Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль молекулярно-генетических механизмов в формировании бесплодного брака (обзор литературы) .
1.1.Социально-экономическое значение бесплодного брака
1.2. Генетические основы формирования бесплодного брака .
1.3.Влияние факторов эндо- и экзогенной интоксикации на репродуктивный потенциал женщин 1.4. Роль генов детоксикации в формировании патологии репродуктивной системы
Глава 2. Материал и методы исследования .
2.1. Дизайн исследования
2.2. Клиническая характеристика исследуемых групп
2.3. Методы исследования .
2.3.1 Клинические методы
2.3.2 Лабораторные и инструментальные методы
2.3.3 Молекулярно-генетические методы исследования .
2.3.4 Характеристика изучаемых генов и их полиморфных вариантов .
2.3.5 Цитогенетические исследования .
2.3.6 Исследование эндотоксикоза .
2.3.7 Исследование уровней общего и эндотелиального оксида азота .
2.4 Методы статистической обработки результатов исследования
Глава 3. Результаты собственных исследований. Особенности молекулярно-генетических механизмов регуляции системы детоксикации у пациенток с бесплодием неясного происхождения
3.1. Особенности распределения генетических мутаций в генах второй фазы детоксикации у пациенток с бесплодием неясного генеза и у фертильных пациенток .
3.2. Особенности распределения генетических полиморфизмов в генах второй фазы детоксикации у пациенток с первичным и вторичным бесплодием
3.3. Биохимические показатели и уровень эндотоксикоза у пациенток исследуемых групп
3.4. Показатели эндотоксикоза в зависимости от генотипа пациенток
3.5. Оценка роли полиморфизмов гена NOS3 при бесплодии неясного генеза и их фенотипических проявлений .
3.6. Цитогенетические особенности супружеских пар, страдающих бесплодием неясного генеза
Глава 4. Алгоритм обследования пациенток с бесплодием неясного генеза .
Обсуждение результатов работы
Выводы .
Практические рекомендации
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
- Генетические основы формирования бесплодного брака
- Роль генов детоксикации в формировании патологии репродуктивной системы
- Молекулярно-генетические методы исследования
- Биохимические показатели и уровень эндотоксикоза у пациенток исследуемых групп
Введение к работе
Актуальность проблемы
По данным ВОЗ частота бесплодных браков колеблется в широких пределах и в последние годы не имеет тенденции к снижению во всех государствах мира. Наша страна не является исключением из этого печального правила. Частота бесплодных браков в разных регионах России составляет от 8 до 20%, оказываясь более высокой в крупных городах (Кулаков В.И., 2005).
В значительной части случаев, несмотря на применение регламентированных нормативными документами Минздрава России методов исследования, так и не удается выявить причины данной патологии. Углубленный анализ факторов, вызывающих бесплодный брак, показывает, что частота «бесплодия неясного генеза» в структуре всего бесплодия занимает немалую долю, составляя около 15%. Данная группа пациентов представляет собой весьма сложный контингент больных, что связано с отсутствием у них явных причин нарушения репродуктивной функции.
Одним из наиболее перспективных направлений научного поиска в последние годы стало изучение фундаментальных молекулярно-генетических механизмов формирования патологии вообще, и репродуктивной системы в частности. По мнению Баранова В.С. (2009), стратегическую основу нового, быстро развивающегося направления в медицине, получившего название предиктивная медицина, составляет исследование межгенных и ген-средовых взаимодействий.
Ассоциация генов, регулирующих процессы детоксикации, с патологией репродуктивной системы (эндометриоз, онкопатология репродуктивной системы, акушерские осложнения) установлена в ряде исследований (Адамян Л.В., 2007; Иващенко Т.Э. и соавт., 2006; Корчагина Р.П. и соавт. 2011; Sata F. et al 2003; Coller G.K. 2011). Существуют данные нескольких научных работ, свидетельствующих о возможной роли некоторых генов детоксикации в патогенезе бесплодия, выявлена положительная корреляция между мутациями в этих генах и вторичным трубно-перитонеальным бесплодием, бесплодием, ассоциированным с эндометриозом, мужским бесплодием (Исхакова Г.М. и соавт. 2006; Рутинский А.И. 2013; Lakpour N. 2013). Однако роль этих генов при бесплодии неясного генеза не изучалась.
Существенный интерес представляет изучение не только различных групп генов по отдельности, но и межгенные взаимодействия, выявление наиболее неблагоприятных сочетаний генов. Весомым подтверждением роли генетических полиморфизмов и генных сетей в генезе идиопатического бесплодия должна стать оценка биохимического фенотипа пациенток с данной патологией, т.е. изучение уровня эндотоксикоза, так как ферменты, регулируемые генами детоксикации, отвечают за нейтрализацию экзо- и эндотоксических веществ. В связи с этим в нашей научной работе мы поставили перед собой следующие цель и задачи.
Цель исследования -
оптимизация алгоритма обследования пациентов с бесплодием неясного генеза на основе изучения полиморфизмов генов системы детоксикации и их фенотипических проявлений для повышения обоснованности принятия тактических решений при идиопатическом бесплодии.
Задачи исследования:
-
Провести клинико-статистический анализ акушерско-гинекологического анамнеза и соматического статуса пациенток исследуемых групп.
-
Выяснить частоту встречаемости полиморфизмов генов детоксикации и дисфункции эндотелия, цитогенетическую феноменологию в исследуемых группах.
-
Изучить особенности биохимического профиля, уровня эндогенной интоксикации у пациенток исследуемых групп.
-
Модифицировать алгоритм обследования пациентов с бесплодием неясного генеза на основе полученных данных.
Научная новизна
В данной работе впервые подробно изучена роль полиморфных вариантов генов детоксикации и генов дисфункции эндотелия при бесплодии неясного генеза. Впервые выявлено, что наличие аллелей G в 415 положении гена EPHX1 и аллеля А в 460 положении гена ТРМТ являются прогностически неблагоприятными в отношении развития данного вида бесплодия. Причем, их негативное действие реализуется в основном при гомозиготном генотипе, а в гетерозиготном варианте эти полиморфизмы фенотипически не проявляются.
Впервые показано, что полиморфный аллель 238C гена ТРМТ чаще встречается у женщин с ненарушенной фертильностью, что свидетельствует об его протективном эффекте в отношении развития бесплодия.
Установлены взаимосвязи некоторых полиморфизмов генов и их сочетаний с биохимическим фенотипом пациенток с идиопатическим бесплодием. Полученные данные могут стать базой для разработки и научного обоснования новых патогенетических моделей формирования данной патологии, методов ее коррекции, внесения изменений в нормативные документы, регламентирующие ее диагностику.
Практическая значимость
В практической работе врача акушера-гинеколога необходимо учитывать возможную роль нарушений в системе детоксикации при идиопатическом бесплодии. Разработан модифицированный алгоритм обследования женщин с бесплодием неясного генеза, включающий исследование факторов регулирующих работу данной системы, и анализ биохимического фенотипа при наличии полиморфизмов в генах детоксикации.
Показана целесообразность обязательного проведения цитогенетического анализа в супружеских парах, страдающих идиопатическим бесплодием.
Внедрение результатов исследования
Результаты научного исследования внедрены в клиническую практику ФГБУ «Уральский НИИ охраны материнства и младенчества» Минздрава России, МГБУ «Клинико-диагностический центр охраны здоровья матери и ребенка» Минздрава Свердловской области, МУЗ ГКБ № 14 Управления здравоохранения администрации города Екатеринбурга. Материалы диссертации используются в преподавании на кафедре акушерства и гинекологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Апробация работы
Положения диссертации были представлены на следующих конференциях, конгрессах и форумах: Республиканская научно-практическая конференция «Инновационные технологии в охране здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2012г.); научно-практическая конференция молодых ученых «Репродуктивная медицина. Взгляд молодых» (Санкт-Петербург, 2013г.); XIV Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (два доклада) (Москва. 2013г.); а также на совместном заседании кафедр акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, акушерства и гинекологии №1 и №2 ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Казань, 2014).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 2 рисунка. Диссертация состоит из введения, 4 глав: обзор литературы, материалы и методы, две главы с изложением результатов собственных исследований; обсуждение полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 168 источников, из которых 79 зарубежных и 89 отечественных.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Ряд полиморфных вариантов генов и их сочетаний, регулирующих процессы детоксикации, достоверно чаще встречаются у пациенток, страдающих бесплодием неясного происхождения, что подтверждает их роль в генезе данной патологии.
-
Фенотипические проявления особенностей молекулярно-генетического статуса, пациенток с идиопатическим бесплодием, сводятся к повышению уровня общей интоксикации, изменению ряда биохимических параметров крови.
-
Правило прогноза роли полиморфных вариантов генов детоксикации с чувствительностью 74,3% и специфичностью 70,7% позволяет предсказать их значение в этиопатогенезе бесплодия неясного происхождения.
Генетические основы формирования бесплодного брака
Проблема бесплодного брака неизменно привлекает пристальное внимание не только специалистов, но и широкого круга общественности. Присуждение Нобелевской премии в области физиологии и медицины разработчикам метода экстракорпорального оплодотворения, ставшего наиболее эффективным методом преодоления бесплодия в браке, является лишь одним из немногих подтверждений этого факта. По данным ВОЗ частота бесплодных браков колеблется в широких пределах и не имеет тенденции к снижению во всех странах мира, несмотря на достижения современной науки. Интерес к проблеме бесплодия значительно возрос в последние 2 десятилетия в связи с прогрессирующими неблагоприятными демографическими сдвигами – снижением рождаемости и индекса здоровья женщин, а также увеличением числа бесплодных браков. Частота бесплодных браков в разных странах мира колеблется от 8 до 29% [7, 13, 17, 59, 116].
В России депопуляционные процессы оказались выражены особенно сильно. В 1991г. впервые в истории страны смертность превысила рождаемость. Возникший демографический кризис не преодолен вплоть до настоящего времени. Уровень рождаемости в нашей стране в 1,5-2 раза ниже, чем требуется для простого воспроизводства населения. При этом в стране зарегистрировано 6,5 млн. женщин, страдающих бесплодием. Частота бесплодных браков в разных регионах России составляет от 8 до 19%, оказываясь более высокой в крупных городах. Показатель частоты бесплодных браков в 15% считается демографически критическим. Такой его уровень рассматривается не только как серьезная проблема для здравоохранения, но и системная проблема национальной безопасности. Бесплодие является тяжелым состоянием, нарушающим социальную и психологическую адаптацию человека, влияющим на его здоровье и качество жизни. Причем, психологическое неблагополучие, вызванное бесплодием, независимо от того, женское оно или мужское, у женщин выражено сильнее. Для них характерно чувство вины, тревога, раздражительность, сексуальные расстройства. Некоторые исследователи, кроме того, утверждают, что продолжительность жизни у бесплодных женщин существенно меньше, чем у фертильных женщин, имеющих 2-3 детей [13, 27, 33, 41, 43, 44, 52, 58, 59, 88, 127, 134, 140].
Согласно определению ВОЗ (1993) бесплодным считают брак, при котором у женщины детородного возраста не наступает беременность в течение года регулярной половой жизни без применения контрацептивных средств [70].
Различают следующие формы женского бесплодия: - первичное бесплодие – отсутствие беременности в анамнезе; - вторичное бесплодие – устанавливают при наличии беременности в прошлом; - абсолютное бесплодие – возможность возникновения беременности естественным путем полностью исключена (при отсутствии матки, яичников, маточных труб, аномалиях развития половых органов); - относительное бесплодие – сохранение фертильности до вступления в брак и после его расторжения, но невозможность иметь детей именно в рассматриваемом браке. Согласно недавним исследованиям доли пациенток с первичным и вторичным бесплодием среди инфертильных женщин составляют соответственно 60% и 40% [13].
Согласно приказу Минздрава России № 572н от 12 ноября 2012 г. «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «Акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» обследование супружеской пары при бесплодии включает в себя следующее:
Инфекционный скрининг: бактериоскопическое и бактериологическое исследование содержимого заднего свода влагалища и цервикального канала шейки матки, молекулярно-генетический метод ПЦР для выявления хладимийной, микоплазменной, герпес- и цитомегаловирусных инфекций, микробиологическое исследование отделяемого женских половых органов на уреаплазму. 6. Мазок на онкоцитологию с шейки матки. 7. Определение уровня гормонов сыворотки крови: фолликулостимулирующего (ФСГ), лютеонизирующего (ЛГ), тиреотропного (ТТГ), свободного тироксина (СТ4), антимюллерового (АМГ), ингибина В (инг В), эстрадиола (Е2), прогестерона (П), пролактина (ПРЛ), 17-гидроксипрогестерона (17-ОН-ПРГ), тестостерона (Т), дегидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАс). 8. Гистеросальпингография (ГСГ).
Цитогенетическое исследование (оценка кариотипа супружеской пары) в обязательный перечень обследований при бесплодии не включено и проводится по показаниям [54].
Лапароскопия, относящаяся к лечебно-диагностическим методам, также выполняется по показаниям [13, 54, 70].
Выделяют следующие группы этиологических факторов бесплодия: - трубно-перитонеальное (20-40%); - эндокринное (25-40%); - маточные формы бесплодия (5%); - бесплодие в результате эндометриоза (5-15%); - шеечные факторы (4-5%); - мужское бесплодие (в 40% случаев причиной бесплодия является мужской фактор, в 5-10% случаев имеет место сочетание мужского и женского факторов) [13, 61].
Во многих руководствах также выделяют иммунологическое бесплодие, обусловленное антиспермальными антителами. Однако согласно имеющимся на сегодняшний день данным можно утверждать, что выявление антиспермальных антител не ассоциируется с бесплодием, и не имеет клинической значимости [13].
В ряде случаев, несмотря на использование современных, изощренных методов диагностики, установить причину бесплодия не удается. Анализ факторов, вызывающих бесплодный брак, показал, что частота «бесплодия неясного генеза» в структуре всего бесплодия занимает около 6-17% (в среднем 8-10%). 30-40 лет назад диагноз «Необъяснимое бесплодие» ставился примерно половине супружеских пар, однако по мере развития диагностических возможностей этот показатель неуклонно снижается [17, 61, 89].
Роль генов детоксикации в формировании патологии репродуктивной системы
Перечень исследуемых генов и их полиморфных вариантов, используемых в работе представлены в таблице 8. Молекулярно-генетическое исследование, указанных выше полиморфных вариантов генов, проводилось методом пиросеквинирования с применением системы генетического анализа серии PyroMark Q24. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови, используя комплект реагентов «ДНК-сорб-В» производства ФГУН «Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора». Далее проводились реакция аплификации с помощью комплекта праймеров Ампли Сенс Пироскрин производства ФГУН «Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» с последующей инкубацией ампликонов с частицами сефарозы, покрытыми стрептовидином. С использованием полуавтоматической вакуумно-фильтрационной станции (Vacuum Prep Work station) проводилась щелочная денатурация ампликонов и серия отмывок с образованием одноцепочечного ПЦР-продукта, используемого как матрица для пиросеквинирующего синтеза. Впоследствии проводилась реакция пиросеквинирования и анализ полученных результатов. Детекция реакции пиросеквинирующего синтеза проводилась автоматически в режиме реального времени с помощью пиросеквинатора серии PyroMark Q24.
Ген EPHX1 кодирует фермент митохондриальную эпоксигидролазу. Этот ген локализован на хромосоме 1 в локусе 1q42.1 и состоит из 9 экзонов, разделенных 8 интронами [12]. Фермент микросомальная эпоксидгидролаза гидрирует монозамещенные, 1,1-дизамещенные и цис-1,2-дизамещенные эпоксиды и эпоксиды на циклических системах. Она инактивирует эпоксиды после ферментов 1-й фазы. Этот фермент катализирует трансформацию многих реактивных и специфических эпоксидов в дигидродиолы, которые для многих соединений являются неактивными. Но в некоторых случаях, например, для ПАУ, после реакции, катализируемой эпоксидгидролазой, напротив, образуются особо опасные эпоксид-дигидродиолы. Поэтому в отношении некоторых токсикантов эпоксидгидролаза играет протективную роль, в других же случаях она потенцирует вредное воздействие экзогенных веществ [109, 159].
Помимо участия в процессах биотрансформации экзогенных токсикантов, существуют и некоторые эндогенные функции эпоксидгидролазы, такие как транспортировка желчных кислот, взаимопревращение витамина К и его эпоксида, метаболизм эндогенных стероидных эпоксидов, участие в сигнальных процессах [109].
Эпоксидгидролаза экспрессируется в большинстве тканей и органов – в печени, мозге, почках, легких, кишечнике, половых железах. Уровень экспрессии значительно варьируется в зависимости от типа органов и тканей [103, 109].
Описано несколько полиморфизмов в гене EPHX1, которые изменяют ферментативную активность. Наиболее значимы замены в 3 и 4 экзоне гена EPHX1: мутация T337C (Tyr113His) - «медленный» аллель S, мутация A415G (his139Arg) – «быстрый» аллель F [90]. «Медленный» аллель снижает активность фермента на 40-50% у гомозигот и на 25% у гетерозигот, а «быстрый» повышает ее на 25% у гомозигот. Позднее были описаны и другие полиморфизмы в этом гене, однако большинство из них либо локализованы в некодирующей области гена, либо являются синонимичными (сайленс-мутации) и никак не повреждают структуру конечного белкового продукта, и поэтому не являются значимыми [101, 139, 157].
Фенотипические эффекты гена EPHX1 могут иметь патогенетическое значение при различных заболеваниях и, по-видимому, реализуются при участии средовых факторов токсической природы. Например, многими исследованиями показано, что «медленный» аллель EPHX1 и сниженная активность эпоксидгидролазы коррелирует с усилением цитогенетического повреждения при воздействии пестицидов. Увеличивает частоту некоторых заболеваний сочетание полиморфизмов этого гена с курением. Влияют ли полиморфизмы в этом гене на эндогенные функции эпоксидгидролазы пока не установлено [60, 90, 107].
Глутатионопосредованная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к продуктам перекисного окисления жиров, алкилированию белков, свободным радикалам и предотвращению поломок ДНК. Глутатион-S-трансферазы также играют важную роль в транспорте билирубинов, гормонов и биосинтезе простагландинов [12].
Ген 2-й фазы детоксикации GSTP1 расположен в локусе 11q13. Это один из генов суперсемейства глютатионтрансфераз класса Р. Белковый продукт этого гена – плацентарная глутатион-S-трансфераза (глутатион-S-трансфераза Р1), которая относится к наиболее важным изоформам глютатионтрансфераз репродуктивного тракта и плаценты. Этот фермент играет важную роль в детоксикации пестицидов и в процессах канцерогенеза. Кроме того, было обнаружено, что экспрессия GSTP1 влияет на процессы клеточной пролиферации и апоптоза. Этот фермент защищает клетки от повреждения при оксидативном стрессе, так как является эндогенным ингибитором JNK-киназ, участвующих в ответе на действие цитокинов, ультрафиолетовое облучение и запускающих апоптоз. Глутатионопосредованная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к повреждающему действию ксенобиотиков, продуктов перекисного окисления липидов, алкилирования белков и предотвращает поломки ДНК. Для гена GSTP1 описано 2 вида функционального полиморфизма – Ile105Val (А313G) и Ala114Val (C341T). Частота мутантных аллелей в российской популяции составляет около 14% [12, 120, 122].
Ген TPMT локализован в локусе 6p22.3 и содержит 10 экзонов и 9 интронов. Он кодирует фермент, катализирующий реакцию S-метилирования, - тиопуринметилтрансферазу, который экспрессируется в печени, почках, эритроцитах, лейкоцитах и ряде других тканей. S-метилирование – основной путь метаболизма таких сильных цитостатиков как 6-меркаптопурин, азатиоприн и 6-тиогуанин (эти препараты часто используются при лейкемии, воспалительных заболеваниях кишечника и болезни Крона, аутоиммунных заболеваниях и после трансплантации органов). Эндогенная роль данного фермента не ясна [12, 132, 133, 165].
Наследственные различия в уровне активности фермента TPMT были описаны в 1980 г. Точечные мутации в гене TPMT ассоциированы с потерей активности белка и, соответственно, приводят к нарушению метаболизма 6-меркаптопурина у пациентов. Оценка полиморфизмов в гене TPMT – это один из первых молекулярно-генетических тестов, который начал использоваться в клинической практике. Генетическое тестирование на полиморфизмы в гене TPMT у пациентов, которым необходим прием 6-меркаптопурина, - это пример того, как фармакогенетика помогает индивидуально оптимизировать дозы и длительность приема лекарств и снизить количество побочных эффектов от их приема [108, 119, 144, 149, 160, 165].
Описано 2 аллеля «дикого» типа (TPMT 1 и TMTP 1S) и 16 вариантов полиморфных аллелей, приводящих к сниженной ферментативной активности. Аллель 2 содержит мутацию G238C (Ala80Pro). Аллель TPMT 3A содержит 2 миссенс-мутации: G460A (Ala145Thr) и A719G (Tyr240Cys). TPMT 3A аллель содержит только миссенс-мутацию A719G [94, 96, 108, 111, 138, 149, 164].
Частота полиморфизмов в гене TPMT значительно разнится в зависимости от этнической принадлежности. Среди европейцев и африканцев почти 90% населения являются носителями аллелей дикого типа, около 10% являются гетерозиготами и 0,3% гомозиготами по мутантным аллелям. А среди азиатов гетерозиготы встречаются реже (2-5%). Самый частый полиморфный аллель гена ТРМТ у европейцев - это TPMT 3A аллель [119, 133, 149].
Проводились исследования, изучающие гендерные различия в полиморфизмах гена и активности фермента TPMT, однако убедительных данных, что существуют какие-либо отличия в этом отношении между мужчинами и женщинами, получено не было [147]. Оксид азота по современным представлениям играет роль универсального регулятора множества физиологических процессов, включающих в себя поддержание сердечно-сосудистого гомеостаза, иммунного статуса, цитотоксической активности макрофагов и т.д. Синтезировать NO способны многие клетки организма. Известно, что NO синтезируется в трофобласте, плаценте и миометрии [91, 98].
Ген эндотелиальной NO-синтазы NOS3 расположен на 7й хромосоме в локусе 7q36. В нем известно несколько полиморфных вариантов. Наиболее известны следующие: полиморфизм 4а/4b в интроне 4 (в 4b аллеле присутствуют 5 повторяющихся фрагментов 27 п.н., а в 4а – 4 таких повтора), структурная замена G894T в 7 экзоне и полиморфизм промоторной области гена NOS3 Т786С [12].
Существуют данные, что полиморфизмы этого гена играют роль при невынашивании беременности, особенно, в сочетании с другими неблагоприятными полиморфизмами (в генах тромбофилии и генах артериальной гипертензии) [51, 79]. Также существует ассоциация между полиморфизмами в гене NOS3 и акушерскими осложнениями, например преэклампсией [15, 77].
Молекулярно-генетические методы исследования
Полиморфный аллель G в 415 положении гена EPHX в основной группе встречался с частотой 44,5%, а в контрольной – 30% (р=0,01, OR=1,87 (1,12-3,11)). Гомозиготный генотип GG по данному полиморфизму составил 17% в основной группе и 4% в контрольной группе (p=0,02, OR 4,91 (1,1-22,2)). Частота гетерозиготного генотипа была высокой в обеих исследуемых группах и составила соответственно 55% и 52%.
Аллель G в 415 положении гена EPHX называют «быстрым» аллелем, поскольку при данном полиморфизме активность фермента микросомальной эпоксидгидролазы повышена (у носителей гомозиготного генотипа примерно на 25%) [12, 101]. При этом, согласно литературным данным, после реакции, катализируемой этим ферментом некоторые токсиканты становятся более опасными для организма (например, образуются особо опасные эпоксид-гидродиолы). Поэтому в отношении некоторых вредных веществ эпоксид-гидролаза играет потенцирующую роль [159]. В связи с этим именно «быстрая» форма гена EPHX оказалась более неблагоприятной, тогда как по частоте встречаемости «медленного» полиморфизма T337C (при котором у гомозиготных носителей активность фермента снижена на 40-50%, а у гетерозиготных на 25%) [12] существенных различий между исследуемыми группами не выявлено. Возможно, данный полиморфизм влияет и на эндогенные функции эпоксидгидролазы (участие в сигнальных процессах, метаболизм стероидных гормонов [109]), а не только на изменение ее ферментативной активности, и вследствие этого и реализуется неблагоприятный эффект.
Ген ТРМТ кодирует фермент, катализирующий реакции S-метилирования, - тиопуринметилтрансферазу, который экспрессируется в печени, почках, эритроцитах, лейкоцитах и ряде других тканей. S-метилирование – основной путь метаболизма некоторых цитостатиков, других лекарственных средств и токсикантов. Эндогенная роль данного фермента не ясна. Возможно, он при определенных условиях также участвует в процессах метилирования ДНК, которые являются ключевыми в плане эпигенетических механизмов, отвечающих за экспрессию генов [132, 165]. Поэтому нам было интересно выяснить, имеет ли этот ген какое-то значение в процессах репродукции. Полиморфный аллель А в 460 положении гена ТРМТ в основной группе встречался с частотой 20%, а в контрольной – 10% (р=0,03, OR=2,25 (1,07-4,41). Гомозиготный полиморфный генотип АА в основной и контрольной группе встречался с частотой соответственно 12% и 2% (р=0,04, OR=6,68 (1,84-62,9). Существенных различий по частоте встречаемости гетерозиготного генотипа не выявлено. Частота встречаемости гетерозиготного генотипа GA в обеих группах составила 16%. Вероятно, наличие аллелей G в 415 положении гена EPHX и аллеля А в 460 положении гена ТРМТ являются прогностически неблагоприятными в отношении развития бесплодия. Причем их негативное действие реализуется лишь при гомозиготном генотипе, а в гетерозиготном варианте эти полиморфизмы фенотипически не проявляются. Это можно объяснить тем, что у носителей гетерозиготного генотипа изменение активности (или количества) соответствующих ферментов незначительно и не влияет на устойчивость организма к действию различных экзо- и эндотоксических субстанций. Полиморфизм же G238C гена ТРМТ, напротив, чаще встречался в контрольной группе. Частота встречаемости полиморфного аллеля 238С гена ТРМТ в основной группе оказалась значительно ниже, чем в контрольной – соответственно 12,5% и 23% (р=0,02, OR=0,47 (0,25-0,89). Суммарная частота генотипов, содержащих полиморфный аллель 238С (GC, CC) составила соответственно 22% и 38% (р=0,04, OR=0,46 (0,21-0,96). Генотип GG, напротив, в основной группе встречался достоверно чаще – частота генотипа GG составила соответственно 78% и 62% (р=0,04, OR=2,17 (1,04-4,56). Следовательно при данном полиморфизме более неблагоприятным является «дикий» аллель G, тогда как полиморфный аллель С, возможно, обладает протективным эффектом в отношении развития бесплодия.
В подвергнутых нами анализу источниках научной информации представлены результаты изучения полиморфизмов гена ТМТР в основном с целью оценки их влияния на метаболизм лекарственных средств. Однако полученные данные указывают и на то, что продукт данного гена играет определенную эндогенную роль, которая требует дальнейшего изучения.
Поскольку все исследуемые гены кодируют ферменты, принимающие участие в процессах детоксикации, мы предположили вероятность межгенных взаимодействий и проанализировали частоту встречаемости различных комбинаций полиморфных аллелей. В основной группе достоверно чаще, чем в контрольной, встречались 3 сочетания полиморфных аллелей: EPHX1 337C/- + GSTP1 341С/-, GSTP1 313G/- + TPMT 460A/- и GSTP1 341C/- + TPMT 460A/-.
Общей особенностью данных комбинаций является то, что в них задействованы полиморфизмы двух разных генов (из трех исследуемых), и в каждой из них присутствует полиморфных аллель гена GSTP1. Достоверных различий по частоте встречаемости полиморфизмов этого гена в исследуемых группах не получено. Но, вероятно, его полиморфизмы могут потенцировать негативное влияние полиморфных аллелей других генов второй фазы детоксикации. Однако существуют исследования, где была отмечена более высокая частота полиморфизмов GSTP1 в группе женщин с первичным бесплодием [78, 79]. По данным литературы глутатионопосредованная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к перекисному окислению жиров, алкилированию белков, свободным радикалам и предотвращению поломок ДНК. Кроме того, глутатион-S-трансферазы, к которым относится и глутатион-S-трансфераза Р1, кодируемая генов GSTP1, также играют важную роль в транспорте билирубинов, гормонов и биосинтезе простагландинов [12, 26, 31, 72].
Биохимические показатели и уровень эндотоксикоза у пациенток исследуемых групп
В настоящее время проведено достаточно много исследований, подтверждающих роль генов детоксикации в формировании патологии репродуктивной системы. Однако интересны механизмы реализации этого отрицательного воздействия. Поскольку главной функцией всех генов детоксикации является защита организма от различных токсикантов и поддержание внутреннего гомеостаза, мы посчитали целесообразным провести анализ уровня эндогенной интоксикации у носительниц неблагоприятных полиморфизмов. В ряде исследований [101, 139, 157] изучалось только количество и активность соответствующего продукта гена вне связи с отражающими их функцию биохимическими показателями.
Поэтому мы проанализировали показатели эндотоксикоза в зависимости от наличия или отсутствия генетических полиморфизмов EPHX1 A415G, TPMT G238C и TPMT G460A, по частоте встречаемости которых нами были выявлены достоверные различия между основной и контрольной группами. Оценивался уровень эндотоксикоза у носительниц гетерозиготных и мутантных гомозиготных генотипов по данным полиморфизмам по сравнению с носительницами «дикого» генотипа. В целом наши предположения подтвердились. У пациенток, имеющих в генотипе полиморфизмы EPHX1 A415G и TPMT G460A уровень эндотоксикоза несколько выше, чем у носительниц «дикого» генотипа. Это свидетельствует о снижении у них эффективности процессов детоксикации, что согласуется с данными научной литературы, которые показывают, что результатом этих изменений может быть токсическое повреждение клеток организма со снижением функциональной активности жизненно важных органов и систем, в том числе репродуктивной системы [68, 82, 152].
У гомозиготных носительниц полиморфизма TPMT G238C, обладающих по нашему мнению протективным эффектом, уровень эндогенной интоксикации, напротив, ниже, чем у носительниц «дикого» генотипа. Таким образом, согласно полученным нами результатам, генетически обусловленное изменение процессов детоксикации оказывает влияние на репродуктивную функцию. Мы считаем, что целесообразно проведение тестирования на описанные в работе генетические полиморфизмы у пациенток с бесплодием неясного генеза. При выявлении неблагоприятных полиморфизмов следует провести анализ крови на эндотоксикоз и оценить степень его выраженности. Для оценки работы системы детоксикации мы также изучали биохимические показатели крови пациенток исследуемых групп. В результате выполнения данного раздела работы было установлено, что у женщин с нормальной репродуктивной функцией достоверно выше уровень холестерина и триглицеридов, чем у женщин с бесплодием. Подобные результаты получены и в других исследованиях. Например, в работе Ганчар Е.П. и соавт. (2013г.) сравнивались женщины с метаболическим синдромом страдающие бесплодием и с нормальной репродуктивной функции. При этом, у фертильных женщин с метаболическим синдромом показатели холестерина и триглицеридов оказались несколько выше [11].
Поскольку бесплодие является полиэтиологической патологией, понятно, что в его развитии могут играть роль гены из различных генных сетей. Поэтому, помимо генов второй фазы детоксикации, мы провели исследование роли гена NOS3. Это ген эндотелиальной NO синтазы, полиморфизмы которого могут оказывать влияние на уровень оксида азота, который, в свою очередь, по современным представлениям играет роль универсального регулятора множества физиологических процессов, включающих поддержание сердечно-сосудистого гомеостаза, иммунного статуса, цитотоксической активности макрофагов и т.д. [91, 98]. Учитывая эти данные, мы предположили возможное влияние полиморфизмов в гене NOS3 и на репродуктивную функцию.
Однако в данном случае наши предположения не подтвердились. Мы проанализировали как частоту полиморфизмов NOS3 Т786С и G894T, так и уровень оксида азота (общего и эндотелиального), но не получили достоверных различий между исследуемыми группами. Поэтому, на наш взгляд, полиморфные варианты гена NOS3 не оказывают влияния на функционирование репродуктивной системы, а тестирование данных полиморфизмов при бесплодии неясного генеза мы считаем нецелесообразным. Таким образом, мы показали в нашей работе значение генетических механизмов в формировании бесплодия неясного генеза. В отношении данной патологии играют роль различные особенности кариотипа у самих пациенток и их супругов, а также наличие полиморфизмов в генах второй фазы детоксикации. Поэтому мы считаем необходимым проведение цитогенетического исследования обоих супругов в парах, страдающих бесплодием неясного генеза, а также тестирование на генетические полиморфизмы генов EPHX1, GSTP1 и ТРМТ у женщин, страдающих идиопатическим бесплодием, с последующей коррекцией плана обследования и лечения этих пациенток. Для обоснования прогноза значимости эндогенной интоксикации в генезе идиопатического бесплодия для конкретной пациентки было разработано правило прогноза нарушений в системе детоксикации, на основе которого был создан алгоритм обследования пациенток с бесплодием неясного генеза. В результате детерминантного анализа было выделено несколько генетических (наличие или отсутствие определенных полиморфизмов в генах второй фазы детоксикации и их сочетаний) и биохимических (уровень триглицеридов и холестерина) параметров, позволяющих оценить риск развития эндотоксикоза у пациентки с бесплодием. Полученные данные привели к разработке решающего правила прогноза, которое с чувствительностью 74,25%, специфичностью 70,68% и эффективностью 72,91% обеспечивало предсказание роли эндотоксикоза в генезе бесплодия неясного происхождения. Данное правило прогноза стало основой разработанного нами алгоритма обследования пациенток с бесплодием неясного генеза, который должен стать важной составляющей обследования пациенток с данной патологией, что позволит улучшить результаты лечения бесплодия и восстановления репродуктивной функции.
