность, предлежание плаценты); 5- другие факторы риска (действие лекарственных средств (42, 203), врождённая и наследственная патология плода (203), действие радиации (42, 203)).
Среди соматических факторов риска заслуживают большого внимания в развитии СЗРП инфекции. Проблема инфекционных заболеваний при беременности остается одной из самых актуальных в акушерстве (42). Во время беременности женщина может заболеть любой инфекцией, при этом каждая из них может оказать неблагоприятное воздействие как на течение беременности, так и на развитие плода. Этот феномен в значительной степени обусловлен тропизмом возбудителей (особенно вирусных) к эмбриональным тканям, а также тем, что клетки с высоким уровнем метаболизма и энергетики являются идеальной средой для размножения микроорганизмов (79). Характер поражения плода проникшими в беременную матку инфекционными возбудителями зависит от гестационного срока. В тех случаях, когда это происходит в I триместре - возникает симметричная форма СЗРП и нередко врожденные аномалии развития плода, ведущая роль отводится энтеровирусам и вирусу герпеса, цитомегалови-русу и вирусу краснухи (3, 42) Инфицирование в III триместре беременности ассоциируется с возникновением асимметричной формы СЗРП, с повышенным риском мертворождений и осложнений в постнаталыюм периоде (225). Основным путем развития патологического процесса является гематогенная диссеми-нация патогенной инфекции с поражением плаценты и плода. У 10% детей, матери которых перенесли инфекционные заболевания во время беременности, при рождении диагностируется СЗРП (42). Частота СЗРП при инфекционном поражении тесно связана с видом возбудителя. Например, при краснухе она может достигать 60%, а при цитомегаловирусной инфекции - 40%. В генезе СЗРП большое значение имеет инфекционное поражение плаценты, которое предшествует инфицированию плода.
Существует несколько теорий патогенеза СЗРП. Например, теория нарушения клеточного роста (42, 3, 46). В настоящее время выделяют три фазы внутриутробного клеточного роста - фазу гиперплазии, фазу клеточной гиперплазии и гипертрофии и фазу клеточной гипертрофии.
Фаза гиперплазии (репликации, пролиферации). Эта фаза наблюдается в первые 16 недель гестации и заключается в усиленной пролиферации клеток в организме эмбриона, а затем плода. Масса плода возрастает в течение данной фазы очень медленно, поэтому она именуется также фазой быстрых митозов и медленного увеличения массы плода. Вторая фаза - фаза клеточной гиперпла-зии и гипертрофии. Она наблюдается с 17 по 28 неделю. Эта фаза характеризуется наличием снижающейся, но всё ещё достаточно высокой пролиферативной активностью клеток, в сочетании с прогрессирующим увеличением их размеров. Процессы гиперплазии и гипертрофии происходят одновременно, однако скорость гипертрофии больше. Значительно возрастает также скорость прироста массы плода. Третья, заключительная фаза внутриутробного роста - фаза клеточной гипертрофии - характеризуется прогрессирующим увеличением клеточной цитоплазматической массы, тогда как их пролиферация неуклонно снижается и в конце беременности практически прекращается. Пролиферативная активность клеток плода становится минимальной уже после 32 недели беременности. Существующие клетки продолжают увеличиваться в размерах, но новые клетки больше не образуются. Масса плода при этом очень быстро увеличивается. Тип нарушений роста плода зависит от того, в какой фазе происходило воздействие на него повреждающих факторов.
Роль апоптоза в патогенезе СЗРП
Апоптоз имеет огромное значение практически во всех аспектах развития и функционирования репродуктивной системы животных и человека. Большое число наблюдений, накопленных в результате экспериментальных исследований и в ходе исследований тканей человека показало, что апоптоз соматических и половых клеток, а также нарушение его регуляции, могут играть важную роль в повреждении яичников, развитии осложнений беременности и дефектах формирования плода (246). Это привело к развитию новых направлений медицины, направленных на улучшение репродуктивного здоровья женщины. Апоптоз играет важную роль в формировании синдрома задержки внутриутробного развития плода (199). Апоптоз наблюдается в плаценте в течение всего периода гестации и является физиологически обязательным (253). Это явление необходимо для формирования синцитиотрофобласта, а на ранних сроках гестации - для ограничения инвазии трофобласта (253). При СЗРП отмечается усиление апоптоза трофобласта (238,253, 125).
Апоптоз - это активная форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду, являющаяся результатом реализации ее генетической программы или ответом на внешние стимулы (116).
Апоптоз отличается от некроза морфологическими признаками, отсутствием повреждения окружающих тканей и воспалительной реакции (115).
К физиологическим активаторам апоптоза относятся цитокины (интер-лейкины, фактор некроза опухоли, интерфероны, колониестимулирующие факторы, пептидные ростовые факторы) и гормоны (глюкокортикоиды, половые гормоны, гормоны пшофиза). Их влияние на клетки неоднозначно: для одних клеток они выступают в роли индуктора, для других - ингибитора апоптоза. Сигнал воспринимается рецептором и с помощью адаптерного белка активирует систему особых ферментов - каспаз. По своей субстратной специфичности каспазы делят на инициирующие и эффекторные или, соответственно, каспазы первого и второго эшелонов. Инициирующие каспазы вызывают первые проте-олитнческие события: повреждение цитоскелета с высвобождением связанных с ним протеинов (204) и активируют каспазы второго эшелона. Активация инициирующих каспаз не обязательно заканчивается гибелью клетки. На этом этапе апоптоз может быть заблокирован особыми ингибирующими или антиапоп-тозными белками. При включении эффекторных каспаз апоптоз становится необратимым, и происходит разрушение белков цитоскелета и ядра клетки. Можно выделить несколько путей индукции гибели клетки, в конечном итоге приводящих к активации каспазы-3, ключевого эффекторного белка в каскаде апоптоза, расщеплению ядерных субстратов данным ферментом и фрагментации ДНК (76), один из них - апоптоз, включаемый митохондриаль-ными белками семейства генов Вс1-2.
Семейство BCL-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2-like proteins) включает 2 группы белков с оппозитным действием: с про-апоптотическим действием, которые способствуют освобождению цитохрома сие антиапоптотическим действием, которые предотвращают его. В здоровых клетках имеет место сегрегация белков митохондрий и цитоплазмы, которая предотвращает индукцию апоптоза, и лишь при нарушении митохондриалыюго барьера происходит активация каспаз. Белки семейства BCL-2 регулируют целостность внешней мембраны митохондрий (172) Некоторые белки, например, такие как анти- (Вс1-хь Bcl-2, Bcl-w, Mcl-1 и BOO/DIVA) и про-апоптотического действия (BID, Вах, ВАК и BOK/MTD) имеют скрытый ВНЗ регион (188). Антиапоптотическим белкам присуща способность угнетать освобождение цитохрома с, а связывание с про-апоптотическими членами семейства ингибирует эту супрессорную активность. В этой модели соотношение тех или других белков будет определять гибель или жизнь клетки (218).
Клетки синцитиотрофобласта, но не цитотрофобласта экспрессируют Вс1-2. Экспрессия этого анти-апоптотического белка может быть одним из основных факторов, предотвращающим повреждение клеток синцитиотрофобласта (155). Эти данные подтверждаются результатами других исследователей и свидетельствуют, что в ранней плаценте параллельно идут интенсивные процессы пролиферации и апоптоза (205). Экспрессия Вс1-2 минимальна на ранних стадиях гестации и максимальна в конце беременности (205). С другой стороны данные об экспрессии Вс1-2 на поверхности клеток вневорсинчатого трофобла-ста противоречивы. Fulop et al (165) не обнаружили во вневорсинчатом трофоб-ласте человека Вс1-2 позитивных клеток с 6 по 16 недели беременности (165). Redline RAV. и Patterson P. (229) получили сходные результаты для 25-40 недели гестации. Marzioni D. et al (206) установили, что Bcl-2 обнаруживается лишь в многоядерных гигантских клетках трофобласта ранней плаценты (206). С помощью иммуногистохимии было установлено, что Вс1-2 экспрессируется в основном в сшщитиотрофобласте, где выше интенсивность апоптоза, а Вах -только в цитотрофобласте (200).
Белок р53 является транскрипционным фактором, индуцирующим апоп-тоз, в основном за счет индукции экспрессии генов, связанных с окислительно-восстановительными процессами (224) и снижения регуляции Вс1-2 (209). Белок р53 обнаруживался в цитоторофобласте и сшщитиотрофобласте, покрывающем базальную ножку якорных ворсин на поздних этапах беременности и локализовался с апоптирующими клетками. Активация р53 может вести либо к прекра-. щению клеточного роста, либо к апоптозу (202). В связи с этим белок р53 может иметь отношение к аресту клеточного цикла или апоптозу клеток синци-тиотрофобласта на ранних этапах плацентации. Уровень экспрессии р53 был низким на ранних этапах беременности, на более поздних - более выраженным. Наиболее выраженная экспрессия р53 наблюдалась в зонах с наибольшей про-лиферативной активностью, что позволяет предполагать, что р53 может контролировать чрезмерную пролиферацию трофобласта (251). Про-апоптотический белок р53 обнаруживался главным образом в цитотрофобласте. В эндометрии апоптирующие и р53-позитивные клетки относились к клеткам стромы.
Методы исследования
Клинические, в том числе общепринятое лабораторное обследование.
Ультразвуковое исследование беременных женщин проводилось на приборе ультразвуковой диагностики SSD - 2000 фирмы «Алока Ко. ЛТД» (№94/167 -1996г., Япония). Расширенная фетометрия, эхографическая оценка плаценты и околоплодных вод проводилась по общепринятым стандартам.
Допплерографическое исследование маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока проводилось на приборе Siemens Versa Plus.
Кардиотокографическое исследование — на аппарате Sonicaid Oxford с компьютерным анализом по критериям Dawes/Redman и оценкой по балльной системе W. Fischer.
Иммунологические методы исследования.
Материалом для исследования служила периферическая кровь из локтевой вены в III триместре беременности и децидуальная ткань зрелой плаценты.
Определение уровней nAMr-l(IGFBP-l) и ПАМГ-2 (РР14) в сыворотке крови проводилось наборами фирм DSL (USA) и "BIOSERV" (СМВН) ИФА методом на приборе ридер автоматический Е1-808 фирмы BIOEK INSTRUMENTS INC. (USA).
Определение уровня АФП (AFP) проводилось хемилюминисцентным методом набором фирмы "DPC" (USA) на приборе IMMULITE. Определение ТБГ в сыворотке крови проводили методом иммуно-диффузионного анализа с применением отечественных наборов. Чувствительность метода составляла для ТБГ-1 мкг/мл.
Для исследования сывороточного содержания различных биологических продуктов кровь в количестве 3 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку, оставляли на 10-15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл разливали в пробирки типа Эппевдорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при -20 С. При необходимости сыворотки хранили при - 80С.
- Выделение мононуклеарных клеток
Для исследований методом проточной цитометрии, полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени (RT-PCR) и культивирования клеток кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7 % раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078).
Мононуклеарные клетки из децидуалыюй оболочки выделяли безфермен-тативным методом, путем механического измельчения ткани гомогенизатором. Плаценту после родов взвешивали, определяли ее объем, помещали в охлажденный до 4С физиологический раствор и в течение 15-20 минут доставляли в лабораторию. Затем плаценту со стороны децидуалыюй оболочки тщательно отмывали от крови и срезали децидуальную ткань небольшими пластинками пло-щадыо 1-2 см . Кусочки ткани отмывали физиологическим раствором от крови и клеток трофобласта в большом объеме физиологического раствора при постоянном перемешивании на магнитной мешалке ММ2А (Laboratorni pristroje, Чехословакия) в течение 10-15 мин. Затем отмытые кусочки децидуалыюй ткани го-могенезировали ручным гомогенизатором DIAX 100 (Heidolph, Германия) до получения кашицеобразной массы. Полученную массу заливали 100 мл Среды 199 и перемешивали в течение 15 мин на магнитной мешалке. Взвесь фильтровали через 8 слоев плотной марли, клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин. Все выделенные клетки ресуспендировали в 6 мл Среды 199, наслаивали на градиент плотности фиколл-урографина (d-1,114) и центрифугировали при 1500 об/мин 30 минут. Жизнеспособность мононуклеарных клеток, определяемая по окрашиванию трипановым синим, составляла не менее 95%. По данным световой микроскопии кольцо клеток в интерфазе Среда 199 - фиколл-урографин содержало 25-35% лимфоцитов и 60-70% макрофагов. Выход клеток в индивидуальных образцах варьировал от 0,1 до 0,25 х 106 кл/г ткани.
- Получение экстрактов децидуальной ткани
Экстракты децидуальной ткани получали следующим образом: дециду-альную ткань срезали небольшими пластинами площадью до 3 см2 и отмывали от крови и от клеток трофобласта физиологическим раствором, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 минут. Кусочки децидуальной ткани подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли PBS в объеме, равном изначальному весу децидуальной ткани (на 1 г ткани - 1 мл PBS). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при - 20С в течение суток. Гомогенат размораживали, фильтровали через 8 слоев плотной марли и ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об/мин при температуре +4С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и замораживали при -20С до проведения иммунофер-ментного анализа.
- Стимуляция экспрессии маркеров апоптоза лимфоцитов АФП
В работе использовали чистый препарат АФП, полученный на кафедре биохимии РГМУ (г. Москва) путем аффинной хроматографии и его синтетический аналог АФП сь содержащий активный участок молекулы АФП с аминокислотной последовательностью LDSYQCT. АФП использовали в концентра 42 ции, соответствующей его физиологической норме в периферической крови бе ременных женщин в 3 триместре беременности - 250 нг/мл. Препарат АФП14.20 использовали в концентрации 10"7 М, в соответствии с концентарцией АФП в ретроплацентарной крови. Децидуальные лимфоциты в концентрации 1 х 106 ресуспендировали в среде RPMI-1640 с глютамшюм, содержащей АФП или АФП 14-20 в течение 1 часа при температуре 37С. Затем клетки отмывались от белка и метились моноклональными антителами. В качестве контроля использовали лимфоциты, инкубировавшиеся в аналогичных условиях в среде RPMI-1640. Подсчет концентрации и жизнеспособности лимфоцитов до и после инкубации показал, что гибель клеток во всех случаях составила менее 2%.
- Проточная цитофлюорішетрии
Для проточной цитометрии использовали общую фракцию мононуклеар-ных клеток. Поверхностный фенотип клеток и внутриклеточную экспрессию цитокинов определяли с помощыо моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюорішетрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ).
Особенности системного апоптоза лимфоцитов в 3 триместре беременности при СЗРП
Экспрессия клетками поверхностных CD95 молекул (mFas), характеризует готовность клеток к вступлению в апоптоз. Кроме того, важнейшей характеристикой апоптоза является экспрессия клетками лиганда для Fas (FasL), так как непосредственное взаимодействие между Fas и FasL является одним из ведущих механизмов запуска апоптоза.
В таблице 4.1.1. представлены данные содержания в крови CD95+ и CD95L+ лимфоцитов в сравниваемых группах женщин при ретроспективном исследовании. Как видно из приведенных в таблице данных, в группе женщин, родивших детей с СЗРП, уровень CD95+ лимфоцитов в периферической крови был достоверно выше, чем в группе контроля (р 0,01 для общей группы с СЗРП, р 0,02 для СЗРП без гестоза и р 0,05 для группы СЗРП с гестозом). Не выявлено достоверных различий между содержанием периферических лимфоцитов, экспрессирующих молекулы mFas, у женщин с СЗРП, развившимся без гестоза и на фоне гестоза (р 0,05). Показатели содержания CD95+ лимфоцитов в периферической крови женщин, родивших детей без СЗРП, существенно не отличались от таковых в контрольной группе (р 0,05). В то же время, следует отметить тенденцию к увеличению их уровня в крови у данной группы женщин.
В группах женщин, родивших детей с СЗРП, отмечалось достоверное повышение содержания периферических CD95L+ лимфоцитов по сравнению с аналогичными показателями женщин контрольной группы (р 0,01 для общей группы с СЗРП, р 0,05 для СЗРП без гестоза и р 0,02 для группы СЗРП с гестозом). Следует отметить, что уровень этих клеток в крови был одинаковым в группе пациенток, у которых СЗРП развился на фоне неосложненного гестозом течения беременности и при гестозе (р 0,05). Показатели содержания CD95L+ лимфоцитов в периферической крови женщин, родивших детей без СЗРП, соответствовали таковым в группах женщин, родивших детей с СЗРП (р 0,05 в обоих случаях). Однако, в связи с большим разбросом индивидуальных показателей, в группе женщин, родивших детей без СЗРП, повышение уровня CD95L+ клеток, по сравнению с показателями женщин контрольной группы, имело лишь характер тенденции (р 0,05).
В таблице 3.1.2 представлены данные содержания CD95+ и CD95L+ лимфоцитов в периферической крови женщин с СЗРП различной степени тяжести.
Сравнительный анализ результатов показал, что уровень CD95+ лимфоцитов в группе женщин с СЗРП достоверно возрастал при любой степени тяжести патологии плода по сравнению с показателями женщин контрольной группы (р 0,05 при 1 и 2 степени СЗРП, р 0,02 при 3 степени СЗРП). Однако достоверных различий в содержании периферических Fas-позитивных лимфоцитов в зависимости от тяжести СЗРП нам выявить не удалось (р 0,05 во всех случаях).
Уровень mFasL-позитивных периферических лимфоцитов также был достоверно выше в группах женщин с СЗРП 1, 2 и 3 степени тяжести по товерно выше в группах женщин с СЗРП 1,2 и 3 степени тяжести по сравнению с показателями группы контроля (р 0,05 при 1 и 2 степени СЗРП, р 0,01 при 3 степени СЗРП).
Следует отметить тенденцию к повышению содержания CD95L+ лимфоцитов в периферической крови с увеличением степени тяжести СЗРП, однако данное повышение не было достоверным (р 0,05 при сравнении всех групп с СЗРП между собой).
Независимо от характера инициирующего сигнала к апоптозу, приобретение клеткой способности фиксировать белок AnnexinV свидетельствует о вступлении клетки в состояние апоптоза. Клетки, находящиеся на ранних, обратимых этапах апоптоза не способны накапливать внутриклеточно пропидиум иодид и имеют фенотип AnnexinV+PI-. В тех случаях, когда апоптоз клеток приобретает необратимый характер, пропидиум иодид свободно поступает в цитоплазму гибнущей клетки, такие клетки приобретают фенотип AnnexinV+PI+.
В таблице 4.1.3 представлены параметры аннексинового теста беременных женщин 3 триместра с СЗРП.
Результаты исследований показали, что общий уровень периферических AnnexinV+ лимфоцитов в группах женщин, родивших детей с СЗРП, был достоверно выше, чем в группе контроля (р 0,001 для общей группы с СЗРП, р 0,001 для СЗРП без гестоза и р 0,01 для группы СЗРП с гестозом). Это определялось достоверным повышением уровня как AnnexinV+PI- лимфоцитов (р 0,02 для общей группы с СЗРП, р 0,02 для СЗРП без гестоза и р 0,05 для группы СЗРП с гестозом), так и AnnexinV+PI+ лимфоцитов (р 0,001 для общей группы с СЗРП, р 0,01 для СЗРП без гестоза и р 0,001 для группы СЗРП с гестозом), относительно показателей контрольной группы. Причем содержание как AnnexinV+PI-, так и AnnexinV+PI+ клеток повышалось в крови женщин с СЗРП независимо от наличия гестоза и существенно не различалось при СЗРП, развившемся на фоне беременности без гестоза или с гестозом (р 0,05 во всех случаях).
В группе женщин, родивших детей без СЗРП, содержание AnnexinV+ лимфоцитов в периферической крови было несколько выше, чем в контрольной группе (р 0,05), но достоверно ниже, чем в группах женщин, родивших детей с СЗРП (р 0,05). Следует отметить, что для женщин, родивших детей без СЗРП, было характерным достоверное повышение в периферической крови содержания AnnexinV+PI- лимфоцитов относительно показателей группы контроля (р 0,01), что полностью соответствовало показателям групп женщин, родивших детей с СЗРП (р 0,05 во всех случаях). Основной отличительной чертой группы женщин, родивших детей без СЗРП от групп женщин, родивших детей с СЗРП, было отсутствие достоверных изменений в содержании AnnexinV+PI+ периферических лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (р 0,05). Показатель содержания лимфоцитов, вступивших в необратимый апоптоз в группе женщин, родивших детей без СЗРП, был достоверно ниже, чем в группе женщин, родивших детей с СЗРП (р 0,01). На основании этой закономерности, нами был разработан новый способ прогнозирования эффективности традиционной терапии СЗРП. Этот способ позволяет при значениях показателя относительного содержания AnnexinV+PI+ лимфоцитов менее 10% в периферической крови женщин с диагностированным по данным УЗИ и клинического обследования синдромом задержки развития плода с точностью 77,8%, чувствительностью 70,6% и специфичностью 82,1% прогнозировать эффективность применения традиционной терапии СЗРП (приоритетная справка №2005137096 от 29.11.2005).
![Роль изменений активации клеток моноцитарно-макрофагального ряда, содержания плацентарного фактора роста и эндотелина в формировании синдрома задержки развития плода [Электронный ресурс]](/i/i/4395/197175.png "Роль изменений активации клеток моноцитарно-макрофагального ряда, содержания плацентарного фактора роста и эндотелина в формировании синдрома задержки развития плода [Электронный ресурс] Гагаева Юлия Владимировна")
![Значение адаптационных изменений сердечно-сосудистой системы плода при синдроме задержки развития и гестозе для выбора акушерской тактики [Электронный ресурс]](/i/i/4242/206934.png "Значение адаптационных изменений сердечно-сосудистой системы плода при синдроме задержки развития и гестозе для выбора акушерской тактики [Электронный ресурс] Орехова Валентина Константиновна")