Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1. Факторы риска пролапса тазовых органов у женщин 10
1.2. Роль дисплазии соединительной ткани в патогенезе пролапса тазовых органов 18
1.3. Метаболизм соединительной ткани и его роль в патогенезе пролапса тазовых органов и других заболеваний 20
Матриксные металлопротеиназы 23
Лизилоксидаза 26
N-ацетилтрансфераза 31
Глутатион-8-трансфераза 35
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 41
2.1 Клинические методы исследования пациенток 42
2.2. Генетические методы исследования 46
2.3 Гистологические методы исследования 50
2.4 Статистические методы исследования 51
ГЛАВА 3. Результаты клинического и лабораторного методов исследования пациенток с ПТО 52
3.1 Результаты клинико—анамнестического исследования женщин с ПТО 52
3.2 Результаты гистологического исследования биоптатов ткани влагалища женщин с ПТО 73
3.3 Результаты генетического исследования пациенток с ПТО 80
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 98
Практические рекомендации 114
Литература 116
- Роль дисплазии соединительной ткани в патогенезе пролапса тазовых органов
- Глутатион-8-трансфераза
- Гистологические методы исследования
- Результаты гистологического исследования биоптатов ткани влагалища женщин с ПТО
Введение к работе
Актуальность темы. Пролапс тазовых органов (ПТО) является наиболее частой патологией тазового дна у женщин (Кулаков В.П., 2000; Айламазян Э.К. и др., 2007; Drutz Н. et al., 2006; Jelovsek J.E. et al., 2007; Twiss С et al., 2008). В нашей стране данное заболевание наблюдается у 15-30% женщин (Краснопольская И.В., 2004; Буянова С.Н. и др., 2008). Однако, несмотря на распространенность, единого мнения об этиологии и патогенезе опущения и выпадения внутренних половых органов (ОиВВПО) у женщин в настоящее время нет.
Самым эффективным методом лечения ПТО является хирургический. При этом до 30% женщин, перенесших хирургическое лечение заболевания, нуждаются в повторной операции в связи с развитием рецидива пролапса (Беженарь В.Ф. и др., 2009; Read R. С, 2008). Частота рецидивов заболевания не имеет тенденции к снижению и составляет от 10% до 40% (Буянова С.Н. 1999; Адамян Л.В. и др., 2000; Краснопольский В.П., 2007). Неудовлетворенность специалистов результатами лечения пациенток с ПТО вынуждает искать новые методы хирургической коррекции заболевания. Так, в последние годы разработаны новые методы оперативного лечения ПТО с применением синтетических материалов, полностью замещающих фасциальные компоненты тазового дна (Jaquetin В., 2000; Atiemo Н. et al., 2006; Reisenauer С. et al., 2007; Carey M. et al., 2008; Maher С et al., 2009). В то же время четких критериев для выбора метода оперативного лечения опущения тазовых органов, а именно выполнения реконструкции тазового дна аутотканями или с применением синтетических материалов, на сегодняшний день нет. Таким образом, проблема разработки критериев эффективности того или иного метода оперативного лечения ПТО остается актуальной.
Ассоциированные с ПТО факторы риска, а именно, возраст, неоднократные роды, гинекологические операции (в частности, гистерэктомия и операции на тазовом дне), различная экстрагенитальная
патология, приводящая к повышению внутрибрюшного давления (ожирение, хронические расстройства функции кишечника и др.), рассматриваются лишь как условия для развития заболевания.
В последнее время широкое распространение получила теория, согласно которой ПТО является формой проявления генерализованной дисплазии соединительной ткани (ДСТ) на уровне репродуктивной системы (Смольнова Т.Ю., 1999; Костючек Д.Ф. и др., 2006; Адамян Л.В. и др., 2007). Это, в сочетании с данными эпидемиологических исследований, демонстрирующих разную частоту заболевания у женщин различных расовых групп (Jelovsek J.E. et al., 2007; Shah A.D. et al., 2007), а также случаи семейного анамнеза ПТО (Смольнова Т.Ю., 1999; Русина Е.И. и др., 2007; Twiss С. et al., 2008), предполагает в патогенезе заболевания роль не только экзогенных факторов, но и существование так называемых эндогенных, генетически детерминированных условий для формирования опущения тазовых органов.
Цель исследования: оптимизировать методы обследования и прогнозирования рецидивов заболевания у больных с пролапсом тазовых органов на основании анализа факторов риска, изучения клинических, морфологических и генетических аспектов заболевания.
Задачи исследования
Выявить наиболее значимые акушерско-гинекологические и соматические факторы риска пролапса тазовых органов у женщин.
Оценить гистологические изменения структуры стенки влагалища пациенток при пролапсе тазовых органов разных стадий.
Изучить характер полиморфизма генов NAT2, GST ТІ, GST Ml и ММР-1 при пролапсе тазовых органов у женщин и выявить гены -кандидаты, участвующие в патогенезе заболевания.
Изучить характер сочетания генотипов по генам NAT2, GST ТІ, GST Ml и ММР-1 при пролапсе тазовых органов.
5. Определить клинико-лабораторные критерии прогнозирования развития рецидива пролапса тазовых органов у женщин после хирургического лечения.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Впервые проведена комплексная оценка пролапса тазовых органов у женщин с позиции конституционально-детерминированного патогенеза, обусловленного фактором активности ферментов метаболизма соединительной ткани.
Впервые изучены особенности генетически детерминированной активности ферментов NAT2, GST ТІ и GST МІ у пациенток с пролапсом тазовых органов и показана значимость полиморфизма генов этих ферментов в патогенезе заболевания.
Получены новые данные о патогенезе пролапса тазовых органов у женщин, позволяющие обосновать индивидуальный выбор метода его хирургического лечения, а именно, определение показаний к применению синтетических имплантов с целью укрепления или замещения соединительнотканных компонентов тазового дна и снижения таким образом риска рецидива заболевания.
Доказано, что в основе развития пролапса тазовых органов у женщин лежит патология соединительнотканных и мышечных структур поддерживающего аппарата органов малого таза и тазового дна, обусловленная генетическим дефектом метаболизма компонентов экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани, а также экзогенными факторами.
Практическая значимость работы
Выявлены наиболее значимые акушерско-гинекологические и соматические факторы риска развития пролапса тазовых органов у женщин, позволяющие определить индивидуальную модель развития заболевания, а также оценить исходное состояние поддерживающих структур органов малого таза и тазового дна пациентки.
Показана причина низкой эффективности методов хирургического лечения пролапса тазовых органов, подразумевающих использование нативных тканей.
Определены новые клинико-лабораторные показатели скрининга женщин групп риска по развитию и прогрессированию пролапса тазовых органов, а также предложены математические модели для расчета вероятности прогрессирования заболевания.
Патогенетически обосновано применение антиоксидантной терапии в комплексном лечении пролапса тазовых органов у женщин.
Основные положения, выносимые на защиту
Факторами, достоверно ассоциированными с риском пролапса тазовых органов, являются: возраст, менопауза, роды, хирургическое или травматическое повреждение мягких тканей промежности и влагалища в родах, гистерэктомия, сахарный диабет 2 типа.
Патогенетическим условием формирования пролапса тазовых органов и увеличения степени тяжести заболевания являются особенности полиморфизма генов фазы II системы детоксикации (NAT2, GST ТІ и GST Ml).
Больным с пролапсом тазовых органов III - IV стадий в случае выявления генотипа «медленного» N-ацетилирования и сочетанного «нулевого» генотипа по генам GST ТІ и GST Ml патогенетически обоснованным методом выбора при хирургическом лечении являются операции с применением синтетических имплантов.
Апробация и внедрение результатов работы в практику Материалы диссертации представлены на IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009); на научно-практической конференции кафедры акушерства и гинекологии им. А.Я. Крассовского ВМедА (Санкт-Петербург, 2009); на Всеармейской научно-практической конференции «Современное состояние и
перспективы оказания акушерско-гинекологическои помощи в Вооруженных Силах» (Санкт-Петербург, 2009); на Европейском конгрессе генетиков (г. Вена, Австрия, 2009); на 4-ом международном научном конгрессе «Оперативная гинекология - новые технологии» (Санкт-Петербург, 2009); на четырнадцатой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (2009); на окружной научно-практической конференции «Дисплазия соединительной ткани. Проблемы гинекологии, пути решения: новые технологии в тазовой хирургии» (Ханты-Мансийск, 2009).
Работа поддержана грантом Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов вузов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга 2009 г. (№ 4/04.05/032).
Результаты исследования внедрены в практику гинекологического отделения с операционным блоком НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН и лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН.
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 7 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 таблицами и 15 рисунками. Диссертация состоит из введения; глав: обзор литературы, материалы и методы, результаты клинического и лабораторного методов исследования, обсуждение полученных результатов; выводов и практических рекомендаций. Список литературы состоит из 153 наименований, из них 51 работа принадлежит отечественным авторам и 102 работы - зарубежным.
Роль дисплазии соединительной ткани в патогенезе пролапса тазовых органов
В генезе ПТО определенную роль играет системная дисплазия соединительной ткани (ДСТ).
ДСТ — полиорганная или полисистемная патология с прогредиентным течением, в основе которой лежат дефекты синтеза или катаболизма компонентов внеклеточного матрикса или регуляторов морфогенеза соединительной ткани [16].
Выделяют две группы ДСТ - дифференцированные и недифференцированные ДСТ.
Дифференцированные характеризуются определенным типом наследования, отчетливо очерченным симптомокомплексом и, как правило, детерминированным генным дефектом (в основном моногенным) (например, синдром Элерса-Данло, различные формы несовершенного остеогенеза, синдром Марфана, синдром «cutis laxa» и др.) [16].
ПТО является одним из симптомов некоторых заболеваний, относящихся к группе дифференцированных ДСТ. Так, у женщин с синдромом Марфана или Элерса Данло ПТО диагностируется с более высокой частотой, чем в популяции [65, 145].
В литературе имеется описание клинического случая ПТО у молодой женщины с синдромом Элерса-Данло. У пациентки через 6 недель после родов произошло выпадение матки с образованием цистоцеле, ректоцеле и энтероцеле. Больной была выполнена влагалищная гистерэктомия и пластическая операция на тазовом дне. Однако, через год после операции у пациентки произошло выпадение культи влагалища и рецидив ректоцеле [65].
При исследовании нескольких семей с аутосомно-доминантным типом наследования ПТО, развивающегося в молодом возрасте и характеризующегося формированием декомпенсированных форм заболевания, была выявлена точковая мутация в участке промоутера гена ламинина (LAMC-1). Частота носительства данной мутации в обследованных семьях 5 раз превышала популяционные показатели [145].
Таким образом, фенотипической особенностью женщин носителей точковых мутаций в генах коллагена и эластина, а также в гене ламинина является не только широкий спектр симптомов ассоциированных с ДСТ, но и развитие выраженного ПТО (III — IV стадий) в молодом возрасте спонтанно или после первых родов.
Недифференцированные ДСТ диагностируются в том случае, когда набор клинических признаков, имеющихся у пациентки, не укладывается ни в одно из дифференцированных моногенных заболеваний [16]. Данная группа является генетически гетерогенной и ассоциируется с развитием различных мультифакториальных заболеваний, характеризующихся прогредиентным течением, возникающих у людей с определенной генетической предрасположенностью в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально под действием неблагоприятных факторов внешней среды [16].
В литературе представлены фенотипические особенности пациенток с ПТО, ассоциирующиеся с недифференцированной ДСТ [8, 18, 43, 45, 81]. Так, отмечено, сочетание ПТО с гипермобильностью суставов, патологической подвижностью уретры [86], варикозной болезнью, нарушением осанки, висцероптозом и т.д. [43, 86]. Эти данные позволяют рассматривать ПТО как форму проявления генерализованной ДСТ на уровне репродуктивной системы. Также показано, что чем ярче проявления ДСТ, тем в более раннем возрасте возникает ПТО, сложнее поддается оперативной коррекции и чаще рецидивирует [43, 45].
Эти данные подтверждают значение генетически-детерминированных дефектов соединительной ткани в патогенезе ПТО.
Глутатион-8-трансфераза
Глутатион-Э-трансферазы (GSTs) — семейство многофункциональных ферментов. Также как и NAT, GSTs являются ферментами II фазы системы детоксикации. Ферменты катализируют присоединение глутатиона, основного клеточного антиоксиданта [89], к электрофильному центру ряда органических веществ, приводя к образованию менее токсичных гидрофильных соединений [24, 85, 89].
Кроме того, GSTs являются важным компонентом глутатион -зависимого звена антиоксидантной системы. Глутатион-8-трансфераза связывает глютатион со свободными радикалами и ксенобиотиками, обладающими повреждающим действием на мембранные структуры клеток [19,89, 103].
Следует, отметить, что глутатион - зависимая детоксикация является насыщенной ферментативной системой и при интенсивном поступлении или образовании токсических веществ не способна полностью их инактивировать.
Активность ферментов семейства GSTs является генетически обусловленной [85, 92].
Результатом гомозиготной делеции в генах GSTs является отсутствие соответствующих белковых продуктов, что определет повышенную индивидуальную чувствительность к воздействям факторов внешней среды и эндогенных факторов [63]. В частности, полиморфизм генов семейства GSTs определяет подверженность клеток к патологическому перекисному окислению мембранных липидов в условиях оксидативного стресса [88], то есть в условиях дисбаланса между прооксидантами и антиоксидантами. Таким образом, можно предположить, что повреждение клеток СТ, в частности, может приводить к нарушению клеточно-матриксного взаимодействия и, соответственно, к декомпенсации механических свойств СТ. У человека описано два класса глутатион-8-трансфераз: цитозольные и микросомальные. При этом для класса цитозольных GST известно несколько семейств генов, картированных в разных хромосомах: alpha (a), mu (u.), theta (т), pi (л;), zeta (Q, sigma (а), kappa (к), omega (со) [143].
В клиническом отношении наибольший интерес представляет изучение полиморфизма двух классов семейства глутатион-Б-трасфераз, а именно mu (GST Ml) и theta (GST ТІ).
Гены GST Ml и GST ТІ картированы, соответственно, на хромосомах lpl3.3H22qll.23[6, 12, 143].
Гомозиготное носительство делеции GST Ml («нулевой» генотип) широко представлено в различных популяционных группах, достигая в некоторых 50% всего населения [6, 31, 32, 109]. Среди русских частота «нулевого» генотипа GST Ml колеблется от 24,0 до 49,0% в зависимости от региона [31, 143].
Гомозиготное носительство делеции GST ТІ («нулевой» генотип) в европейской популяции составляет около 30 % [6, 31, 32, 143].
В литературе существуют данные о связи полиморфизма генов GST Ml и GST ТІ с развитием различных заболеваний (табл. 3).
Высокая частота функционально неактивных «нулевых» генотипов по генам GST ТІ и GST Ml ассоциирована с возникновением метастазов злокачественных опухолей. Исследователи предполагают, что это может быть обусловлено повышенной восприимчивостью клеток к повреждающим воздействиям окружающей среды на фоне дефекта ферментов биотрансформации ксенобиотиков и накопления мутагенных и канцерогенных веществ, вызывающих мутации в генах, кодирующих белки межклеточных контактов. В результате повреждения белков межклеточных контактов происходит ослабление сил сцепления между клетками и последующий их отрыв друг от друга [12]. Курение также является одним из факторов ПТО [107, 138], хотя механизм действия этого фактора остается не определенным. Считается, что воздействие сигаретного дыма ведет к активации макрофагов и нейтрофилов, увеличению количества тканевых протеаз, в частности ММР-1, желатиназ А и В (ММР-2, ММР-9), матрилизина (ММР7) и ММР-8, обладающих выраженной эластолитической и коллагенолитической активностью. Результатом этого процесса становится деградация эластиновых и коллагеновых волокон ЭЦМ СТ [54, 137] и, как следствие, нарушение прочности СТ, что является условием для развития ПТО.
В то же время детоксикация полициклических ароматических углеводородов, то есть основных канцерогенных компонентов табачного дыма, осуществляется ферментами семества GSTs, а именно, GSTT1 и GSTM1. При этом субстратами GSTT1 являются монозамещенные галоалкены, a GSTM1 — эпоксиды полиароматических углеводородов [12]. Соответственно, гомозиготность по «нулевому» аллелю одного или другого гена может быть связана с повышенной восприимчивостью организма к действию сигаретного дыма.
Таким образом, нарушение активности ферментов GSTT1 и GSTM1 может быть фактором дезорганизации ЭЦМ СТ, результатом которой становится изменение физических свойств ткани. Мы предполагаем, что активность ферментов семейства GSTs может быть одним из патогенетических условий развития ПТО.
Гистологические методы исследования
Гистологическое исследование проведено в патологоанатомическом отделении НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель — з.д.н. РФ, д.м.н., проф. Кветной И.М.).
Исследовали ткань передней и задней стенок влагалища, полученную при выполнении реконструктивно-пластических операций на тазовом дне или во время влагалищной гистерэктомии у 40 женщин. Основную группу составили пациентов с различными стадиями ПТО (ПТО I — п = 11; ПТО II — п = 13; ПТО III — п = 12; ПТО IV — n = 4).
Перед проведением морфологического исследования фрагмент ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рН 7.2), обезвоживали с помощью автоматической станции Leica ТР1020 и заливали в парафин согласно стандартной гистологической схеме. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Для выявления соединительной и мышечной ткани гистологическое исследование проводилось с использованием окраски пикрофуксином по Ван - Гизону.
Микропрепарат исследовали под микроскопом с настройкой освещения по Келлеру при увеличении 4х и 10х. Морфометрические исследования проводили на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обеспечения «АСТ-1», версия 2.12.
Фотосъемку производили в графическом формате изображения JPEG (normal). Статистическая обработка данных проводилась методами описательной статистики и сравнения выборок с использованием t-критерия Стюдента, точного критерия Фишера, критерия хи-квадрат (%2), коэффициента корреляции Пирсона (г). Уровень статистической значимости (р) принят 0,05. Обработка данных проводилась с использованием программ «Instat» и Statistica, версия 6. Расчет вероятности прогрессирования ПТО выполнен на основе бинарной Logit-регрессии (оценки получены методом максимального правдоподобия).
Результаты гистологического исследования биоптатов ткани влагалища женщин с ПТО
Проведено морфологическое исследование биоптатов стенок влагалища, полученных при иссечении ткани во время реконструктивно-пластических операций на тазовом дне или влагалищной гистерэктомии. Основную группу составили 40 пациенток с разными стадиями ПТО по классификации POP-Q (ПТО I — п=11; ПТО II — п=13; ПТО III — п=12; ПТО IV — п=4). Средний возраст пациенток данной выборки составил 54,3±1,6 лет (табл. 27). Пациентки с тяжелыми стадиями ПТО (III и IV по системе POP-Q) были старше пациенток с I и II стадиями заболевания. При этом достоверное различие в возрасте обнаружено только при сравнении группы пациенток III стадии ПТО с больными, имеющими I и II стадии заболевания (р 0,05).
Распределение пациенток в группах ПТО в зависимости от возрастного периода представлено в таблице 28.
Группы ПТО I — II стадий в большинстве случаев были представлены пациентками пременопаузального возрастного периода, тогда как в группы ПТО III - IV стадий с одинаковой частотой были включены женщины пременопаузального и постменопаузального возрастов. При этом достоверных различий между группами выявлено не было.
При морфологическом анализе тканей стенки влагалища пациенток с ПТО оценивались следующие параметры: состояние соединительнотканного компонента собственной пластинки эпителия, выраженность мышечного слоя стенки влагалища, состояние кровеносных сосудов собственной пластинки эпителия и адвентиции.
Результаты морфологического исследования представлены в таблице 29.
Морфологические изменения стенки влагалища у женщин с ПТО I и II стадий были выявлены во всех случаях и были сходными (рис. 10, 11). Наиболее часто отмечалось расширение просвета кровеносных сосудов (артериол и венул) собственной пластинки эпителия и адвентиции стенки влагалища. Этот признак наблюдался в 45,5±15,0% случаев. Соединительнотканный компонент собственной пластинки эпителия и мышечный слой стенки влагалища характеризовались компактным расположением волокон; разволокнение волокон соединительной ткани либо отсутствовало, либо было слабо выражено. В 36,4±14,5% случаев мышечный слой стенки влагалища был истончен. В то же время достоверных различий в частоте встречаемости исследуемых признаков выявлено не было.
Следует отметить, что выраженность патологических изменений соединительнотканного и мышечного компонентов стенки влагалища женщин определялась стадией ПТО. Достоверных отличий в зависимости от возрастного периода пациенток нами выявлено не было.
Таким образом, ПТО характеризутся определенными морфологическими изменениями стенки влагалища. Явления процессов деструкции соединительнотканного и мышечного компонентов стенки влагалища наблюдаются при всех стадиях заболевания. Наибольшая выраженность морфологических изменений тканей влагалища при ПТО поздних стадий указывает на постепенное их прогрессирование и необратимость.
Возможно, это объясняется недостаточной активностью репаративных процессов в тканях, что обуславливает несостоятельность ткани и, соответственно, уменьшение резистентности поддерживающих структур влагалища к действию механических факторов (например, возрастающего давления на стенки влагалища пролабируемых органов малого таза (мочевого пузыря, прямой кишки)). Очевидно, что триггерные механизмы развития ПТО могут быть различными, но при этом имеют общие последующие и завершающие этапы, морфологически проявляющиеся деструкцией соединительнотканных и мышечных компонентов, в частности, стенки влагалища и тазового дна.
Нарушение механических свойств соединительнотканного компонента, а также вероятное снижение тонуса и сократительной активности мышечного компонента стенок влагалища, обусловленные гистологическими изменениями, могут определять неэффективность классических методов оперативной коррекции ПТО и способствовать увеличению частоты рецидивов заболевания после реконструктивных операций с применением нативных тканей. Это необходимо принимать во внимание при выполнении реконструктивно-пластических операций. В то же время при выборе метода и вида оперативной коррекции ПТО важно учитывать, что компенсаторные возможности соединительной ткани зависят от активности ферментов, регулирующих процессы ее биосинтеза и регенерации.
Данное обстоятельство послужило основанием для проведения следующего этапа работы - изучения генетических маркеров активности ферментов метаболизма компонентов ЭЦМ соединительной ткани.
