Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Состояние проблемы папилломавирусной инфекции (обзор литературы) 13
1.1. Эпидемиология ПВИ и ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки 13
1.2. Вирус папилломы человека, патогенез и этапы течения
инфекции 17
1.3. Современные методы диагностики заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией 23
1.4. Методы лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией 32
1.5. Лечебно-диагностическая тактика при доброкачественных заболеваниях шейки матки, ассоциированных с ВПЧ 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Контингент исследуемых женщин 40
2.2. Лабораторные методы исследования
2.3. Инструментальные методы исследования 45
2.4. Методика исследования ткани шейки матки с помощью оптической когерентной томографии
2.4.1. Методика эксперимента по оценке влияния ОКТ-ассоциированной компрессии на характер изменений ОКТ-изображений ткани шейки матки при ПВИ 48
2.4.2. Получение оптических томограмм з
2.4.3. Характеристика ОКТ-томограмм 53
2.5. Морфологическое исследование 58
2.6. Методы статистической обработки результатов исследования 59
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 62
3.1. Клиническая характеристика больных 62
3.2. Инструментальные методы исследования пациенток с папилломавирусной инфекцией шейки матки 81
3.2.1. Кольпоскопическое исследование в диагностике доброкачественной ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки 81
3.2.2. Скоростная модификация ОКТ с контролируемым сжатием при различных состояниях шейки матки 85
3.3. Комплексное лабораторное обследование в прогнозировании и определении тактики ведения пациенток с ПВИ шейки матки 102
3.3.1. Жидкостная цитология 104
3.3.2. ВПЧ-тестирование 107
3.3.3. Определение онкобелкаЕ7 ВПЧ 16 и 18 типов 112
3.3.4. Эффективность комбинированного использования жидкостной цитологии и определения онкобелка Е7 ВПЧ 16 и 18 типов в диагностике доброкачественной ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки 113
3.4. Лечебно-диагностическая тактика при доброкачественной ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки в репродуктивном возрасте 115
Обсуждение полученных результатов исследования 124
Выводы 148
Практические рекомендации 150
Список основной использованной литературы
- Современные методы диагностики заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
- Лечебно-диагностическая тактика при доброкачественных заболеваниях шейки матки, ассоциированных с ВПЧ
- Методика исследования ткани шейки матки с помощью оптической когерентной томографии
- Кольпоскопическое исследование в диагностике доброкачественной ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки
Современные методы диагностики заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
Вирус папилломы человека, относящийся к семейству Papovaviridae, — эпителиотропный икосаэдр ический вирус диаметром около 55 нм с двуспиральной молекулой ДНК, состоящей примерно из 8000 пар нуклеотидов [3,229].
Геном всех ВПЧ организован одинаково, кодирует 10 различных белков. Ранняя область состоит из генов Е1 и Е2, контролирующих репликацию вируса, гена Е4, осуществляющего процесс созревания вирусных частиц и гены Е5, Еб и Е7, обладающие непосредственным трансформирующим эффектом. Поздние гены Ы иЬ2 шифруют капсидные белки вируса.
К настоящему времени изолировано и охарактеризовано более 200 типов ВПЧ, приблизительно у 120 из них полностью расшифрован геном [32, 205, 209]. Новый номер присваивается в случае, если последовательность ДНК генов L1, Еб и Е7 совпадает с ДНК известных типов менее, чем на 90%. В 99,7% биоптатов РШМ, изъятых у жительниц нашей планеты были обнаружены различные типы ВПЧ [227].
Из всех охарактеризованных ВПЧ примерно 40 типов тропны к эпителию генитального тракта [3, 27, 32, 123, 190, 205, 209] и разделены на группы низкого и высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР) [166, 209].
ВПЧ низкого канцерогенного риска (ВПЧ НКР) (6, 11, 42, 43, 44) ассоциированы в основном с такими доброкачественными поражениями, как кондиломы, которые редко малигнизируются [188].
Установлена достоверная связь наиболее онкогенных по данным МАИР (Международное агенство по исследованию рака) ВПЧ 16,18 типов с тяжелой степенью интраэпителиальных поражений и раком шейки матки [15, 19, 27, 38, 40, 43, 102, 113, 133, 174, 176, 229].
Мишенью для онкогенного действия ВПЧ наиболее часто являются участки митотической активности: зоны трансформации и метаплазии, а так же резервные или травмированные клетки [9, 97, 116, 197]. Состояние, когда вирус находится в базальном слое и его нельзя обнаружить кольпоскопически, цитологически и гистологически, соответствует бессимптомному вирусоносительству и называется латентной формой ПВИ [201, 125, 129, 137].
У здоровых женщин с нормальными механизмами контроля пролиферации носительство носит транзиторный характер, вирус самоэлиминируется, поврежденные клетки отторгаются [195].
Однако, при нарушении механизмов клеточного контроля, имму но супрессии, вирус может персистировать. Начальный вариант персистенции - эписомальный, то есть в виде кольцевидных копий вне хромосом и ее репликация не зависит от клетки хозяина (чаще в тканях плоских кондилом и дисплазии низкой степени).
Следующим этапом жизненного цикла ВПЧ является интеграция ДНК вируса в геном клетки-хозяина, запуская закодированную в геноме ВПЧ программу, которая обеспечивает сначала репродукцию вируса, а затем пролиферацию и позднее — неоплазию, вызывая устойчивость к лечению и переход дисплазии низкой степени в высокую [3, 93]. Эта фаза жизнедеятельности вируса называется продуктивной или репликационной, оказывающей цитопатический эффект, регистрируемый в деструкции ядер, цитоплазмы, органелл, появлении койлоцитов [57, 99, 138, 197].
При интеграции ВПЧ происходит разрушение последовательности ДНК вирусного гена Е2, и снимается ингибирование синтеза основных вирусных онкобелков Е6 и Е7 [6, 85, 215].
Белок Е6 взаимодействует с клеточным супрессором опухолевого роста р53, в то время, как белок Е7 блокирует туморосупрессорный белок ретинобластомы pRb, что приводит к тому, что инфицированная клетка становится иммортализованной, то есть независимой к внешним сигналам, угнетающим рост и не подвергающейся апоптозу [3, 33, 42, 78, 102, 108, 177, 189,226].
Несмотря на то, что на молекулярном уровне пока не удалось убедительно объяснить, почему одни генотипы характеризуются высокой онкогенностью, а другие нет, общепризнанно, что персистирующая ВПЧ-инфекция онкогенными типами — основной фактор риска развития рака [57, 192].
Длительная, в течение 2 лет, персистенция данного вируса, особенно при виру сно-бактериальном, вирусно-грибковом сочетании, наиболее неблагоприятна в связи с нарушениями микроэкологии влагалища, большим числом рецидивов, влиянием на процесс плоскоклеточной метаплазии и, как следствие, увеличением риска развития ЦИН и рака шейки матки (РШМ) [35, 54, 62, 141, 143, 152, 176, 197, 206, 222]. В 20-30% при персистенции ВПЧ наблюдается прогрессирование заболевания [177].
Наибольшую важность составляет персистенция ВПЧ 16 типа, отмеченная у 50% больных РШМ. Интеграция его в ДНК хозяина приводит к пятикратному повышению риска развития рака по сравнению с другими типами ВПЧ [166, 174, 190,224,228].
Современные ученые выделяют 6 ключевых признаков рака: независимость от внешних сигналов роста, нечувствительность к сигналам, подавляющим рост, неподверженность апоптозу, неограниченный репликационныи потенциал, непрерывный ангиогенез, прорастание ткани и метастазирование [3].
Протеины, кодируемые генами ВПЧ ВКР, либо прямо, либо опосредованно способствуют проявлению всех этих признаков [132, 229].
Репликация вирусной ДНК и синтез капсидных белков происходят в наиболее дифференцированных слоях эпителия.
Фактором прогрессирования в сторону злокачественности в организме человека является нестабильность генома, вызванная Е7, проявляющаяся в изменении числа центросом (центров организации микротрубочек в интерфазе и в делящихся клетках), появлении многополярных митотических веретен, разрывов хромосом и нарушении их структуры [38, 78, 201].
Кроме того, экспрессия продуктов генов Е6 и Е7 ВПЧ ВКР в клетках-мишенях достаточна для того, чтобы запустить ангиогенез — развитие новых кровеносных сосудов из уже существующих, многоэтапный процесс, начинающийся в предраковой стадии заболевания [3, 186, 200, 203, 226]. В клетках РШМ снижаются уровни ингибитора ангиогенеза тромбосподина-1, а уровни таких индукторов ангиогенеза, как эндотелиального фактора роста сосудов и ИЛ-8, наоборот повышаются [164].
Интересен тот факт, что помимо прорастания новых сосудов из уже существующей сосудистой сети возможна мобилизация эндотелиальных клеток-предшественниц из костного мозга, что так способствует формированию новых сосудов [186].
Развитие проявлений ВПЧ неразрывно связано с состоянием иммунной системы организма [147,183]. Влияние продуктов генов ВПЧ ВКР подавляет способность клетки активизировать ген интерферона-13 и презентировать эпитопы ВПЧ на поверхности инфицированных клеток, а так же угнетает транскрипцию интерферон-индуцируемых генов [165].
При изучении состояния местного иммунитета у больных с предраковыми заболеваниями шейки матки в сочетании с ПВИ выявлено снижение концентрации IgA, slgA, IgG, а так же увеличение концентрации IgM [51, 144]. Таким образом, при наличии хронической ПВИ развивается состояние местного иммунодеффицита, что способствует развитию неопластических изменений [25, 70].
Лечебно-диагностическая тактика при доброкачественных заболеваниях шейки матки, ассоциированных с ВПЧ
Скорость угасания сигнала в слое (характер снижения интенсивности сигнала в глубину изображения). Характеризовалась по 3 степеням: высокая, умеренная, низкая. Характер угасания сигнала в слое описывался как равномерный, либо прерывистый. Характеристика границы между слоями включала три основных признака: ровность (ровная, неровная), прерывистость (прерывистая, непрерывная), контрастность (контрастная, неконтрастная).
Показатель контраста аналогичен относительной эхогенности областей в ультразвуковых исследованиях. Контраст (высокий, средний, низкий), характеризует изменение (перепад) яркости на границе раздела сред с разным уровнем рассеяния. Чем больше перепад яркости на границе оптических областей томографического изображения, тем более выраженным оказывается контраст между ними.
Окончательным этапом описания ОКТ-изображения является его интерпретация, которая предполагает формулировку заключения по полученному изображению с пометкой о степени сжатия ткани, при которой оно было получено.
Основополагающим в интерпретации томограмм является совокупность признаков, по которой можно судить о динамичности, корригируемости, структурности (бесструктурности) изображений, сохранении (нарушении) упорядоченности элементов, давать интегральную характеристику включений.
Наличие морфологического диагноза, определяющего форму ПВИ, являлось необходимым условием для выявления оптических признаков и оценки результатов лабораторной диагностики при различных проявлениях ПВИ. В связи с этим, биопсия шейки матки с помощью радиоволновой петли была произведена всем женщинам. Гистологическое исследование выполнялось патологоанатомами прозектория ОКБ им. Н.А. Семашко и сотрудниками кафедры патологичекой анатомии Нижегородской Государственной Медицинской Академии. Идентификация томограмм осуществлялась путем их сопоставления с цифровыми изображениями гистологических препаратов с увеличением, соответствующим размеру томограммы (1.8 мм). Гарантом прицельности биопсии являлось наличие следа от прижатия оптического зонда после ОКТ-сканирования.
Оценка диагностической эффективности жидкостной цитологии, молекулярно-биологических ВПЧ-тестов производилась путем анализа их результатов в соответствии с морфологическим диагнозом.
Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с применением методов вариационной статистики при помощи персонального компьютера, оснащенного пакетом программ Microsoft Excel 2010, STATISTICA 6,0. При описании полученных результатов определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (т), среднее квадратичное отклонение (о), частоту встречаемости (%). Далее оценивалась нормальность распределения при помощи критерия Колмогорова. Если показатели имели нормальное распределение, достоверность их различий рассчитывали при помощи критерия Стьюдента (t).
Достоверность межгрупповых различий качественных показателей определяли с помощью %2 - критерия с поправкой Йетса для малых выборок. Различие между сравниваемыми величинами признавали статистически значимыми при вероятности ошибки р 0,05. Значение р для %2 -критерия не указывалось в том случае, когда ожидаемые частоты в сравниваемых группах оказывались меньше 5.
Предложенные методики скоростной ОКТ с контролем сжатия ткани оценивались в работе по основным критериям, с помощью которых в медицине определяется информативность визуализирующих методик (чувствительность, специфичность, диагностическая точность/
Для этого во время научной работы проводилось 3 «слепых» теста с участием 14 респондентов, которые осуществили по 630 распознаваний оптических томограмм в каждом тесте. В зависимости от итогов распознавания ОКТ-исследования и фактического наличия заболевания, результаты могли быть следующими:
Истинно положительным считался результат, при котором респондент правильно относил к злокачественному типу изображение, полученное у пациентки с гистологически подтвержденным диагнозом ЦИН П-Ш (ИП).
Истинно отрицательным считался результат, при котором совпадало заключение респондента об отсутствии злокачественности с гистологическим заключением (ИО).
Ложноположителъным считался результат гипердиагностики, при котором томограмма была отнесена респондентом к числу «злокачественных», тогда как признаков ЦИН П-Ш морфологами выявлено не было (77/7).
Ложноотрщателъный результат характеризовался гиподиагностикой, так как томограмма была отнесена респондентом к числу «доброкачественных», тогда как ЦИН П-Ш были подтверждены гистологически (ЛО).
Методика исследования ткани шейки матки с помощью оптической когерентной томографии
Для бесструктурного корригируемого варианта визуализации зрелого плоскоклеточного регенерата свойственно: - динамический характер томограмм с проникновением равномерно угасающего, медленного оптического сигнала на 2/3 или всю толщу кадра; - изменение бесструктурной оптической картины за счет появления двухслойного образа при ОКТ-ассоциированной компрессии: граница между слоями сплошная или прерывистая, при чем интенсивность нижнего слоя выше, чем верхнего; - появление включений округлой, линейной, изменчивой формы с низким уровнем сигнала, соответствующих кровеносным сосудам и/или цервикальным железам.
Как видно из рисунка 3.8. б структурной визуализации зрелого метапластического эпителия свойственная явная динамичность, обусловленная изменениями слоистости и наличием включений, которые соответствуют цервикальным железам с выводными протоками или без них. до компрессии после компрессии цифровое изображение гистологического препарата б) структурная корригируемая визуализация а) бесструктурная корригируемая визуализация
Следует заострить внимание на том факте, что изменчивость томограммы в случае зрелой метаплазии вносит огромный вклад в ее интерпретацию, поскольку без контроля сжатия ткани зондом ОКТ-картина может быть ошибочно отнесена к злокачественной. Нередко зрелый метапластический эпителий кольпоскопически проявляется в виде ацетобелой отдельной площадки, при ОКТ-сканировании которой, на первый взгляд, выявляется слоистый злокачественный тип (высокоинтенсивный двуслойный образ с высокой скоростью угасания сигнала). Применение компрессии выявляет явную динамичность томограммы и наличие в строме большой цервикальной железы, покрытой метапластическим эпителием (рис. 3.8. б). Таким образом, применением скоростной ОКТ с контролем степени сжатия ткани зондом значительно упрощает интерпретацию кольпоскопических картин метапластического эпителия.
Оптическая визуализация экзоцервицита. На рисунке 3.9. представлены томограммы и параллельные цифровые изображения гистологических препаратов, демонстрирующие прижизненные оптические изображения слизистой оболочки шейки матки с морфологически подтвержденными диагнозами хронического и острого экзоцервицитов. цифровое изображение до компрессии после компрессии гистологических препаратов
Округлые низкоинтенсивные стромальные образованиеразличного диаметра с четкими границами,соответствующие полнокровным сосудам Локальное повышение интенсивности сигнала подбазальной мембраной и в толще стромы, что указывает навоспалительную инфильтрацию "пестрая строма", представленная чередованиемвысокоинтенсивных горизонтальных полоссоединительнотканных волокон и низкоинтенсивныхгоризонтальных полос экссудата
Различающиеся признаки Разросшиеся соединительнотканные волокна обусловливают полукадровую глубину проникновения сигнала из-за сильной светопоглощаемости (томограммы пестрые, светлые, неглубокие) Преобладание экссудата в строме приводит к увеличению глубину проникновения сигнала (томограммы пестрые, темные, глубокие) Анализируя данные томоморфологических сопоставлений при цервицитах можно заключить, что ОКТ вносит дополнительные сведения о состоянии цервикального эпителия и при первом посещении может способствовать более точной постановке диагноза.
Исследования по выявлению оптических признаков экзофитных ВПЧ-ассоциированных кондилом проводились с участием 13 женщин (10,65%).
В нашей работе мы установили, что при клинической форме ПВИ шейки матки — экзофитной кондиломе оптическая визуализация может быть 2 видов: бесструктурная корригируемая и структурная корригируемая.
Применение второй степени ОКТ-компрессии ткани экзофитной кондиломы, позволяет структурировать оптический феномен вертикальных древовидных включений, соответствующих по сопоставлению с гистологической картиной характерному сосудистому руслу экзофитной кондиломы (рис. 3.10.).
В нашем исследовании мы изучили динамические оптические свойства ПВИ шейки матки, протекающей субклинически, у 43 пациенток (35,25%), из них различные изменения многослойного плоского и метапластического эпителия с единичными койлоцитами, свойственные малым формам ПВИ были отмечены у 30 женщин (24,59%), диагноз плоской кондиломы был поставлен в 11 случаях (9,02%), кондиломатозный цервицит в 2 (1,64%).
Проанализировав серию томоморфологических сопоставлений, полученных у 30 женщин с малыми формами ПВИ, мы пришли к выводу, что незначительные изменения цервикального эпителия с единичным койлоцитозом не имеют оптического отображения.
Так, у 26 (86.7%) женщин малая форма ПВИ развилась на фоне метаплазирующейся эктопии, в 4 случаях (13,3%) - на фоне хронического цервицита.
Томограммы данных ВПЧ-ассоциированных состоянии соответствовали ранее описанным ВПЧ-неиндуцированным, были классифицированы нами как бесструктурные корригируемые. В собственном исследовании мы изучили оптические свойства плоской кондиломы шейки матки на примере 11 женщин (9,02%). Установлено, что во время ОКТ-сканирования с применением компрессии на ткань плоской кондиломы оптическая динамика выражена незначительно, но характеризуется (рис. 3.11.): - появлением/исчезновением гиперинтенсивных областей по всей толще бесструктурного умеренно интенсивного глубокого (на всю толщу кадра) образа; - при 2 степени компрессии визуализируются 2 оптических слоя с нечеткой, волнообразной, широкой, прерывистой, размытой границей, интенсивность которой меньше, чем самих слоев, но гипоинтенсивной границу назвать нельзя; - верхний слой интенсивнее или одинаковый с нижним по уровню сигнала и имеет значительную высоту (иногда до половины кадра).
Кольпоскопическое исследование в диагностике доброкачественной ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки
Одним из приоритетных направлений научной деятельности Нижегородской Государственной Медицинской Академии является изучение клинического значения оптической когерентной томографии (ОКТ) [23,24,50,158,163].
В нашей работе мы впервые применили скоростную модификацию оптического томографа, позволяющую в режиме реального времени получать не только данные о структуре исследуемой ткани, но и неинвазивно оценивать ее функциональные свойства.
В начале исследования мы отметили, что оптическая картина шейки матки нестабильна и может в той или иной степени изменяться в ходе сканирования одной точки во время одного непрерывного исследования.
Позднее мы зарегистрировали взаимосвязь между силой прижатия минизонда к ткани экзоцервикса и динамикой оптических свойств получаемых томограмм. Подобная изменчивость крайне затрудняла интерпретацию ОКТ-образов, поэтому для повышения информативности мы сочли необходимым контролировать сжатие исследуемой ткани.
В современной доступной литературе мы не нашли данных, описывающих компрессионные свойства шейки матки, в связи с чем для количественного изучения адекватной силы прижима зонда, научными сотрудниками Института Прикладной Физики РАН был смоделирован и изобретен специальный динамометр - измеритель прижима «Устройство получения контрастных ОКТ-изображений» (патент РФ на изобретение RU № 2314034). По предложению автора настоящего исследования он был ремоделирован и адаптирован для проведения ОКТ-кольпоскопии, получив название измеритель прижима IPG 3.1.
Задачей экспериментального исследования по оценке ОКТ-ассоциированной компрессии при различных преинвазивных состояниях цервикального эпителия явилось определение оптимальных цифр давления минизонда на ткань с помощью измерителя прижима IPG 3.1.
Для оценки силы сжатия ткани на поверхности прибора нанесена измерительная шкала в 6 делений, соответствующих 6 степеням компрессии ткани.
Экспериментальное in vivo исследование проводилось с добровольным участием 60 женщин, из них у 10 шейка матки была в неизмененном состоянии, у 20 - были диагностированы ВПЧ-ассоциированные изменения без атипии, у 20 - ЦИН I, у 10 была диагностирована - ЦИН П-Ш. Группы пациенток сопоставимы по возрастному составу женщин, их социальному положению, экстрагенитальной и генитальной патологии (р 0,05).
По результатам нашего исследования мы заключили, что ОКТ-кольпоскопическое исследование, проводимое под контролем силы компрессии ткани зондом, способствует получению более информативных оптических образов, легких в интерпретации.
Нами так же отмечено, что давление зонда на ткань должно составлять 0,22 Н/м2, что соответствует второму делению на шкале измерителя прижима IPG 3.1. Применение меньшего сжатия приводит к незначительной структуризации, а большего - сопровождается техническими трудностями ввиду соскальзывания оптического зонда со слизистой оболочки и появления артефактов.
Этап анализа клинических особенностей, результатов инструментальных и лабораторных методов исследования у обследованных пациенток в сопоставлении их с результатами гистологических заключений.
Критерии включения пациенток во второй этап исследования: 1. наличие ВПЧ по данным ПЦР-диагностики 2. репродуктивный возраст Находившиеся под наблюдением пациентки подверглись углубленному комплексному обследованию, включающему: 1) общеклиническое исследование (изучение жалоб, анамнеза, менструальной и детородной функции, симптомов заболевания, характера сопутствующей гинекологической патологии, наличия факторов риска). 2) гинекологическое исследование. 3) инструментальные методы исследования - ОКТ-кольпоскопия (включающая кольпоскопию с применением традиционных тестов, оптическую когерентную томографию в скоростной модификации с применением компрессии ткани). 4) лабораторная диагностика: -оценка биоценоза нижнего отдела генитального тракта (бактериоскопическим методом у всех пациенток, а при наличии симптомов, связанных с воспалением нижнего отдела гениталий дополнительными являлись обследование на облигатные патогены методом ПЦР и условные патогены - методом "Фемофлор"), - молекулярно-биологические методы диагностики ПВИ, включающие ПЦР-real time на ВПЧ ВКР и онкобелка Е7 ВПЧ 16 и 18 типов иммуноферментным методом, - жидкостная цитология. 5) морфологическое исследование биоптата шейки матки, полученного под контролем ОКТ-сканирования Критерием исключения из исследования служило обнаружение HSIL по результатам комплексного обследования.
Нами обследовано 122 пациентки с доброкачественной ВПЧ-ассоцииро-ванной патологией шейки матки. На основании клинико-морфологических данных, мы определили их принадлежность к различным формам ПВИ в соответствии с классификацией ВПЧ-ассоциированных поражений нижнего отдела гениталий по Роговской СИ. [131] и ретроспективно разделили на 2 группы: Первую группу (N1) составили 80 женщин (65,6 %) с ВПЧ-ассоциирован-ными состояниями цервикального эпителия без атипии;
