Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Плацентарная недостаточнось и инфекция (обзор литературы) 11
1.1 Факторы врождённого иммунитета и инфекция при беременности 11
1.2 Синдром системного воспалительного ответа и беременность 19
1.3 Toll-подобные рецепторы у беременных высокого инфекционного риска 33
Глава 2 Материал и методы исследования 37
2.1. Материал исследования 37
2.2. Методы исследования 41
Глава 3 Общая клиническая характеристика обследованных беременных 52
3.1. Анализ соматического и акушерско-гинекологического анамнеза пациенток, вошедших в исследование 53
3.2. Акушерские и перинатальные исходы 64
3.3. Перинатальные исходы 68
Глава 4 Результаты исследования 71
4.1 Иммунологические критерии диагностики и прогнозирования ВУИ 71
4.2 Патогенетическая значимость полиморфизма генов цитокинов при инфекционно-воспалительных заболеваниях 82
4.3 Морфологические и иммуногистохимические особенности последа 89
4.3.1. Макроскопическая характеристика последов 89
4.3.2. Морфометрическое исследование последов 91
4.3.3. Иммуногистохимические особенности последа 94
Глава 5 Обсуждение полученных результатов 101
Выводы 121
Практические рекомендации 122
Список литературы 125
- Синдром системного воспалительного ответа и беременность
- Методы исследования
- Акушерские и перинатальные исходы
- Патогенетическая значимость полиморфизма генов цитокинов при инфекционно-воспалительных заболеваниях
Введение к работе
Актуальность проблемы
На сегодняшний день плацентарная недостаточность (ПН), осложняющая течение беременности, остаётся одной из ведущих проблем акушерства, приводя к увеличению таких грозных осложнений, как анте - и интранатальная гибель плода, младенческая заболеваемость и смертность, неблагоприятным отдалённым последствиям для ребёнка (K. Gibbons, 2011; А.Н. Стрижаков, 2012). Проблема же плацентарной недостаточности у беременных с неблагополучным инфекционно-воспалительным фоном и с последующей реализацией внутриутробной инфекции мало изучена, хотя именно при данном сочетании прогноз для плода и новорожденного является наиболее неблагоприятным (X.H. Tomai, 2011; M. Bolton, 2012).
Хроническая персистирующая инфекция в организме матери способствует постоянному поддержанию уровня внутрисосудистых гранулоцитов и моноцитов в активном состоянии (G. Sacks, 2010). Активация нейтрофилов, являющаяся одним из ключевых моментов в развитии воспалительного процесса, приводит к продукции цитокинов, множества цитотоксических молекул и угнетению процесса апоптоза. Цитотоксический потенциал нейтрофилов, которые наиболее быстро мобилизуются при развитии воспалительного ответа, в значительной степени обеспечивается активными формами кислорода (АФК). Привлекаемые цитокинами в инфицированные ткани циркулирующие нейтрофилы активируются при встрече с микроорганизмами, захватывают их в фагосомы, где последние подвергаются воздействию высоких концентраций АФК, а также антимикробных пептидов и ферментов.
В связи с достижениями иммунологии и расширением представлений о механизмах врожденного и приобретенного иммунитета в последнее десятилетие всё больший интерес исследователей привлекает изучение генетической основы индивидуальных различий иммунного ответа при инфекционно-воспалительных заболеваниях (А.С. Симбирцев, 2005; M.M. Wurfel et al., 2005; C.S. Parry, B.R. Brooks, 2008). Наиболее продуктивными в этом плане являются экспериментальные исследования различий реакции иммунной системы у особей с преобладанием ТЫ или Тh2-типа иммунного ответа, который, во многом, определяет клинико-морфологические и иммунологические особенности воспалительного процесса (B. Spellberg, J. Edwards, 2001; D.B. Tse, 2012). Уровень продукции различных цитокинов и чувствительность к иммунотропной терапии характеризуются выраженной индивидуальной вариабельностью, что может быть обусловлено генетической предрасположенностью и, в частности, функциональным аллельным полиморфизмом генов цитокинов.
В современной научной литературе имеются единичные исследования, посвящённые изучению клеточных и молекулярных механизмов в развитии ПН. Несмотря на большое количество работ, посвящённых данной проблеме, до настоящего времени нет чётких клинико-лабораторных критериев диагностики внутриутробной инфекции у данного контингента пациенток. Также недостаточно изучена роль противоинфекционной защиты в реализации внутриутробной инфекции. Этим объясняется актуальность поиска новых критериев диагностики внутриутробной инфекции у пациенток с плацентарной недостаточностью, основанного на изучении клеточных и молекулярно - генетических основ врождённого иммунитета.
Цель исследования Разработка критериев прогнозирования развития внутриутробной инфекции у новорожденных на основании комплексного клинико - иммунологического обследования беременных с плацентарной недо статочно стью.
Задачи исследования 1. Выявить особенности соматического и акушерско-гинекологического анамнеза у пациенток с плацентарной недостаточностью для определения
факторов риска развития внутриутробной инфекции.
Изучить особенности течения беременности и родов у пациенток с плацентарной недостаточностью, в зависимости от реализации внутриутробной инфекции у новорожденных.
Изучить параметры клеточного звена врождённого иммунитета у беременных с плацентарной недостаточностью и реализацией внутриутробной инфекции.
Изучить уровни про- и противовоспалительных цитокинов в крови у пациенток с плацентарной недостаточностью.
Исследовать прогностическую значимость полиморфизма генов цитокинов для выявления беременных высокого риска реализации задержки развития плода и внутриутробной инфекции.
Изучить морфологические и иммунногистохимические особенности последов пациенток с плацентарной недостаточностью с определением содержания TLRs и рецепторов цитокинов.
Разработать алгоритм диагностики внутриутробной инфекции у беременных с плацентарной недостаточностью с учётом особенностей врождённого иммунитета.
Научная новизна
Показано, что к факторам риска развития внутриутробной инфекции у пациенток с плацентарной недостаточностью следует относить: хронические заболевания мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит и цистит) и самопроизвольные выкидыши в анамнезе, ИЦН и многоводие во время данной беременности.
Впервые получены данные о высокой функциональной активности гранулоцитов у беременных с плацентарной недостаточностью и высоким инфекционным риском, свидетельствующей о системной активации врожденного иммунитета, при сниженной функции клеток пуповинной крови у новорожденных. Противоположная направленность изменений уровня индуцированной продукции фагоцитами активных форм кислорода у матери и плода может служить одним из предикторов внутриутробной инфекции.
Впервые установлена прогностическая значимость полиморфизма генов цитокинов (IL8: -251 A>T и IL10: -592 A>C) для выявления беременных с предрасположенностью к пониженной активации иммунной системы при воздействии инфекционных агентов.
На основании комплексного клинико-иммунологического и молекулярно-генетического исследований получены новые данные об ассоциации факторов врожденного иммунитета матери с развитием дыхательных нарушений у новорожденных.
Полученные данные расширяют представления о роли механизмов врождённого иммунитета в патогенезе плацентарной недостаточности.
Практическая значимость В результате проведенного исследования, был разработан алгоритм ведения пациенток, основанный на поэтапном клинико-лабораторном обследовании. Применение современных методов диагностики и прогнозирования плацентарной недостаточности позволит с ранних сроков гестации осуществлять тщательный клинико-лабораторный контроль за состоянием будущей матери и плода для своевременного выявления данной патологии. Обоснована целесообразность превентивного молекулярно- генетического обследования пациенток с плацентарной недостаточностью для оценки риска внутриутробной инфекции. Предложен индивидуальный подход к ведению пациенток с плацентарной недостаточностью, в зависимости от степени риска внутриутробной инфекции. Внедрение алгоритма диагностики данной патологии в практику акушерских стационаров и перинатальных центров позволит снизить частоту осложнений беременности, перинатальной заболеваемости и смертности.
Положения, выносимые на защиту 1. К факторам риска развития внутриутробной инфекции у пациенток с плацентарной недостаточностью следует относить: хронические заболевания мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит и цистит) и
самопроизвольные выкидыши в анамнезе, ИЦН и многоводие во время данной беременности.
При плацентарной недостаточности в 62,9 % случаев наблюдается активация механизмов врожденной иммунной системы. О высоком инфекционном риске для плода свидетельствует сочетание повышенной концентрации интерлейкина-8, высокого уровня индуцированной продукции активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови матери и сниженная функциональная активность клеток пуповинной крови, характеризующая слабый противоинфекционный иммунитет ребенка.
Молекулярно-генетическими предикторами реализации ВУИ у новорожденных является наличие генотипа Т/Т полиморфизма гена IL8: -251 A>T у матери. Наличие генотипа A/A полиморфизма гена IL10: -592 A>C у ребенка ассоциируется с повышением вероятности ВУИ при ПН, клиническим выражением которой является ЗРП, хроническая гипоксия плода.
Личный вклад автора Автор принимала непосредственное участие в выборе направления исследования, постановке задач, клиническом обследовании и лечении пациенток, в сборе биологического материала. Диссертантом проведен анализ медицинской документации, статистическая обработка и научное обобщение полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация работы Основные положения работы представлены на конференциях: IV Международной конференция по иммунотерапии (Москва, 2008г.),
Всероссийской научно-практической конференции «Амбулаторно- поликлиническая практика - платформа женского здоровья» (Москва, 2009), Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции», (Пермь, 2010), 15-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных (Пущино, 2011), 13-ом Международном конгрессе по репродуктивной иммунологии (Варна, 2012).
Обсуждение диссертации состоялось на конференции сотрудников акушерского обсервационного отделения (28 сентября 2012 года), заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (1 ноября 2012 года, протокол №15).
Внедрение результатов работы
Результаты проведённого исследования внедрены в практическую деятельность акушерского обсервационного отделения ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
По результатам исследования опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определённых ВАК.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 142 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 164 работы, в том числе - 27 отечественных и 137 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 19 таблицами.
Синдром системного воспалительного ответа и беременность
При снижении физиологического уровня АФК происходят изменения, приводящие к нарушению пролиферации клеток и защиты организма от инфекций. Запуск окислительно-восстановительной сигнализации происходит при нарушении баланса, либо при нарушении концентрации АФК [72; 109].
Плацентарный оксидативный стресс вносит вклад во многие осложнения беременности, включая выкидыш, преэклампсию и преждевременные роды [101; 130; 146].
Сейчас общепризнано, что АФК могут индуцировать спектр изменений, следующих от гомеостатической индукции ферментов к апоптотической клеточной гибели [2]. В работе ряда авторов показано, что при хориоамнионите активируется NADPH-оксидаза. Этот фермент продуцирует АФК и тесно связан с оксидативным стрессом. Маркёр окислительного стресса 4-гидрокси-2-ноненаль (HNE) повышает в плаценте уровень модифицированных белков, которые могут играть важную роль при преждевременных родах. Активность NADPH-оксидазы на поверхности цитоплазматической мембраны и ворсин трофобласта при хориоамнионите возрастает в 2 раза [156]. Ферментная активность появляется на плазматической и ворсинчатой мембранах, а также на фагосомальных мембранах и везикулярных и тубулярных структурах. Предполагают, что активность NADPH-оксидазы важна для защиты плаценты от инфекций [25; 56].
Продукты первичной альтерации и клетки-участники воспаления могут вызвать вторичное самоповреждение тканей. Существуют гуморальные и клеточные агенты вторичной альтерации [92]. При альтерации повреждаются не только клетки. Характерная реакция межклеточного матрикса на повреждение заключается в дезорганизации основного вещества соединительной ткани (лизисе протеогликанов и гиалуроновой кислоты). Ослабляются цементирующие свойства этих компонентов, повышается дисперсность межклеточных коллоидов и их гидрофильность. Увеличивается проницаемость основного вещества. Сходные изменения претерпевают коллагеновые и эластические волокна [137]. Большое значение при этом имеют ферменты, вырабатываемые фагоцитами, а также активированными фибробластами, синовиоцитами и некоторыми эпителиальными клетками. Коллаген деградирует под влиянием сериновых протеаз (плазмин, кининогеназы, катепсин G, эластаза нейтрофилов) и, особенно, при воздействии цинк-зависимых металлопротеаз (тканевой коллагеназы, расщепляющей волокнистый коллаген, желатиназы, разрушающей аморфный коллаген, в частности, базальных мембран, а также стромализинов, деградирующих аморфные коллагены, коллаген-ассоциированные адгезивные белки и протеогликаны). Большой вклад в это вносят химаза и триптаза тучных клеток. Многие цитокины (TNF, IL-1), факторы роста тромбоцитов, фибробластов, эпидермиса стимулируют лизис коллагена и аморфного вещества, а трансформирующий фактор роста Р и глюкокортикоиды ингибируют эти процессы [119]. В норме активность упомянутых 11 I IBИИИ и мммд литических ферментов минимальна и хорошо контролируется. Так, коллагеназы секретируются в форме неактивного профермента, а также сдерживаются тканевыми ингибиторами металлопротеаз. В острую фазу воспаления такие медиаторы, как гипохлорит и плазмин, активируют проколлагеназы, а продукция мезенхимальными клетками ингибиторов протеаз снижается. Деградация фибриллярного коллагена участвует в преждевременном разрыве фетальных оболочек. Ключевым ферментом, принимающим участие в обмене внеклеточного матрикса, служит матриксная металлопротеиназа-1 (ММР-1) [159].
Нарушение развития плаценты на ранних сроках беременности может привести к формированию плацентарного оксидативного стресса и в результате к привычной потере беременности, преэклампсии [86]. Возникновение и развитие осложнений беременности, таких как преэклампсия, ЗРП, хориоамнионита, могут быть опосредованы оксидативным стрессом, в значительной степени связанном, с повышением активности NADPH-оксидаз.
Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что ССВО у беременных объединяет многие патогенетические механизмы, приводящие. к активации процессов воспаления и изменению иммунного ответа [111]. Компоненты врождённого иммунитета не только участвуют в развитии беременности, но. и вносят большой вклад в патогенез целого ряда осложнений беременности. Понимание патофизиологических механизмов ССВО, действующих в системе «мать - плацента - плод», способствует совершенствованию методов диагностики и подбору патогенетически обоснованной терапии ряда акушерских осложнений.
На сегодняшний день, в результате целого ряда исследований, очевидной стала значимость вклада факторов врождённого иммунитета в поддержании репродуктивного здоровья женщины, наступлению и прогрессированию нормальной беременности, развитию эмбриона и плода, механизму родов [2; 30; 34].
Однако роль многих молекулярных механизмов остаётся мало изученной. Высокая социальная значимость проблемы как в акушерско-гинекологической практике, так и в рамках других медицинских специальностей стала огромным стимулом к её шивЕїншщв ннщінііі и t it t E EEU MMMHHKIE ишаиищ иишв ІІЕШИ изучению и разработке новых подходов к ранней диагностике и лечению. Лучшее понимание патофизиологических механизмов, действующих в системе мать плацента-плод, позволит, в конечном итоге, снизить частоту акушерских осложнений. Роль Toll-подобных рецепторов в период беременности изучена недостаточно. Рядом исследователей было установлено, что в норме при доношенной беременности, плацентарная ткань экспрессирует TLR1-10 на уровне мРНК. A TLR 2 и 4 экспрессируются на уровне протеинов, клетками синцитиотрофобласта и промежуточного трофобласта [91]. Вероятно клетки трофобласта взаимодействуют с микроорганизмами в зоне имплантации и способны к запуску иммунного ответа. В 2002г. Guleria I. и Pollard J.W. предположили возможность функционирования трофобласта, как активного участника системы врождённого иммунитета [83]. Плацента, выступая в роли высокоспециализированного барьера, оберегает плод от инфекционной агрессии. В I триместре в плаценте осуществляется экспрессия TLR2 и 4 на очень высоком уровне ворсинчатым цитотрофобластом и клетками вневорсинчатого трофобласта [122].. В отличие от наружного слоя трофобласта, не экспрессирующего рецепторы на протяжении I триместра. Таким образом, только патогенные микроорганизмы, преодолевшие клетки синцитиотрофобласта и достигшие децидуальной оболочки, представляют угрозу для плода. А условно-патогенные бактерии, не способные пройти через TLR негативный слой клеток синцитиотрофобласта, остаётся интактным. TLR 2 и 4 экспрессируются как на клеточной поверхности, так и внутриклеточно. Причём последние располагаются преимущественно с материнской стороны, вероятно, для более быстрого иммунного ответа на инфекционную агрессию, исходящую от матери [39]. Активация TLR4 липополисахаридом (ЛПС) бактерий в I триместре приводит к увеличению , синтеза про- , и противовоспалительных цитокинов клетками цитотрофобласта и ворсинчатого трофобласта [163]. При активации TLR2 пептидогликаном увеличивается уровень IL-6 и 8. При этом уровень других цитокинов остаётся неизменным, либо снижается. Реализация эффекта осуществляется путём запуска апоптоза клеток трофобласта, наблюдаемого при многих осложнениях беременности [30; 31].
Методы исследования
Продукция АФК фагоцитами крови является критическим иммунным фактором защиты против микроорганизмов. Нами определен повышенный уровень генерации АФК клетками в крови матерей и пониженный - в крови новорожденных при внутриутробном инфицировании плода. У детей при гипотрофии без реализации инфекции также отмечено снижение продукции АФК, но количественно оно было менее выражено. В литературе имеются сведения о том, что гранулоциты новорожденных с более высоким весом и гестационным возрастом при индукции генерировали более высокие уровни АФК [161]. Возможно, незрелостью новорожденных с гипотрофией можно объяснить сниженную функциональную активность их гранулоцитов.
Более низкий уровень спонтанной и индуцированной продукции АФК у новорожденных от матерей с высоким уровнем активности фагоцитов может свидетельствовать о сниженной способности ответить на инфекцию или воспаление, с которой связана их повышенная чувствительность к инфекции.
Таким образом, получены данные, позволяющие сделать заключение о снижении функциональной активности гранулоцитов новорожденных, родившихся у матерей высокого инфекционного риска с повышенной активацией иммунной системы. Обнаружение высокого уровня индуцированной продукции АФК у матери и низкого в пуповинной крови может служить предиктором ВУИ.
Было проведено количественное определение уровня про , и противовоспалительных цитокинов в сыворотке беременных. Были получены данные о достоверном увеличении уровня интерлейкина-8 и интерлейкина-6 в сыворотке беременных, родивших детей с последующей реализацией ВУИ. т. Учитывая вышесказанное, представляло особый интерес дальнейшее изучение вклада факторов врождённого иммунитета в реализации ПН и ВУИ, посредством проведения молекулярно-генетического исследования полиморфных вариантов генов цитокинов и ряда их рецепторов.
Исследование генов, контролирующих активность цитокинов, являющихся медиаторами воспаления, — одна из важных задач в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения заболеваний, выявление на ранних сроках предрасположенности к ним. Знание их роли в патогенезе многих заболеваний позволяет, с одной стороны, прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее течения, с другой, — индивидуально подобрать специфическую терапию для конкретного пациента.
Для изучения вклада генотипа матери и ребенка в реализацию инфекционно-воспалительных заболеваний новорожденных были обследованы 287 пар «мать новорожденный ребенок». Мы провели исследование распределения аллелей и генотипов следующих полиморфных локусов генов цитокинов у матерей и их новорожденных детей: CD14-260 (-159) ОТ, IL6 174 OG,ESRl PvuII -397 Т С, IL8-251 А Т, ESR1 Xbal, TGFB -509 ОТ, IL10 -592 А/С, TLR9 -1486 Т С, ILIA -889 ОТ, VEGFA -2578 А-С, IL1B-31 Т С, VEGFA -634 G-C, IL1R1390 Т С (Serl30Ser) [11100 mspl], VEGFA 936 ОТ, IL1B 3953 (3954) ОТ, IL1R1 -15858 ОТ [Pstl 1970], TNF -308 G A, TNF -238 G A, IL4 -590 ОТ, IL4 -33 ОТ, IL4R 1902 A G (Gln576Arg), IL6R1510 (1073) A C (Asp358Ala).
Во всех случаях распределение генотипов подчинялось закону Харди-Вайнберга. Закон Харди-Вайнберга (известный также как закон генетического равновесия) - закон популяционной генетики, устанавливающий соотношение между частотами генов и генотипов в популяции со свободным скрещиванием.
Закон утверждает, что при соблюдении следующих условий (условия применимости закона Харди-Вайнберга): 1. численность популяции диплоидных организмов настолько велика, что можно пренебречь случайными флуктуациями частот генов (генетико-автоматические процессы, т.е. колебания частот аллелей имеют несистематический эффект и описываются вероятностными законами); 2. в популяции не происходят новые мутации по изучаемому гену; 3. в популяции отсутствует миграция особей; 4. в популяции отсутствует отбор по исследуемым генотипам; при двухаллельном полиморфизме частоты генотипов в популяции остаются одинаковыми из поколения в поколение и удовлетворяют соотношению Харди — Вайнберга: p2+2pq+ q2=l, где р и q— частоты соответствующих аллелей. При соблюдении сформулированных выше условий соотношение будет оставаться постоянным из поколения в поколение, независимо от изменения численности популяции и от величины р и q. Благодаря этому закону, можно сильно упростить описание популяционно-генетических процессов, уменьшив число необходимых параметров. Сопоставление фактически наблюдаемых частот I генотипов с теоретически ожидаемыми по закону Харди — Вайнберга позволяет оценить частоты аллелей, оценить влияющие на них факторы и получить количественные характеристики отбора, неслучайности скрещивания, миграции, случайных флуктуации и т.п.
Был проведен анализ ассоциаций генотипов и основных осложнений раннего неонатального периода. Отдельно анализировали генотип матери и ребенка.
При анализе распределения генотипов было выявлено, что пневмония чаще развивалась у детей, рожденных от матерей с генотипом Т/Т полиморфизма гена IL8: -251 А Т (OR=2,6 (1,2-5,8), р=0,022), при этом влияние генотипа самого ребенка выявлено не было. Данная ассоциация наблюдалась как среди доношенных, так и среди недоношенных детей, а наличие генотипа IL8: -251 Т/Т у матери не было связано со сроками родоразрешения, что может являться косвенным подтверждением влияния материнского генотипа на особенности развития иммунной системы у ребенка.
Акушерские и перинатальные исходы
Однако, при анализе в сыворотке крови уровня IL6 - мощного провоспалительного цитокина - выявлено снижение его уровня в кровотоке у пациенток с генотипом IL10: 592 А/А (р=0,05).
При исследовании пуповиннои крови наличие генотипа IL10: 592 А/А у ребенка ассоциировалось с ПН и ЗРП (85,7% против 32,6% при других генотипах, OR=12,4 (1,7-89,9), р=0,007). Соответственно чаще наблюдалась хроническая гипоксия плода (71,4% против 17,6%, OR=ll,7 (2,5-55,8), р=0,003). Влияния материнского генотипа на возникновение данной патологии выявлено не было. Ряд авторов, исследовавших уровни IL-10 в пуповиннои крови, указывают на достоверно более низкий уровень данного противовоспалительного цитокина в кровотоке новорожденных с ЗРП [36; 84; 123]. Vural Р. и соавт. (2010г.), напротив, указали зависимость выявления полиморфизма гена IL-10 с повышением его продукции и развития преэклампсии [157].
Учитывая предрасположенность носителей генотипа IL10: 592 А/А к снижению воспалительного ответа, ожидалось повышение вероятности ВУИ при наличие данного генотипа у ребенка. Указанная тенденция действительно наблюдалась (28,6% против 10,4%), но не достигала статистической значимости (р=0,173). Учитывая приведенные выше данные о связи генотипа А/А с плацентарной недостаточностью, была проанализирована ассоциация ВУИ, ПН и генотипа IL10: 592 А/А у ребенка.
Влияние генотипа А/А с ВУИ прослеживалось у детей, рожденных у матерей с ПН, тогда как при отсутствии ПН частота ВУИ оставалась низкой при всех генотипах.
В нашей работе была прослежена зависимость частоты выявления ВУИ у новорожденных детей от наличия полиморфизма IL8 у их матерей и полиморфизма IL10 у самих новорожденных в основной группе, что косвенно указывает на самостоятельную возможность плода внутриутробно влиять на течение и исход беременности. Это позволяет использовать ранний генетический скрининг как среди беременных, входящих в группу высокого риска по развитию ПН и реализации ВУИ, так и среди их новорожденных детей. Принципиальной особенностью данного метода является возможность ранней (дородовой) диагностики, что позволяет вовремя провести профилактические мероприятия. Также немаловажно, что исследование крови матери является неинвазивной процедурой для плода. Вышеизложенное определяет диагностическую значимость генетического тестирования для снижения риска инфекционных осложнений у новорожденных и обосновывает перспективность дальнейших исследований в этой области для поиска новых генетических маркеров.
Учитывая вышесказанное, представляло особый интерес дальнейшее изучение вклада факторов врождённого иммунитета в реализации ПН и ВУИ, посредством проведения морфологического и иммунногистохимического исследования последов.
Иммунобиологические особенности плаценты можно рассматривать с двух позиций: в связи с проблемой взаимоотношений плода и матери и иммунологической защитой плода от инфекций в системе мать-плацента-плод. Рядом исследователей было показано, что плацентарная ткань при доношенной беременности экспрессирует TLR 1-10 на уровне мРНК. Эти исследования позволяют предположить возможность взаимодействия клеток трофобласта с микроорганизмами в зоне имплантации и инициирования иммунного ответа. В процессе распознавания и ответа на компоненты микроорганизмов клетки плаценты функционируют так же, как и клетки системы врождённого иммунитета. Клетки врождённого иммунитета важны при нормальной беременности для обеспечения успешной имплантации и для разрешения инфекции в зоне контакта мать-плод, однако те же лейкоциты могут способствовать развитию ряда осложнений беременности. Стимуляция TLR-3 HTLR-4 В клетках трофобласта приводит к увеличению продукции хемокинов и миграции иммунных клеток, таким образомтрофобласт может инициировать мощный воспалительный ответ. Функция TLR в трофобласте позволяет координировать местный иммунный ответ, способствовать клеточной инвазии и формированию плаценты, однако при этом TLR-опосредованное распознавание плацентой «сигналов опасности» и последующие изменения в иммунном ответе могут иметь катастрофические последствия для беременности.
При макроскопической характеристике последов основной группы выявленные изменения были неспецифическими. Массы последов на ранних сроках беременности в этой группе были выше средней статистической нормы, а в более поздние сроки оказывались ниже нормы.
При гистологическом исследовании в большей степени выявлены черты хронического воспаления. Сосуды значительной части ворсин были утолщены, просвет их сужен, частью облитерирован. Встречались также крупные незрелые ворсины, в которых отсутствовали сосуды, а строма была представлена грубоволокнистой соединительной тканью. Кроме того, в ворсинчатом хорионе определялись крупные конгломераты ворсин разных размеров, иногда спаянные фибрином. В таких ворсинах отмечались некробиотические изменения.
Морфометрическое исследование последов 1А подгруппы выявило значительные изменения ворсинчатого хориона с прогрессирующим течением виллузита, наличием в строме лимфоцитарной инфильтрации, выраженной фибробластической реакции. В оболочках лимфогистио-цитарные инфильтраты, расположенные интрамурально в периваскулярной зоне, очаговые инфильтраты- в периваскулярной ткани корневых ворсин. В инфильтратах лимфоидные элементы, плазмациты и полиморфноядерные лейкоциты. Характерным было утолщение стенок как мелких, так и крупных сосудов ворсин с сужением и облитерацией их просветов. Кроме того, были выражены воспалительные изменения, а также отложения фибрина в интервиллёзном пространстве. В ворсинчатом хорионе выявлено высокое содержание бессосудистых ворсин (в среднем 48%). Развитие синцитиальных узлов было более значительным в центральных участках. Более высоким было и содержание клеток Лангханса. Оба эти факта свидетельствуют о гипоксии в наиболее активных участках плаценты и позволяют говорить о субкомпенсированной форме ПН. Исход же для детей обусловлен в этих случаях не только состоянием плаценты, но и наличием у них ВУИ.
Патогенетическая значимость полиморфизма генов цитокинов при инфекционно-воспалительных заболеваниях
Учитывая вышесказанное, представляло особый интерес дальнейшее изучение вклада факторов врождённого иммунитета в реализации ПН и ВУИ, посредством проведения морфологического и иммунногистохимического исследования последов.
Иммунобиологические особенности плаценты можно рассматривать с двух позиций: в связи с проблемой взаимоотношений плода и матери и иммунологической защитой плода от инфекций в системе мать-плацента-плод. Рядом исследователей было показано, что плацентарная ткань при доношенной беременности экспрессирует TLR 1-10 на уровне мРНК. Эти исследования позволяют предположить возможность взаимодействия клеток трофобласта с микроорганизмами в зоне имплантации и инициирования иммунного ответа. В процессе распознавания и ответа на компоненты микроорганизмов клетки плаценты функционируют так же, как и клетки системы врождённого иммунитета. Клетки врождённого иммунитета важны при нормальной беременности для обеспечения успешной имплантации и для разрешения инфекции в зоне контакта мать-плод, однако те же лейкоциты могут способствовать развитию ряда осложнений беременности. Стимуляция TLR-3 HTLR-4 В клетках трофобласта приводит к увеличению продукции хемокинов и миграции иммунных клеток, таким образомтрофобласт может инициировать мощный воспалительный ответ. Функция TLR в трофобласте позволяет координировать местный иммунный ответ, способствовать клеточной инвазии и формированию плаценты, однако при этом TLR-опосредованное распознавание плацентой «сигналов опасности» и последующие изменения в иммунном ответе могут иметь катастрофические последствия для беременности.
При макроскопической характеристике последов основной группы выявленные изменения были неспецифическими. Массы последов на ранних сроках беременности в этой группе были выше средней статистической нормы, а в более поздние сроки оказывались ниже нормы.
При гистологическом исследовании в большей степени выявлены черты хронического воспаления. Сосуды значительной части ворсин были утолщены, просвет их сужен, частью облитерирован. Встречались также крупные незрелые ворсины, в которых отсутствовали сосуды, а строма была представлена грубоволокнистой соединительной тканью. Кроме того, в ворсинчатом хорионе определялись крупные конгломераты ворсин разных размеров, иногда спаянные фибрином. В таких ворсинах отмечались некробиотические изменения.
Морфометрическое исследование последов 1А подгруппы выявило значительные изменения ворсинчатого хориона с прогрессирующим течением виллузита, наличием в строме лимфоцитарной инфильтрации, выраженной фибробластической реакции. В оболочках лимфогистио-цитарные инфильтраты, расположенные интрамурально в периваскулярной зоне, очаговые инфильтраты- в периваскулярной ткани корневых ворсин. В инфильтратах лимфоидные элементы, плазмациты и полиморфноядерные лейкоциты. Характерным было утолщение стенок как мелких, так и крупных сосудов ворсин с сужением и облитерацией их просветов. Кроме того, были выражены воспалительные изменения, а также отложения фибрина в интервиллёзном пространстве. В ворсинчатом хорионе выявлено высокое содержание бессосудистых ворсин (в среднем 48%). Развитие синцитиальных узлов было более значительным в центральных участках. Более высоким было и содержание клеток Лангханса. Оба эти факта свидетельствуют о гипоксии в наиболее активных участках плаценты и позволяют говорить о субкомпенсированной форме ПН. Исход же для детей обусловлен в этих случаях не только состоянием плаценты, но и наличием у них ВУИ.
Иммуногистохимическое исследование 5 маркеров было проведено на 74 плацентах (подгруппы: 1А п=15, 1Б n=14, 2А n=21, 1А п=24). Интенсивность реакций с антигенами, локализованными в цитоплазме и на мембранах клеток, оценивали полуколичественным способом по бальной шкале от 0 (отсутствие реакции) до 8 (выраженная реакция) баллов. Окрашенные клетки включали цитотрофобласты, синцитиотрофобласты, эндотелий сосудов, строму и макрофаги. Средние значения TLR-9 иммунореактивных клеток были значительно выше в цитотрофобласте у пациенток 2А подгруппы. Уровень TLR-9 иммунореактивных клеток в 2Б подгруппе контроля был ниже во всех анализируемых зонах.
Средние значения TLR-2 иммунореактивных клеток был выше в синцитиотрофобласте у пациенток 2А подгруппы, чем у пациенток 1А и 1Б подгрупп. В 1Б подгруппе - оставался на уровне показателей контрольной 2Б подгруппы, а в макрофагах, ниже уровня контроля. , По данным Canavan Т.Р. и соавт. (2007г.) децидуальные клетки в ответ ;на воздействие ЛПС и мукопептида отвечают стимуляцией производства IL-8 [47]. В нашем исследовании среди пациенток с высоким инфекционным индексом и реализацией ВУИ у новорожденных, независимо от наличия ПН, также отмечался более высокий уровень окраски рецепторов IL-6. Средние значения интенсивности окраски рецепторов к IL-6 были значительно выше в 1А подгруппе в цито- и синцитиотрофобласте, эндотелии сосудов, макрофагах, в 2А подгруппе были ниже, однако оставались высокими. Уровень интенсивности окраски рецепторов к IL-6 иммунореактивных клеток во 2Б подгруппе контроля был ниже во всех анализируемых зонах. Интересным представляется высокий уровень интенсивности окраски рецепторов к IL-10 в цито- и синцитиотрофобласте, эндотелии сосудов и макрофагах в 1А и 1Б подгруппах с ПН. Тогда как уровень интенсивности окраски рецепторов к IL-10 в 2А подгруппе был близок к 2Б подгруппе контроля.
