Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2 1 Гигиенические требования, предъявляемые к современным упаковочным материалам для пищевой продукции 9
2 2 Области применения нанотехнологии и наноматериалов в производстве упаковочных материалов 10
2 3 Оценка рисков для здоровья человека при воздействии наночастиц и наноматериалов 13
2 4 Характеристика наночастиц, применяемых в производстве упаковочных материалов для пищевых продуктов 16
2 5 Методы исследования наночастиц 30
2 6 Краткое заключение 34
3. Материалы и методы 35
3 1 Животные, экспериментальные рационы 35
3 2 Материалы и реактивы 36
3 2 1 Наночастицы и их традиционные химические аналоги 36
3 2 2 Прочие материалы 37
3 3 Оборудование 38
3 4 Схемы биологических экспериментов по токсикологическому исследованию наночастиц 39
3 4 1 Токсикологическое исследование наночастиц серебра 39
3 4 2 Токсикологическое исследование наночастиц диоксида кремния 40
3 4 3 Токсикологическое исследование наноглины 41
3 5 Методы отбора и подготовки биологических образцов от животных, получавших наночастицы 42
3 6 Биохимические методы исследования 43
3 7 Гематологические методы исследования 44
3 8 Определение проницаемости кишечной с генки для овальбумина 45
3 9 Метод изучения апоптоза 47
3 10 Методы изучения влияния наночастиц на аллергическую чувствительность лабораторных животных 48
3 10 1 Схема эксперимента 48
3 10 2 Модель системной анафилаксии 48
3 10 3 Иммуноферментное определение специфических антител 50
3 11 Методы статистической обработки данных биологических экспериментов 51
3 12 санитарно-химические методы исследования миграции наночастиц из упаковочных
материалов для пищевой продукции 52
3 13 Метод оценки неканцерогенного риска, обусловленного экспозицией человека наночастицами серебра 54
4. Результаты исследований 57
4 1 Физико-химические характеристики наночастиц 57
4 2 Токсиколого-гигиеническая оценка наночастиц серебра 57
4 2 1 Влияние наночастиц серебра на интегральные показатели 57
4 2 2 Влияние наночастиц серебра на массу внутренних органов 59
4 2 3 Влияние наночастиц серебра на проницаемость кишечной стенки для макромолекул овальбумина 60
4 2 4 Влияние наночастиц серебра на активность ферментов 1 и 2 фазы детоксикации ксенобиотиков в печени 62
4 2 5 Влияние наночастиц серебра на неседеменитируемую активность лизосомальных гидролаз 65
4 2 6 Влияние наночастиц серебра на содержание небелковых тиолов печени 67
4 2 7 Влияние наночастиц серебра на биохимические показатели сыворотки крови 68
4 2 8 Влияние наночастиц серебра на состояние ПОЛ и системы антиоксиданти ой защиты 70
4 29 Влияние наночастиц серебра на гематологические показатели крови 72
4 2 10 Влияние наночастиц серебра на апоптоз клеток печени 75
4 2 11 Результаты токсикологического исследования наночастиц серебра 77
4 3 Токсиколого-гигиеническая оценка наночастиц диоксида кремния 79
4 3 1 Влияние наночастиц диоксида кремния на интегральные показатели 79
4 3 2 Влияние наночастиц диоксида кремния на массу внутренних органов 81
4 3 3 Влияние наночастиц диоксида кремния на проницаемость кишечной стенки для овальбумина 81
4 3 4 Влияние наночастиц диоксида кремния на активность ферментов 1 и 2 фазы детоксикации
ксенобиотиков в печени 84 4 3 5 Влияние наночастиц диоксида кремния на неседиментируемую активность лизосомальных гидролаз 4 3 6 Влияние наночастиц диоксида кремния на содержание небелковых тиолов печени 89
4 3 7 Влияние наночастиц диоксида кремния на биохимические показатели сыворотки крови 90
4 3 8 Влияние наночастиц диоксида кремния на состояние ПОЛ и системы антиоксиданти ой защиты 92
4 3 9 Влияние наночастиц диоксида кремния на гематологические показатели крови 94
4 3 10 Влияние наночастиц диоксида кремния на апоптоз клеток печени 98
4 3 11 Результаты токсикологического исследования наночастиц диоксида кремния 99
4 4 Токсиколого-гигиеническая оценка наноглины 102
4 4 1 Влияние наноглины на интегральные показатели 102
442 Влияние наноглины на массу внутренних органов 102
4 4 3 Влияние наноглины на проницаемость кишечной стенки для макромолекул овальбумина 104
4 4 4 Влияние наноглины на активность ферментов 1 и 2 фазы детоксикации ксенобиотиков в печени104
4 4 5 Влияние наноглины на неседиментируемую активность лизосомальных гидролаз 105
4 4 6 Влияние наночастиц серебра на содержание небелковых тиолов печени 107
4 4 7 Влияние наноглины на биохимические показатели сыворотки крови 107
4 4 8 Влияние наноглины на состояние ПОЛ и системы антиоксидантний защиты 108
449 Влияние наноглины на гематологические показатели крови 110
4 4 10 Влияние наноглины на апоптоз клеток печени ПО
4 4 11 Результаты тосикологического исследования наноглины 112
4 5 харакТеристика аллергенных свойств наночастиц, применяемых в упаковочных материалах для пищевой продукции 114
4 6 Исследование миграции наночастиц серебра из упаковочных материалов пищевого назначения 120
4 6 1 Результаты санитарно-химического исследования миграции наночастиц серебра 120
462 Оценка экспозиции наночастицами серебра 127
4 6 3 Характеристика неканцерогенного риска, обусловленного мигрировавшими из упаковочных
материалов наночастицами серебра 130
5. Заключение 133
6. Выводы 136
7.Список литературы 138
- Области применения нанотехнологии и наноматериалов в производстве упаковочных материалов
- Схемы биологических экспериментов по токсикологическому исследованию наночастиц
- Влияние наночастиц серебра на массу внутренних органов
- Влияние наноглины на проницаемость кишечной стенки для макромолекул овальбумина
Введение к работе
Актуальность темы
Нанотехнологии, состоящие в направленном манипулировании материальными объектами в субмолекулярном диапазоне размеров 1-100 нанометров, рассматриваются в настоящее время как новая промышленная революция. Согласно прогнозным оценкам в ближайшие годы ожидается широкое внедрение новых видов нанотехнологической продукции в различные области человеческой деятельности, включая медицину, химическую и пищевую промышленность, производство товаров народного потребления. Это ставит на повестку дня вопрос о безопасности нанотехнологий для здоровья человека и состояния среды его обитания [Kuzma J. et al., 2006; Balbus J.M. et al., 2007; Taylor M.R., 2008].
Одной из ведущих областей использования уникальных свойств наноматериалов (НМ) является производство упаковочных материалов для пищевых продуктов [ETC Group, 2004; Kuzma J. et al., 2006; Chaudhry Q. et al., 2008]. Введение наночастиц (НЧ) в состав упаковки позволяет придать ей новые полезные характеристики, включая газобарьерные свойства, непроницаемость для ультрафиолетовых лучей, антибактериальную активность. Применение наносенсорных технологий позволяет создать «интеллектуальную» упаковку, сигнализирующую потребителю об истечении срока годности продукции.
Распространение перечисленных новых технологий в значительной мере тормозится недостаточным объемом данных по токсиколого-гигиенической характеристике используемых НМ, в первую очередь таких, как наноструктурированное серебро, диоксид кремния, наноглина. В основу Постановлений Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 54 от 23 июля 2007 г. «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» и № 79 от 31 октября 2007 г. «Об утверждении концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов» положены данные о различиях физико-химических свойств и биологических эффектов наночастиц от их химических аналогов в форме традиционной степени дисперсности [Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. и др., 2007].
Исследования НЧ проводили в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН по темам № 086 «Разработка критериев и методов оценки безопасности нанотехнологий и наноматериалов, используемых при производстве пищевой продукции», № 108 «Оценка безопасности различных видов наноматериалов, предлагаемых для использования в пищевой промышленности».
Цель исследования: токсиколого-гигиеническая оценка некоторых приоритетных видов НМ, используемых при производстве упаковочных материалов для пищевых продуктов.
Задачи исследования:
1. Изучение общетоксического действия НЧ, применяемых для упаковки пищевых продуктов, в экспериментах на лабораторных животных.
2. Изучение влияния НЧ, используемых в упаковке для пищевых продуктов, на аллергическую чувствительность в эксперименте на лабораторных животных.
3. Изучение миграции НЧ из упаковки в пищевую продукцию в условиях модельных экспериментов.
4. Определение возможной экспозиций человека НЧ, содержащимися в упаковке для пищевой продукции, и расчёт неканцерогенного риска от её использования.
Научная новизна
Разработана система токсиколого-гигиенической оценки НМ, применяемых при производстве упаковочных материалов, предназначенных для хранения пищевых продуктов, включающая токсикологические исследования in vivo, оценку миграции НЧ из упаковочных материалов в модельные среды с количественным и качественным определением с использованием методов электронной, атомно-силовой микроскопии, масс-спектрометрии, и расчёт экспозиции для человека.
Впервые в России на лабораторных животных проведены токсикологические исследования приоритетных, практически значимых наноматериалов, используемых в упаковке пищевых продуктов – серебра, диоксида кремния и наноглины, что позволило обосновать их уровни миграции из упаковочных материалов в пищевые продукты.
В результате экспериментов по изучению миграции наночастиц серебра из упаковочных материалов в модельные среды, воспроизводящие физико-химические свойства основных видов пищевых продуктов, показано, что поступление наночастиц серебра в организм человека из упаковочных материалов, при их использовании по целевому назначению, не превышает его верхнего допустимого уровня потребления.
Практическая значимость
Материалы проведённых исследований использованы при разработке нормативно-методических документов в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры в Российской Федерации на период 2008-2011 гг.», по государственным контрактам с Министерством образования и науки Российской Федерации по темам: «Создание проектов нормативно-правового и методического обеспечения комплексной системы безопасности в процессе исследований, освоения, производства, обращения и утилизации НМ в Российской Федерации» и «Разработка нормативно-методического обеспечения и средств контроля содержания и безопасности НЧ в продукции сельского хозяйства, пищевых продуктах и упаковочных материалах».
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры «Общая, неорганическая, физическая и коллоидная химия» в Институте технологии и производственного менеджмента ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».
Внедрение результатов в практику
Материалы исследований были использованы при разработке МУ 1.2.2637-10 «Порядок и методы проведения контроля миграции наночастиц из упаковочных материалов», МУ 1.2.2638-10 «Оценка безопасности контактирующих с пищевыми продуктами упаковочных материалов, полученных с использованием нанотехнологий», МР 1.2.2640-10 «Методы отбора проб, выявления и определения содержания наночастиц и наноматериалов в составе сельскохозяйственной, пищевой продукции и упаковочных материалов», МР 1.2.0039-11 «Контроль наноматериалов в упаковочных материалах», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2009); на III научно-практической конференции «Контроль содержания и безопасности НЧ в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах» (ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», Москва 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 2 методических указаний и 2 методических рекомендаций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из 7 глав, изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объема исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включает 61 таблицу и иллюстрирована 21 рисунком. Список литературы включает 22 отечественных и 136 зарубежных источников.
Области применения нанотехнологии и наноматериалов в производстве упаковочных материалов
Использование нанотехнологий в производстве упаковочного материала для увеличения сроков годности пищевых продуктов является одной из лидирующих сфер применения нанотехнологий в пищевой промышленности.
Основной механизм увеличения сроков годности пищевых продуктов за счет использования нанотехнологий заключается в улучшении барьерных свойств упаковочного материала. При этом задействованы следующие механизмы: 1) снижение микробной контаминации (за счет уменьшения размеров пор) [37, 38, 55]; снижение воздействия ультрафиолетового излучения на продукт (за счет введения в упаковочный материал НЧ, поглощающих ультрафиолетовое излучение, например НЧ диоксида титана) [37, 38, 55, 104]; снижение газообмена между упакованным продуктом и внешней воздушной средой [104].
Существуют также различные разработки, базирующиеся на встраивании в упаковочные материалы наноинкапсулированных антиоксидантов, противо-микробных препаратов, ферментов [38, 44, 55, 81]. Основным материалом, применяемым для наноинкапсулирования, по данным фирм изготовителей, являются различные органические полимеры [144].
Отдельного рассмотрения заслуживает использование наноглин для модификации полимерных упаковочных материалов из полиэтилентерефталата в целях придания им газобарьерных свойств. Частицы наноглин представляют собой пластинки диаметром около 1 мкм и толщиной порядка 1 нм. Согласно данным разработчика - компании «Bayer» (ФРГ), ламинарное расположение этих пластинок в массиве полимерного нанокомпозита позволяет данному материалу препятствовать процессам диффузии молекул кислорода из внешней среды в продукт, что способствует предохранению от окислительной порчи такие продукты, как растительные масла, и молекул углекислого газа из продукта во внешнюю среду, что увеличивает длительность сохранения газированных напитков [44]. Механизм защитного действия нанокомпозита объясняется при этом резким «удлинением» пути, проходимого молекулой кислорода в массиве полимера.
Эффект миграции НЧ между упаковочным материалом и продуктом, который, в целом, принято рассматриваеть как нежелательный, может найти полезное применение. Существуют разработки, в которых этот процесс используется для улучшения или сохранения органолептических показателей пищевого продукта (запах, вкус, цвет) [44, 55] путём подбора соответствующих наност-руктурированных и наноинкапсулипрованных пищевых добавок и вкусоарома-тических веществ, вводимых в полимерную упаковку.
Многие продукты (такие как фрукты, овощи, сыры и пр.) традиционно покрывают тонкими съедобными оболочками, предохраняющими их от порчи, в частности, от высыхания. Традиционно для этого используются разрешенные пищевые добавки, например воска (Е 908-Е 910) и парафины (Е 905 и его модификации). Использование искусственных НМ позволит сократить толщину пленки и, соответственно, снизить нагрузку соответствующими пищевыми добавками. Наноразмерные органические плёночные покрытия могут применяться и на других видах продуктов, где ранее это не использовалось (например, хлебобулочные изделия). Следует отметить, что такое применение искусственных НМ, является пограничным между использованием в упаковочном материале и использованием в качестве пищевых добавок, так как значительное количество искусственных НМ при этом будет поступать в организм [44, 55].
В отличие от барьерного механизма, в ряде разработок предлагается использовать в составе упаковочного материала НЧ антимикробных веществ в целях предохранения продукта от микробиологической порчи [106]. Предпола гается, что применение этих материалов в наноструктурированном виде приведёт к миграции антисептического агента из упаковочного материала в продукт в случае возрастания микробного роста или изменения параметров среды (температуры, влажности). Для этих целей предлагается использование НЧ серебра и оксида цинка [44, 90, 106].
Общей целью использования наномаркеров в упаковке пищевых продуктов является информирование потребителя о соответствии продукта требуемым показателям (особенно показателям безопасности). Причем это осуществляется наглядным образом (например, изменением цвета определённых меток, нанесённых на упаковочный материал) и не требует участия квалифицированных специалистов для оценки годности продукта. [44, 55, 89]. Такие наномаркеры могут контролировать температуру хранения, степень воздействия ультрафиолетового излучения, влажность воздуха при хранении, появление микробной контаминации. Принцип их действия базируется на применении сенсоров, представляющих собой гибридные наноструктуры, включающие антитела, ферменты и неорганические НМ, например, углеродные нанотрубки.
Другим аспектом использования наномаркеров является изготовление уникальных этикеток, позволяющих отследить путь движения сырья, полуфабриката, конечного продукта, а также эффективнее бороться с контрафактными товарами [89].
Использование нанотехнологий в создании упаковочного материала позволит сделать его экологически безопасным. Так, применение нанотехнологий при изготовлении различных пластиков позволит избежать включения в их структуру токсичных веществ или ингредиентов, производство которых связано с загрязнением окружающей среды. Важной областью использования нанотехнологий является создание упаковочного материала, способного к биодеградации во внешней среде [89]. Композиты на основе природных биосовместимых полимеров, таких как крахмал, характеризуются лёгкой биодеградацией в окружающей среде, что позволяет в значительной мере снять существующую проблему утилизации упаковочных материалов [27]. При этом необходимо принимать во внимание, что такая упаковка сама по себе также может оказывать влияние на окружающую среду, поскольку ее применение приведет к значительному выбросу НЧ в природные экосистемы. [106].
Схемы биологических экспериментов по токсикологическому исследованию наночастиц
Рассмотренные в разделе 2.1 полезные свойства НЧ серебра определяют их использование в упаковочных материалах для пищевых продуктов [44]. Это, вместе с тем, создает потенциальную возможность миграции НЧ в упакованный продукт и поступления вместе с ним в организм человека. Отходы, возникающие при утилизации упаковочных материалов, содержащих НЧ серебра, способны загрязнять окружающую среду. В этой связи значительный интерес представляет информация о возможных рисках для здоровья человека и состояния экосистем вследствии экспонирования НЧ серебра [35].
Антимикробная активность НЧ серебра может оказывать повреждающее действие на почвенные микроорганизмы, включая азотфиксирующие и нитрифицирующие бактерии, что способно приводить к деградации природных биоценозов и падению плодородия почв сельскохозяйственных угодий [56, 138]. Также НЧ серебра могут оказывать влияние на диатомовые водоросли, почвенные нематоды [124], икру и мальков рыб [30, 91]. Следует отметить, что агентство по охране окружающей среды США рассматривает в настоящее время вопрос о внесении наноразмерного серебра в список пестицидов, подлежащих гигиеническому нормированию и регуляции [51, 148].
Получены многочисленные данные о взаимодействии НЧ с клетками эу-кариот в культуре. В работе [135] изучали поглощение частиц серебра размером 25, 80 и 130 нм клетками печени крысы линии BRL ЗА, крысиными альвеолярными макрофагами линии MAC и нейроэндокринными клетками линии PC-12. НЧ обнаруживались как в ассоциированной с плазматической мембраной форме, так и внутри клеток.
Сведения о цитотоксичности НЧ серебра в системах in vitro противоречивы. По данным [77] НЧ серебра размером 15 и 100 нм оказываются высокотоксичными для клеток печени крысы линии BRL ЗА. Токсический эффект проявлялся при концентрации 5-50 мкг/мл и состоял в нарушении функции митохондрий, увеличении проницаемости клеточной мембраны для лактатдегидрогена-зы, накоплении перекисных соединений и снижении концентрации свободных тиолов. Авторами сделан вывод о выраженной токсичности коллоидных НЧ серебра для клеток печени.
В работе [116] на модели альвеолярных эпителиальных клеток человека были выявлены дозозависимые морфологические изменения клеток и индукция апоптоза при действии НЧ серебра. Авторами исследования [48, 75] в культуре клеток фибробластов NIH3T3 показано, что НЧ серебра вызывают апоптоз клеток путем активации выхода цитохрома С из митохондрий в цитозоль. Данный эффект был опосредован образованием реакционно-способных форм кислорода (РСК) в процессе митохондриального дыхания.
Данные относительно биологических эффектов НЧ серебра при различных путях поступления in vivo противоречивы. В работе [93] изучали биокинетику и распределение в тканях НЧ серебра размером 20, 80 и 110 нм. Исследование проводили на крысах в течение 16 дней после серии ежедневных внутривенных введений на протяжении 5 дней. НЧ серебра размером 20 нм накапливались преимущественно в печени, далее в почках и селезенке, в то время как НЧ более крупных размеров - преимущественно в селезенке, печени и легких.
Как показано в исследовании [131] НЧ серебра размером 50-60 нм проникают через гемоэнцефалический барьер и вызывают образование отека мозга у крыс. Внутривенное (30 мг/кг), внутрибрюшинное (50 мг/кг) и интрацеребраль-ное (20 мкг в 10 мкл) введение НЧ нарушало функцию гемоэнцефалического барьера в отношении окрашенного Evans blue альбумина и радиоизотопа йода в течение 24 часов и приводило к развитию отека мозга.
В работе [79] изучали возможное токсическое действие НЧ серебра на крыс Sprague-Dawley при ингаляционном пути поступления в 4 различных дозах (максимальная численная концентрация частиц составляла 1,32106 см"3 , что отвечало 61 мкг/м ) по 6 часов в день, циклами по 5 дней с 2-дневными перерывами в течение 4 недель. Исследование биохимических и гематологических показателей животных опытной группы не выявило каких-либо различий с животными контрольной группы.
Эти же данные подтверждаются в работе [85]. В указанном исследовании помимо гематологических и биохимических показателей анализировалась гено-токсичность. Не было выявлено значительных изменений в отношении перечисленных показателей, однако наблюдался кумулятивный эффект в печени, почках, причем накопление НЧ в почках у самок было выше, чем у самцов.
Данные полученные Sung J.H., et al. [141] при ингаляционном воздейст-вии аэрозолей НЧ серебра в низкой (0,6 10 см" ), средней (1,4 10 см" ) и высо-кой (3 10 см" ) концентрации на крыс в течении 3 недель свидетельсвуют о возникновении специфических гистопатологических изменений в легких и печени крыс.
В работе [86] изучали токсичность НЧ серебра размером 56 нм, вводимых перорально, на мышах линии F344 в течение 90 дней в высокой дозе (125 мг/кг массы тела). Достоверные дозозависимые изменения были обнаружены в показателях активности щелочной фосфатазы и уровня холестерина плазмы крови, как для самцов, так и для самок.
В работе [33] изучено влияние НЧ серебра на крыс на модели язвенного колита. Препарат вводили ректально в дозе 4 мг/кг или перорально 40 мг/кг. Выявлено, что у животных отмечалось снижение интенсивности воспаления, сравнимое с действием сульфасалазина в терапевтических дозах. НЧ серебра достоверно подавляли экспрессию в клетках поражённого толстого кишечника генов металлопротеиназы матрикса ММР-9, TNF-ot, ИЛ-1(3 и ИЛ-12, причем последний эффект не наблюдался при введении сульфосалазина.
В работе [126] описано влияния водной дисперсии НЧ серебра на микрофлору желудочно-кишечного тракта и морфологию энтероцитов перепела при пероральном поступлении в дозе 25 мг/кг. Было установлено, что НЧ серебра не оказывали негативного влияния на микрофлору кишечника и желудка. При воздействии водной суспензии НЧ отмечено увеличение популяции молочнокислых бактерий.
Влияние наночастиц серебра на массу внутренних органов
После отмывки от блокирующего реагента в лунки планшеты, сенсибилизированные антителами к ОВА, вносили в 2 повторах следующие растворы в объеме 0,1 см : 1) бланк раствора (0 нг/см ОВА) в нормальной крысиной сыво-ротке; 2) стандартные растворы ОВА в последовательности от S1 (0,5 нг/см ) до S10 (250 нг/см ) в двух повторах; 3) исследуемые пробы сыворотки крыс в двух повторах; 4) раствор яичного белка, которым кормили животных в день забоя, в разведении 1:2 000 000 в нормальной крысиной сыворотке.
В лунки планшеты, сенсибилизированные нормальным гамма-глобулином кролика, вносили в двух повторах те же образцы сывороток крыс, что и в лунки с антителами к ОВА.
Планшеты инкубировали 2 часа на встряхивателе при комнатной темпе-ратуре, пятикратно отмывали лунки Твин-PBS и вносили по 0,1 см раствора антител к ОВА, конъюгированных с пероксидазой, в разведении 1:2000 в PBS с добавлением 0,1% нормальной лошадиной сыворотки (НЛС). Инкубацию и отмывку повторяли. Избыток жидкости из лунок тщательно удаляли вытряхива-нием на марлевую подушечку и вносили по 0,1 см раствора субстрата (0,04% перекись водорода с 0,04% о-фениландиамином в 0,1 М натрий-цитрат-фосфатном буфере рН 6,0). Инкубировали 20 мин (по секундомеру) при температуре +37 С в воздушном термостате (в темноте), после чего вносили по 0,1 см останавливающего реагента (1 н серной кислоты). Планшеты фотометриро-вали на приборе «ЭФОС 9305» в двухволновом режиме с использованием светофильтров на длину волны 492 и 620 нм.
Для каждой пробы сыворотки рассчитывали связывание Вп = (D1 + D2)/2 - (NSB1 - NSB2)/2, где D - оптическая плотность в лунке образца, сенсибилизированной антителами к ОВА, в двух повторах, NSB - оптическая плотность в лунке образца, сенсибилизированной нормальным гамма-глобулином кролика, в двух повторах. По стандартному графику для каждой данной находили кон-центрацию ОВА в пробе, в нг/см . В случае если эта концентрация оказывалась ниже 1 нг/см , результат считался не значимым (ОВА не обнаружен). В случае, если концентрация ОВА превышала 500 нг/ см3, пробу разбавляли в 10 раз нормальной крысиной сывороткой и анализ повторяли.
Метрологические характеристики теста. Чувствительность метода со-ставляла 1,0 нг/см ; тест на открытие 92%, коэффициент корреляции для параллельных проб в пределах одного анализа составил +0,983, коэффициент вариации для одного анализа - 28%, а для разных анализов (по разным стандартным кривым) 39%о.
Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре фирмы «Beckman Coulter International S.A.» (Австрия). Исследование проведено в лаборатории спортивного питания ФГБУ «НИИ питания» РАМН под руководством старшего научного сотрудника, к.м.н. Трушиной Э.Н. Принцип метода основан на свойстве аннексина V связываться с фосфатидилсерином клеточной мембраны и способности 7-AAD встраиваться между цитозином и гуанином двухцепочечной ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны. На ранних стадиях апоптоза целостность клеточной мембраны сохранялась, но происходила конверсия мембранных фосфолипидов с появлением фосфатидилсерина на поверхности клетки. Аннексии V с высокой аффинностью связывался с фосфатидилсерином и идентифицировал «ранний» апоптоз в AnV-FITC+ (позитивные)/ 7-AAD- (негативных) клетках. Поздняя фаза апоптоза сопровождалась не только утратой асимметрии фосфолипидов мембраны, но и нарушением целостности мембраны, фрагментацией ДНК и резким возрастанием мембранной проницаемости для катионных красителей. Такая стадия апоптоза детектировалась как AnV-FITC+ (позитивные)/ 7-AAD+ (позитивные). Мертвые клетки являются AnV-FITC -(негативными)/ 7-AAD+ (позитивными). Живые клетки не связывали AnV-FITC и непроницаемы для 7-AAD, т.е. являются AnV-FITC-(негативными)/ 7-AAD- (негативными).
Изучение влияния НЧ серебра, диоксида титана (в форме анатазы), диоксида кремния и наноглины на аллергическую чувствительность организма проведены на крысах с использованием модели системной анафилаксии. В основу методики положены МУ 2.3.2.2306-07 [10].
Всего в эксперименте использовано 175 крыс (самцов) линии «Вистар», полученных из питомника РАМН «Столбовая». Исходная масса крыс в начале эксперимента составляла 150-180 г. На протяжении всего эксперимента животные получали полусинтетический рацион.
Были сформированы 7 групп крыс по 25 животных в каждой. Животным контрольной группы в течение 28 дней эксперимента ежедневно внутрижелу-дочно через зонд вводили дистиллированную воду. Животные опытных групп в этих же условиях получали водную дисперсию НЧ диоксида титана (в форме анатазы), диоксида кремния, наноглины в дозе 50 мг/кг массы тела в сутки и водную дисперсию НЧ серебра в дозе 1 мг/кг массы тела в сутки.
Все растворы для приготовления антигена предварительно очищали микрофильтрацией через фильтр с диаметром пор 200 нм производства фирмы «Millipore» (Голландия). Антиген для сенсибилизации готовили путём адсорбции 5-кратно перекристаллизованного ОВА на частицах гидроксида алюминия. Навеску 20 или 2 мг ОВА растворяли в 1,0 мл физиологического раствора. После тщательного перемешивания добавляли по каплям 0,6 мл водного раствора NaOH 1 моль/л до образования плотного белого осадка. Проверяли рН по универсальному индикатору: рН = 5 ± 1. Осадок отделяли центрифугированием 5
Влияние наноглины на проницаемость кишечной стенки для макромолекул овальбумина
Результаты определения стандартных биохимических показателей сыворотки крови крыс групп 1-7 приведены в таблице 16. Концентрации общего белка, альбумина, мочевой кислоты, креатинина, то есть, показатели, характеризующие состояние белкового и азотистого обмена, не отличались в группах 2-7 ни от контроля, ни между собой. Распределение всех этих величин в целом однородно, факторный анализ не выявил влияний со строны вводимых препаратов.
Активность АЛТ, как одного из показателей наличия воспалительных состояний в ткани печени, в обеих группах, получавших НЧ серебра, не отличалась от контроля и оставалась в пределах колебаний нормальных значений. Более того, при сравнении с группой 6, получавшей в низкой дозе ПВП, видно, что в результате приёма НЧ серебра активность этого фермента в сыворотке даже несколько снижалась. В отличие от этого, активность ACT в обеих группах, получавших НЧ серебра, испытывала дозозависимое увеличение, которое особенно проявлялось в группе 3 (1 мг/кг массы тела в сутки НЧ серебра) в сравнении с группой 7, получавшей в эквивалентных количествах ПВП. Таким образом, нельзя исключать возможность негативного влияния НЧ серебра в высокой дозе на состояние ткани печени животных.
Наиболее выраженные различия между группами животных выявлялись по показателю уровня глюкозы. Он испытывал дозозависимое снижение в группах, получавших НЧ серебра, причём для группы 3, получавшей их в высокой дозе, различие достоверно. В отличие от этого, в группах, получавших мак-родисперное серебро, концентрация глюкозы не менялась, а в группе, получавшей ПВП в высокой дозе - возрастала, но не превышала нормальных значений. Таким образом, есть основание полагать, что введение крысам НЧ серебра в высокой дозе может вызывать у них гипогликемию.
Представленные в данном разделе данные свидетельствуют, что перо-ральное введение крысам НЧ серебра в высокой дозе (1 мг/кг массы тела в сутки) на протяжении 28 дней может быть не безопасным судя по определённым биохимическим показателям сыворотки крови (ACT, глюкоза).
Как следует из данных таблицы 17 уровень одного из продуктов ПОЛ -диеновых конъюгатов, достоверно повышен в группе 2, получавшей НЧ серебра в низкой дозе, по сравнению, как с контролем, так и с группами 4 и 6, получавшими эквивалентные количества макродисперсного серебра и ПВП. Данный эффект, однако, не являлся дозозависимым и при более высокой дозе НЧ серебра (группа 3) он не проявлялся. При этом концентрация второго показательного продукта ПОЛ - малонового диальдегида, во всех опытных группах 2-7 не отличалась от контроля.
Активность глутатионпероксидазы эритроцитов во всех группах со 2-ой по 7-ую была достоверно повышена по сравнению с контролем, но не различалась в при попарном сравнении всех опытных групп. Единственным фактором, оказывающим воздействие на этот показатель, оказывалось введение ПВП. Суммарная активность супероксидисмутазы и активность глутатионредуктазы эритроцитов достоверно не отличались во всех опытных группах от контрольных значений, влияния на этот показатель НЧ серебра, макродисперсного серебра, либо ПВП не наблюдалось. Уровень активности каталазы эритроцитов незначительно, но достоверно снижен в группе 2, получавшей низкие дозы НЧ серебра, по сравнению с группой 6, получавшей низкие дозы ПВП. Для высоких доз препаратов (группы 3 и 7) эта зависимость сменялась на обратную.
Таким образом, полученные данные не позволяют выделить какого-либо однозначного и однонаправленного влияния НЧ серебра на состояние антиок-сидантной защиты организма крыс. В тех случаях, когда эффекты от введения НЧ серебра выявляются, они оказываются не дозозависимыми и очень незначительными по абсолютной величине (не более 15% от контрольного уровня). Поэтому говорить о каком-либо негативном влиянии НЧ серебра на систему анти-оксидантной защиты, по-видимому, не представляется возможным.
Содержаниедиеновыхконьюгатов ПНЖКв плазме,нмоль/мл Содержаниемалоновогоальдегидав плазме,нмоль/мл Активность глутатионперокси-дазы эритр., мкмоль/мин мл эр Активностьсупероксиддис-мутазы эритр.,усл. Ед./мл эр Активность глутатионредукта-зы эритр., мкмоль/мин мл эр Активностькатал азы\эритр.,KU/МЛ эр На рисунке 3 представлены результаты определения у животных групп 1-7 общего гемоглобина, а в таблице 18 показатели, характеризующие функцию системы эритропоэза. Как следует из представленных на рисунке данных, концентрация гемоглобина в крови крыс групп 2 и 3, получавших НЧ серебра, практически не отличалась от контроля. Однако если вести сравнение с группой 5, получавшей макродисперсное серебро в высокой дозе, уровень гемоглобина в группе 3 (1 мг/кг массы тела в сутки НЧ серебра) достоверно снижен. Это снижение, однако, невелико по абсолютной величине (19%) и не выходит за границы физиологической нормы.
Концентрация гемоглобина в крови крыс групп 1-7. Ось абсцисс - номера групп; ось ординат - гемоглобин, г/дм . Численность групп - по 8 животных (группы 3,7), по 9 животных (группы 1, 2, 4-6). Индексы- номера групп, различие с которыми достоверно при попарном сравнении (Р 0,05, критерий Манна-Уитни)
Результаты свидетельствуют, что общее количество эритроцитов, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците в группах животных 2 и 3, получавших НЧ серебра, находились в пределах нормы и не отличались ни от контроля, ни от групп, получавших в эквивалентных количествах макродисперсное серебро и ПВП.
