Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Современные технологии применения антигололедных реагентов (АГР) в России и за рубежом 8
1.2. Виды АГР и условия их применения 13
1.3. Влияние АГР на окружающую среду и здоровье человека 15
ГЛАВА 2. Объекты, объем и методы исследования 25
ГЛАВА 3. STRONG Оценка биологической активности антигололедных реагентов
с помощью экспресс-методов STRONG 47
3.1. Изучение влияния АГР на микробиоценоз и процессы самоочищения почвы 47
3.2. Изучение влияния АГР на проростки семян растений 51
3.3. Изучение влияния АГР на гидробионты 53
3.4. Изучение влияния АГР на сперму быка 59
ГЛАВА 4. Оценка токсичности антигололедных реагентов в экспериментах на теплокровных животных 64
4.1. Изучение токсичности АГР в острых опытах 64
4.2. Изучение токсических свойств АГР в подостром эксперименте 73
4.3. Изучение влияния АГР на специфические иммунологические показатели 92
4.4. Изучение аллергенного действия АГР 95
4.5. Оценка кожно-раздражающего действия АГР 98
4.6. Изучение мутагенной активности АГР 102
ГЛАВА 5. Изучение влияния агр на территории, прилегающие к автомагистралям г.Москвы 107
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов исследований 114
Выводы 114
Список литературы
- Влияние АГР на окружающую среду и здоровье человека
- Изучение влияния АГР на проростки семян растений
- Изучение токсических свойств АГР в подостром эксперименте
- Изучение мутагенной активности АГР
Влияние АГР на окружающую среду и здоровье человека
Самым распространенным способом борьбы с зимним гололедом на дорогах в настоящее время остается обработка дорожного покрытия химическими реагентами [96]. В основе существующих методов борьбы с обледенением дорог лежат мероприятия, направленные либо на удаление с покрытия уже образовавшегося слоя льда или снега, либо на повышение коэффициента сцепления с покрытием [75]. Борьба с зимней скользкостью ведется, в основном, химическими и фрикционными методами. В первом случае распределяются химические противогололедные вещества, которые вызывают полное таяние снежно-ледяных отложений. Во втором случае используются уменьшающие скользкость холодные или горячие материалы, которые закрепляются на поверхности снежно-ледяных отложений, временно повышая коэффициент сцепления с ними колес автомобиля [15].
По данным литературы, в Европе применение химических реагентов началось в Швеции с 1947 года [106], в Великобритании - с 1960 года [149].
В России противогололедные соли впервые стали использовать в 1966 году: к песку добавлялись хлориды натрия и кальция в количестве 2% по весу. До середины 60-х годов на территории нашей страны применение чистых солей на дорогах почти не практиковалось. В зимний период использовались только фрикционные материалы в смеси с солью или без нее, что недостаточно увеличивало коэффициент сцепления [65].
Первые нормативные инструкции (ВС 41-68) запрещали применение хлоридов на тех улицах, где снег складировался на открытый грунт под зеленые насаждения [18]. В документе также специально оговаривалась необходимость полного ремонта дорожных покрытий перед употреблением солей, то есть учитывались интересы окружающей среды. В дальнейшем эти требования были упразднены. До начала применения новых антигололедных реагентов большое распространение в нашей стране получил комбинированный химико-фрикционный метод, когда фрикционные материалы смешиваются с твердыми хлоридами натрия, кальция в различных соотношениях [75]. Однако этот метод требовал большого объема распределяемых материалов и был целесообразен при относительно невысокой интенсивности движения. Фрикционные материалы быстро сдувались с проезжей части турбулентным потоком воздуха, накапливались в придорожной полосе, загрязняли и запыляли территории.
Передовые зарубежные страны имеют весьма значительный опыт снегоуборки и противогололедной обработки дорожных покрытий, обеспечивающий минимизацию экологических последствий использования реагентов на дорогах. Это достигается оптимальным выбором номенклатуры применяемых реагентов, средств транспортировки и дозирования реагентов в зависимости от разнообразных климатических условий. В то же время необходимо учитывать, что объемы убираемой и, особенно, утилизируемой снежной массы в странах зарубежья существенно уступают объемам снежных масс, имеющим место в России [51,81,87].
Основным направлением борьбы с гололедом в Швеции является мокрый розлив хлорида натрия с добавками СаСЬ. Наиболее перспективной представляется смесь СМА (кальциево-магниевый ацетат), дающая эффективные результаты и не вызывающая коррозии стали [121,144]. Этот материал применяется как в ряде Европейских стран, например, в Дании [144] и в Великобритании [141], так и в США [143]. Однако стоимость этих материалов очень высока и составляет 1,5 тысяч долларов за тонну.
Наиболее распространенной технологией борьбы с гололедом в США является предраспределение солей, в том числе в виде рассолов, что препятствует сращиванию льда с покрытием, снижает расход противогололедных материалов, устраняет необходимость посыпки песком [135]. Также в этой стране были проведены испытания асфальтобетонных покрытий с добавлением двуокиси титана, различных смол, силикона, гудрона, резины [26].
Норма расхода сухого вещества зависит от вида реагента и изменяется в различных странах от 4 г/м" до 20 г/м". Точность и качество дозирования при этом очень высоки. Так, например, во Франции разработано устройство, позволяющее распределять до 3 г/м" сухих и увлажненных противогололедных материалов при ширине распределения до 14м [148].
Система противогололедной обработки в Финляндии представляет наибольший интерес из-за значительного сходства их климатических условий с Российскими. В этой стране, так же, как и в США используют метод предварительной обработки дорожного покрытия при ожидающейся повышенной скользкости [87]. В последние годы в Финляндии стали использоваться самораспадающиеся соли (ацетаты и формиаты), биораспад которых наступает примерно через 20 дней. Ограничением их применения является более высокая, чем у прочих реагентов, стоимость и способность снижать при биораспаде содержание кислорода в воде [14].
Основным противогололедным реагентом в Канаде является NaCl, поскольку остальные реагенты очень дороги. При температурах от 0 до -10С применяют соль, смоченную водой в соотношении: 32% соли и 77% воды. При более низких температурах применяют соль с песком (20% соли и 80% песка). Для определения погодных условий разработаны термометры, позволяющие измерять температуру дорожного покрытия с точностью до 2С. Кроме того, применяют автоматические станции наблюдения за погодой на дорогах с датчиками, вмонтированными в дорожное полотно [87,134].
Самым эффективным средством борьбы с зимней скользкостью дорожных покрытий в ФРГ считают химические реагенты. В этой стране применяют смесь солей, состоящих из четырех частей NaCl и одной части СаСЬ, что обеспечивает лучшее таяние снега и льда и более продолжительный срок действия. Для реализации этого способа разработаны и выпускаются промышленностью двухкамерные распределители, в которых
Изучение влияния АГР на проростки семян растений
Активность N-ацетил-Р-Д-глюкозаминидазы, ацетилэстеразы определяли в соответствии с методическими указаниями [56], активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатиотнредуктазы - в соответствии с [3]. Изменения в организме животных регистрировали на 5, 10, 20, 30 сутки от начала экспериментов. По окончании эксперимента животных забивали методом декапитации и определяли относительную массу внутренних органов, проводили морфофункциональный анализ ткани печени, сердца, почек крыс в соответствии с «Морфофункциональными исследованиями в гигиене» [12].
При морфофункциональной оценке пределялись следующие показатели. В печени: гемодинамические сдвиги, фиброзирование и склерозирование сосудов, балочная дискомплексация органа, индекс альтерации (повреждения) гепатоцитов, сумма высокоплоидных гепатоцитов одноядерных и двуядерных с октаплоидными ядрами. Стереометрически (в %) определяли доли, приходящиеся на паренхиму, строму и клеточное инфильтрирование. Определяли также число некрозов, число клеточных инфильтратов и количество макрофагов. Данные показатели отражают характер и степень выраженности повреждения органа, при этом степень полиплоидизации, оцениваемая по увеличению суммы высокоплоидных гепатоцитов, позволяет ранжировать эффект как выраженное вредное воздействие (FEL), отсутствие увеличения при изменении других показателей — как минимальное воздействие (LOAEL) [6].
В почке анализировались показатели, характеризующие поражение различных клеточных популяций: индекс альтерации почечных клубочков, число гипертрофированных клубочков, индекс альтерации эпителиоцитов почечных канальцев. В баллах оценивалась клеточная инфильтрация, склерозирование, фиброзирование, гемодинамические сдвиги, а также учитывался процент крыс с гемодинамическими нарушениями.
В сердце определялись дистрофические изменения миокардиоцитов, в основном, по лизированным ядрам и, изредка, по некротическим фокусам, изменение поперечнополосатой исчерченности мышечных сегментов, наличие клеточных инфильтратов и пролифератов и изменение тинкториальных свойств мышечной ткани в виде неравномерного окрашивания саркоплазмы основными красителями [78].
Результаты, полученные в эксперименте, обрабатывались с помощью компьютерной программы «SPSS 11.0 for Windows». Достоверность различий определяли по критерию t Стьюдента. Различие между величинами показателей в опытных и контрольных группах считали статистически достоверным при р 0,05.
Для оценки действия антигололедных претаратов на иммунную систему животных возникла необходимость предварительного проведения острого опыта на белых беспородных мышах с целью установления ЛД50 у мышей для препаратов ХКМ (г. Волгоград), Нордикс-П при внутрижелудочном введении, поскольку в литературных источниках и базах данных эти сведения отсутствовали. После определения ориентировочной средне-смертельной дозы был поставлен развернутый острый опыт (по 40 животных для каждого изучаемого реагента) так же, как и острый опыт для крыс.
Результаты опыта послужили основой для расчета доз в эксперименте оценки состояния иммунной системы лабораторных животных.
Состояние иммунной системы экспериментальных животных оценивали в отдельных опытах, позволяющих провести сравнительный анализ стимуляции гуморального звена иммунитета у лабораторных животных, на фоне употребления ими антигололедных реагентов ХКМ (г. Волгоград), Бишофит (Туркмения), Нордикс-П. В работе использовались применяемые в отечественной иммунологии методы [35,37]. Сравнительное исследование способности к синтезу специфических IgG - антител в эксперименте иммунизации лабораторных животных (мыши, самки, генетическая линия Balb/c) на фоне приема антигололедных реагентов в тех же дозах, что и в подостром эксперименте, проводилось при однократном введении всем животным раствора белкового агента, которым являлся обычный сывороточный альбумин (БСА, V фракция, «ДИА-М, Москва »). Раствор вводился внутрибрюшинно в дозе 100 мкг по содержанию белка на одно животное без адъювантов [69].
Всего в эксперименте использовано 11 групп животных по 10 особей в каждой: 9 групп животных, получали вышеуказанные дозы антигололедных препаратов, 2 группы являлись контрольными. Первой контрольной группе БСА вводился по аналогичной схеме, исследуемые препараты они не употребляли. Вторая контрольная группа являлась итактной, исследуемые вещества они также не употребляли, белковый агент им не вводился. Уровни содержания специфических IgG- антител в сыворотках крови мышей измеряли 4 раза - 1 (фоновый), затем на 7-ой, 21-й и 28 дни от начала иммунизации с помощью метода иммуноферментного анализа [97], с использованием моноклональных антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена («Полигност», С-Петербург). В работе использованы полистироловые планшеты высокой сорбции (ГосНИИ медполимер, Москва).
Изучение возможного аллергенного действия антигололедных препаратов ХКМ (г. Волгоград), Бишофит (Туркмения) и Нордикс-П проводили в дозах, испытанных в подостром эксперименте, в соответствии с методическими указаниями по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ, изложенными в сборнике «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [52]. Исследование было выполнено на 30 белых морских свинках (самцах с массой тела 200-250 г).
Изучение токсических свойств АГР в подостром эксперименте
Препараты ХКМ (КНР) образец 2, Бишофит (Германия), ХКГ (г. Новомосковск) в концентрации 10 г/л вызывали 100-процентную гибель рачков через 24 часа от начала эксперимента. ХКМ (Финляндия) образец 2 в концентрации 10 г/л приводил к полной гибели дафний через 24 часа, в концентрации 5 г/л - через 48 часов, а в концентрации 2,5 г/л - через 72 часа. ХКМ (КНР) образец 3 через 24 часа вызвал полную гибель дафний в концентрации 2 г/л. Антигололедный реагент Бишофит (Туркмения) привел к 100-процентной гибели рачков в концентрации 20 г/л через 24 часа, а в концентрации 10 г/л - через 72 часа. Под воздействием препарата Бишофит (Голландия) через 24 часа в концентрации 3,5 г/л наступила полная гибель дафний. Нордикс-П через 72 часа от начала эксперимента вызвал гибель 100% дафний в концентрации 4 г/л. а через 96 часов - в концентрации 3,3 г/л.
Недействующими концентрациями для препаратов ХКМ (г. Волгоград), ХКМ (Финляндия) образец 1, ХКМ (КНР) образец 1, ХКМ (КНР) образец 2, Бишофит (Германия) можно считать 1 г/л, для ХКГ (г. Новомосковск) - 0,1 г/л, для ХКМ (КНР) образец 3 - 0,2 г/л, для ХКМ (Финляндия) образец 2 - 1, 3 г/л, для Бишофита (Туркмения) - 2 г/л, для Бишофита (Голландия) - 1,8 г/л, для Нордикс-П - 2,3 г/л.
Исходя из выше изложенного можно сделать вывод, что наименее выраженным токсическим действием по отношению к дафниям обладают антигололедные реагенты Нордикс-П, Бишофит (Туркмения) и Бишофит (Голландия). Наиболее токсичны для дафний препараты ХКГ (г. Новомосковск) и ХКМ (КНР) образец 3.
Тест на свечение бактерий
Данная методика основана на определении изменения интенсивности биолюминисценции генноинженерных бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе по сравнению с контролем. Биолюминисценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов. Люминисцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Критерием токсического дейтсвия является изменение интенсивности биолюминисценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминисценции происходит пропорционально токсическому эффекту [53].
Анализируя полученные данные, представленные в приложении 6 и таблице 3.3, можно отметить, что наиболее выраженным токсическим действием обладают противогололедные препараты ХКМ (г. Волгоград), ХКМ (Финляндия) образец 1 и ХКМ (КНР) образец 1, поскольку только в концентрации 0,5 г/л они не влияли на функцию свечения бактерий. Менее выраженная токсичность в данном исследовании наблюдалась у препаратов ХКГ (г. Новомосковск), ХКМ (КНР) образец 2, для которых недействующая концентрация составила 1 г/л. Препараты Бишофит (Туркмения) и Бишофит (Голландия) не оказывали негативного воздействия в концентрации 2 г/л, а реагенты ХКМ (Финляндия) образец 2 и ХКМ (КНР) образец 3 -концентрациях 10 г/л и 20 г/л соответственно.
Наименьшим влиянием на функцию свечения бактерий обладают препараты Бишофит (Германия) и Нордикс-П, которые в концентрации 50 г/л не оказывали токсического влияния. Тест на изменение генеративной функции инфузорий Практическое использование инфузорий Tetrahymena pyriformis при тестировании объясняется высокой чувствительностью инфузорий к неблагоприятным факторам внешней среды, химическим веществам и соединениям, имеющим санитарное и экологическое значение - тяжелым металлам, канцерогенам, гербицидам, инсектицидам, токсина бактерий и плесени, фармпрепаратам и т.д. Преимуществом использования инфузорий по сравнению с другими простейшими является высокая интенсивность обмена веществ, быстрый рост Тетрахимен, возможность работы со стерильной культурой и стандартным штаммом [55]. Генеративная (ростовая) функция инфузорий является важным показателем их жизнеспособности и заключается в наблюдении за размножением тетрахимен в исследуемых концентрациях антигололедных препаратов и в контроле. В течение первых 6 часов наблюдают, в основном, за выживаемостью инфузорий (острый опыт), в течение остального времени (48 часов) - за приростом количества инфузорий. Критерием токсического влияния является отставание прироста клеток (Кт) в пробах по сравнению с контролем.
Результаты исследования представлены в приложении 7 и таблице 3.3. Оценивая полученные результаты, можно отметить, что наиболее токсичными для инфузорий оказались реагенты ХКМ (КНР) образец 1, ХКМ (КНР) образец 2, ХКМ (г. Волгоград), Бишофит (Германия), которые не влияли на генеративную функцию инфузорий в концентрации 1 г/л. Препараты Бишофит (Туркмения), Бишофит (Голландия), ХКМ (КНР) образец 3 не оказывали токсического действия в концентрации 2 г/л, а Нордикс-П и ХКМ (Финляндия) образец 2 - в концентрациях 2,9 и 5 г/л соответственно. Наименьшими токсическими свойствами по отношению к инфузориям обладают препараты ХКМ (Финляндия) образец 1 и ХКГ (г. Новомосковск), недействующие концентрации которых составили 10 г/л.
Изучение мутагенной активности АГР
В условиях подострого 30-дневного эксперимента на белых половозрелых крысах-самцах было изучено действие антигололедных препаратов ХКМ (г. Волгоград), «Бишофит» (Туркмения) и Нордикс-П. Выбор для дальнейшего исследования именно этих препаратов был обусловлен их наибольшей частотой применения, степенью эффективности, умеренной ценой. Подбор доз производили с учетом экспериментально полученных величин ЛД50, класса токсичности препарата по острой токсичности и их кумулятивных свойств и составили 1/10 ЛД5о, 1/50 ЛД5о и 1/250 ЛД5о для всех веществ. Дозы, испытанные эксперименте для каждого реагента, приведены в таблице 4.9
Выбор тестов по оценке токсического действия реагентов проводился в соответствии с биоэффектами основного компонента. Таблица 4.9 Дозы антигололедных реагентов, испытанные в подострых опытах Название антигололедного реагента Испытанные дозы, мг/кг группа 2 группа 3 группа 1/Ю ЛД50 1/50 ЛДзо 1/250 ЛД50 ХКМ (г. Волгоград) 160 32 6,4 Бишофит (Туркмения) 444,4 88,9 17,8 Нордикс-П 288,9 57,78 11,56 На основании имеющихся в литературе сведений [9,32,42,63,86,89,99,102,104] для всестороннего изучения влияния антигололедных препаратов на организм экспериментальных животных были выбраны следующие показатели: активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ), ацетилэстеразы (АЭ), B-N-ацетилглюкозаминидазы (B-N-ац) в сыворотке крови и в гомогенатах печени, глутатионредуктазы - в гомогенатах печени, относительная масса внутренних органов (печень, почки, сердце) белых крыс. В эксперименте с Бишофитом (Туркмения) изменения данных показателей изучались также в гомогенатах почек животных. Кроме того, исследована динамика изменения гематологических показателей (количество эритроцитов, лейкоцитов, концентрация гемоглобина, уровень гематокрита). В опыте с ХКМ (г. Волгоград) изучалось время свертывания крови.
Результаты физиологических и биохимических исследований с указанием сроков выявленных достоверных изменений изучаемых показателей и их направленности представлены в таблицах 4.10-4.12 и приложениях.
Наблюдения за опытными и контрольными животными не выявили каких-либо особенностей в их внешнем виде или поведении в течение всего эксперимента. Гибель животных ни в одной из экспериментальных групп не наблюдалась. В опыте все животные были разделены на 3 экспериментальные группы и 1 контрольную, 1 группа получала максимальную дозу вещества (1/10 ЛД50), 2 группа -1/50 ЛД5о , 3 группа - минимальную дозу изучаемого вещества - 1/250 ЛД5о Поступление ХКМ на протяжении 30 дней во всех изучаемых дозах не приводило к статистически значимым изменениям количества эритроцитов, лейкоцитов, концентрации гемоглобина, уровня гематокрита (Приложения 8-11). Было установлено достоверное уменьшение времени свертываемости крови в 1 группе на протяжении всего эксперимента, во второй группе - на 5-е и 10-е сутки (Рис. 4.1. и Приложение 12). У животных, получавших минимальную дозу ХКМ, достоверных изменений этого показателя по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения не отмечалось. Данные изменения свидетельствуют о специфичном неблагоприятном влиянии ХКМ на организм теплокровных в высоких дозах. 5 сутки сутки 20 сутки Сроки наблюдения сутки контроль D 160,мг/кг 032,0 мг/кг D6.4 мг/кг Рисунок 4.1. Динамика изменения времени свертываемости крови под действием антигололедного реагента ХКМ (г. Волгоград). При введении максимальной дозы ХКМ (160 мг/кг) в сыворотке крови животных отмечалось достоверное увеличение активности Гл-6-ФДГ на 5, 10 и 20 сутки (Рис. 4.2 и Приложение 13), активация ЛДГ - на 5 сутки эксперимента (Приложение 16). Изменения активности ацетилэстеразы свидетельствовали об угнетении - на 5 сутки и на 20 сутки опыта (Рис. 4.3 и Приложение 15). На 5 сутки зарегистрировано достоверное (р 0,001) увеличение, а на 20 и 30 сутки -снижение активности фермента B-N-ацетилглюкозаминидазы (р 0,01) (Рис. 4.4 и Приложение 14). При введении ХКМ в дозе, равной 1/50 ЛД5о (32 мг/кг) происходило достоверное увеличение активности Гл-6-ФДГ на 5 и 10 сутки (Рис. 4.2 и Приложение 13), активация ЛДГ - на 5 сутки (Приложение 16).
