Селективная система цитодукции с использованием рецессивных супрессоров у Saccharomyces cerevisiae Карпова Татьяна Святославовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЕТЕРОКАРИОЗ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ У ГРИБОВ 9

1. Гетерокариоз в жизненном цикле грибов 12

I. Образование гетерокарионов у различных видов грибов...12

1-І. Особенности строения и лсизненного цикла грибов

как предпосылка возникновения гетерокарионов 12

1-2. Основные механизмы образования гетерокарионов 14

1-3. Гетерокариоз у дрожжей 16

2. Основные особенности гетерокариоза у грибов 19

2-І. Парасексуальный процесс. 19

2-2. Элементы парасексуального процесса

у Saccharomyces cerevisiae 20

2-3. Сегрегация гетерокарионов .23

2-4. Сегрегация гетерокарионов S.cerevisiae .24

3. Значение гетерокариоза в жизненном цикле грибов 26

2. Использование явления гетерокариоза в генетическом анализе.27

I. Взаимодействие генов в гетерокарионе .27

1-І. Исследование характера доминантно-рецессивных отношений и межгенных взаимодействий в гетерокарионах в зависимости от соотношения различных типов геномов..28

1-2. Сравнение характера взаимодействия генов у

гетерозиготных диплоидов и гетерокарионов 30

1-3. Взаимодействие генов в гетерокарионах

S.cerevisiae ЗІ

2. Генетическая рекомбинация в гетерокарионах 32

2-І. Использование сегрегации геномов и плазмонов

для локализации генетических детерминантов.

Тест с гетерокарионом 32

2-2. Тест с гетерокарионом у S.cerevisiae 34

2-3. Использование сегрегации геномов и плазмонов для изучения взаимодействия ядерных и цитоплазматических генов 37

2-4. Использование цитодукции у S.cerevisiae Для изучения взаимодействия ядерных и цитоплазматических генов...38

2-5. Парасексуальный процесс в генетическом анализе 40

2-6. Генетический анализ у s.cerevisiae с использо

ванием элементов парасексуального процесса 41

3. Заключение 43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЕ! .47

1. Исходные штаммы. 47

2. Среды и условия культивирования штаммов 47

3. Методы 49

I. Отбор мутантов 49

1-І. Индукция мутантов, способных к цитодукции

с повышенной частотой ( Hfc+ ) 49

1-2. Отбор дыхательно-некомпетентных мутантов 50

1-3. Отбор мутантов по гену lys2 50

2. Гибридологический анализ .50

3. Тест на супрессивность мутаций rho" 51

4. Оценка частоты спонтанного ревертирования 52

5. Статистическая обработка результатов 53

Глава 3. РАЗРАБОТКА СЕЛЕКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ПРОДУКЦИИ 54

1. Принципиальная схема селективной системы цитодукции 54

2. Отбор цитодуктантов в селективной системе 56

I. Качественный тест на цитодукцшо 56

2. Селективные системы цитодукции 56

2-І. Отбор цитодуктантов в системе I 58

2-2. Отбор цитодуктантов в системе II и Ш 61

2-3. Реципрокный перенос цитоплазмы в селективных системах I, П, Ш ....66

3. Факторы, влияющие на частоту выявления цитодуктантов

в качественном тесте 68

I. Влияние цитоплазматических факторов на частоту

выявления цитодуктантов 68

2. Влияние супрессивности мутаций rho- на частоту

выявления цитодуктантов 71

3. Влияние метионина на частоту выявления цитодуктантов...72

4. Заключение 74

Глава 4. МУТАНТЫ,СПОСОБНЫЕ К ДЙТОДУКЦЙИ С ПОВЫШЕННОЙ ЧАСТОТОЙ. 1. Метод отбора мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой

2. Отбор и характеристика мутантов

Ь» Частота цитодукции при использовании мутантов Hfc+ в качестве доноров 77

2. Ослабление комплементации селективных маркеров у гибридов с мутантами Hf с .78

3. Гибридологический анализ цит1-7А-П192 80

4. Тест на доминантность ННЯ 80

5. Определение уровня плоидности мутантов в экспресс-тесте 84

3.Заключение .87

Глава 5. ПЕРЕНОС ХРОМОСОМ В СЕЛЕКТИВНОЙ СИСТЕМЕ 88

1. Отбор цитодуктантов с переносом хромосом II и III (исключительных цитодуктантов) 89

2. Доказательство переноса хромосом у исключительных цитодуктантов 97

3. Стабильность исключительных цитодуктантов 98

4. Заключение 101

Глава 6. ПЕРЕНОС ХИМЕРНЫХ ПЛАЗМИД В СЕЛЕКТИВНОЙ СИСТЕМЕ 102

1. Отбрр цитодуктантов с переносом плазмид YRCEN3I

и рТе(СЖЗ)41 16

2. Стабильность плазмид у цитодуктантов 108

3. Заключение ИЗ

Глава 7. СОБЫТИЯ, НАРУШАЮЩИЕ СЕЛЕКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ 116

1. Количественная оценка событий, приводящих к образованию

прототрофов при селекции исключительных цитодуктантов 117

I. Реверсии по аденину у гибрида

2. Реверсии по аденину у 7А-ПІ92 119

2. Количественная оценка частоты событий, нарушающих селективность системы при отборе мутантов Hfс+ 120

I. Фенотипическая характеристика супрессоров SLT 121

2. Влияние мутаций rho*" на эффективность супрессии SLT ..123

3. Генетический анализ мутантов Slt+ 124

4. Кодоновая специфичность супрессоров SLT 125

5. Природа вторичных реверсий His""-* His+ у мутантов Slt+..I28

6. Природа мутаций SLT 130

3. Заключение 133

Глава 8. ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕЛЕКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ЦОТОДУКЦШ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕЩССИВНЫХ СУПРЕССОРОВ. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 135

1. Частота цитодукции в селективной системе 135

2. Уровень селективности системы 137

3. Мутанты Hfc+ , повышающие эффективность системы 140

4. Заключение 140

ВЫВ ОДЫ 144

ЛИТЕРАТУРА 145

• Гетерокариоз в жизненном цикле грибов
• Отбор мутантов
• Принципиальная схема селективной системы цитодукции
• Метод отбора мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой
• Отбор цитодуктантов с переносом хромосом II и III (исключительных цитодуктантов)

Введение к работе

Одним из наиболее популярных объектов современной генетики являются дрожжи Saccharomyces cerevdsiae . Интерес к этому объекту обусловлен тем, что дрожжи - один из наиболее просто организованных эукариотических микроорганизмов, и исследования, проводимые с использованием S^ cerevislae » являются ступенькой на пути к изучению высших эунариот. Вместе с тем дрожжи имеют большое значение как продуценты микробиологической промышленности.

Исследование широкого круга проблем с применением S cerevislae возможно благодаря тому, что у дрожжей хорошо разработана частная генетика и методы генетического анализа. Для наиболее успешного использования возможностей генетического анализа необходимо тщательное изучение биологических особенностей выбранного объекта. К числу специфических особенностей биологии дрожжей-сахаромицетов, использование которых расширяет возможности генетического анализа, относится явление цитодукции.

В 1957 г, Райт и Ледерберг продемонстрировали, что в результате копуляции у дрожжей могут образовываться ядерно-цитоплазматич-еские гибриды, содержащие ядро одного из родителей и цитоплазму обоих. В 1969 г. Захаров с соавторами также получили ядерно-цито-плазматические гибриды и предложили назвать их цитодуктантами, а процесс их образования цитодукцией.

Цитодуктанты образуются при сегрегации гетерокариотичных зигот, которые возникают с низкой частотой при копуляции дрожжевых клеток наряду с обычными диплоидными зиготами.

Показано, что при цитодукции может происходить перенос не только цитоплазматических факторов, но и хромосом, плазмид.

Цитодукция позволяет создавать штаммы с различными комбинациями геномов и плазмонов, может быть использована для локализации генетических детерминантов в ядре или цитоплазме, изучения ядерно- цитоплазматических взаимодействий, рекомбинации митохондриаль-ных генов. Перенос хромосом при цитодукции может быть использован для изучения гомологии геномов, для картирования. Перенос при цитодукции химерных плазмид, маркированных дрожжевыми генами, может служить одним из методов изучения и конструирования рекомбинант-ных ДЕІК. Изучение генетического контроля цитодукции связано с изучением многих жизненно-важных клеточных процессов (митотического цикла, кариогамии, сегрегации хромосом и митохондрий).

Низкая частота цитодукции (гетерокариотичные зиготы составляют менее 156 общего числа образующихся зигот) приводит к необходимости селекции цитодктантов. Разработаны системы селекции цитодукта-нтов по окраске колоний, по устойчивости к антибиотикам и аналогам аминокислот.

Целью нашей работы было создание селективной системы цитодукции на основе штаммов Петергофских генетических линий дрожжей.Система должна была предоставлять возможность переноса митохондрий, а так же хромосом и химерных плазмид, маркированных дрожжевыми генами, позволять проводить отбор мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой.

В работе впервые:

Создана система цитодукции с использованием в качестве селективных маркеров рецессивных рибосомных супрессоров.

Исследован перенос в селективной системе митохондрий, хромосом П и Ш, химерных плазмид, содержащих центромер хромосомы Ш, репликатор рДНК и репликатор ABSX .

С использованием метода отпечатков получены и охарактеризованы по частоте возникновения и частоте цитодукции мутанты, способные к цитодукции с повышенной частотой ( Hfc⁺ ). Проведен генетический анализ одного из мутантов, показано моногенное наследо- вание и доминирование признака Hfc .

При изучении факторов, нарушающих селективность разработанной нами системы, получен и охарактеризован новый класс доминантных супрессоров у дрожжей - супресеоры slt , супрессирующие нонсенс-аллели (УАА) при пониженной температуре. Обнаружено явление повышения эффективности супрессии slt у дыхательно некомпетентных мутантов и на среде с этанолом.

Разработан экспресс-тест для различения гаплоидов и автополиплоидов у дрожжей.

Г л а в a I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЕТЕР0КАРИ03 В ГЕНЕТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ У ГРИБОВ

Объектом исследования в настоящей работе являются дрожжи Saccharomyees cerevisiae . S.. cerevisiae - представители типа Fungi (грибы). Особенностью жизненного цикла многих видов грибов является существование продолжительной стадии гетерокариоза - сосуществования в общей цитоплазме двух или нескольких генетически различающихся ядер. Гетерокарион также может являться гетероплаз-моном при объединении генетически различающихся плазнонов. Гетерокарион подобен гетерозиготному полиплоиду, т.к. содержит несколько геномов, и вместе с тем отличается от полиплоида тем, что геномы пространственно разобщены. Это обусловливает специфику взаимодействия генов и генетической рекомбинации у гетерокарионов, и в связи с этим специфику генетического анализа у грибов.

Наиболее существенным моментом использования гетерокариоза в генетическом анализе является возможность создания штаммов с различными комбинациями геномов и плазмонов в ходе сегрегации гете-рокариона. Это позволяет изучать взаимодействие генома и плазмона, детерминацию тех или иных признаков ядром или цитоплазмой. Осуществление в гетерокарионе парасексуального процесса позволяет локализовать гены в группах сцепления, конструировать анеуплоиды, используемые в различных генетических исследованиях.

У S. cerevisiae стабильной гетерокариотической стадии не обнаружено. В жизненном цикле чередуются гаплоидная и диплоидная стадии, при этом как гаплоиды, так и диплоида способны к вегетативному размножению. Гаплоидные клетки противоположных типов спаривания (а или Ы ) копулируют с образованием диплоида, неспособного к копуляции, но способного к мейозу и споруляции. В результате мейоза образуются четыре гаплоидных аскоспоры (рис.1).

В ходе копуляции клеток дрожжей в норме вслед за плазмогамией сразу же происходит кариогамия (lyers, Goetach 1975), и образуется клетка с цитоплазмой гибридного происхождения, объединяющая в одном ядре геномы обоих родителей. В 1957 г. Райт и Ледерберг продемонстрировали, что при копуляции могут возникать также клетки с гибридной цитоплазмой, но при этом содержащие ядро только одного из родителей ( Wright, beuerberg 1957). В 1969 г. Захаров с соавторами также получили клетки с гибридной цитоплазмой, возникшие после копуляции гаплоидов, и предложили назвать их цитодуктантами а процесс их образования цитодукцией. В этой работе впервые был показан генетический контроль процесса цитодукции (Захаров и др., 1969).

Получение мутаций в генах, контролирующих цитодукцию, - karl, kar2, KAR3 ( СоМе,Как 1976),- позволило прояснить механизм осуществления этого процесса. Как оказалось, при копуляции мутантов karl, kar2, MR3 V^а также с низкой частотой при копуляции штаммов дикого типа происходит отсрочка кариогамии. В результате образуется гетерокарион. При почковании гетерокариона возможно образование одноядерных почек, которые дают начало колониям цитодуктан-тов. Таким образом, появление цитодуктантов свидетельствует о наличии кратковременной и нерегулярной стадии гетерокариоза в жизненном цикле дрожжей (рис.1).

Цитодукция происходит с частотой менее 1% на зиготу (Захаров и др. 1969). В связи с этим для выделения цитодуктантов необходимы методы селекции. Принципы селекции цитодуктантов и первая полуселективная система отбора были разработаны Захаровым с соавторами (Захаров и др. 1969). В дальнейшем в работах многих авторов были использованы различные селективные системы отбора цитодуктантов. Селекция цитодуктантов позволила применить у дрожжей методы гене-

МЕЙОЗ гаплоиды _д и п л о и д

\

КОПУЛЯЦИЯ

КАРИОГАМИЯ

ЗАДЕРЖКА КАРИОГАМИИ цитодуктанты

Рис.1 Жизненный цикл SaeeharonQrces cerevlsiae (по Conde,ilnk, 1976, с изменениями) митохондрии _{a) («о ядра} тического анализа, ранее используемые только у видов с продолжительной стадией гетерокариоза.

В настоящем обзоре мы проводим сравнение особенностей гетерокариоза у S. cerevisiaeH других видов грибов, поскольку такое сравнение способствует пониманию многих особенностей дрожжевых гетеокарионов и объективной оценке возможностей их использования в генетическом анализе у S, cererisiae . І. Гетерокариоз в жизненном цикле грибов. I. Образование гетерокарионов у различных видов грибов. 1-І. Особенности строения и жизненного цикла грибов как предпосылка возникновения гетерокарионов.

Возможности для образования гетерокарионов создаются при много-ядерности клеток. Для многих видов грибов характерна более или менее продолжительная стадия многоядерности клеток в жизненном цикле (рис.2).

Вегетативная стадия многих видов представлена мицелием, который нередко состоит из многоядерных клеток. Так, например гифы мицелия Hiyeomycetes лишены клеточных перегородок, весь мицелий представляет собой так называемый коэноцит. У мицелиальных Аесо-mycetes гифы мицелия разделены перегородками (септами), которые перфорированы, через поры в септах возможна свободная миграция ядер и цитоплазмы по всему мицелию. У Basiuiomycetes гифы разделены на клетки ^перфорированными септами, у многих видов клетки многоядерны, либо во всем мицелии, либо только апикальные. При наличии генетических различий между ядрами форма представляет собой гетерокарион (гетерокариотический монокарион) ( Burnett, 1974) Вместе с тем гетерокарионы у грибов могут возникать на основе дикарионов. Клетки дикарионов содержат по два ядра, различающихся по факторам половой совместимости. Стадия дикариона предваряет

Рис.2 Гетерокариоз в жизненном цикле грибов (по Burnett , 1974, с изменениями).

Типы жизненных циклов: І.Асексуальшй. Половой процесс не известен. Форма может быть как гаплоидной, так и диплоидной (полиплоидной) . 2. Диплоидный. Большую часть жизненного цикла занимает диплоидная стадия, гаплоидны только гаметы. 3. Гаплоидный. Большую часть жизненного цикла занимает гаплоидная стадия, мёйоз следует немедленно после кариогамии. 4. Гаплоидно-диплоидный. Нет преобладания гаплоидной или диплоидной стадии, формы способны к длительному размножению на обеих стадиях, о. Гаплоидно-дикариоти-ческий. Формы способны к размножению на стадии дикариона или гаплоида, сравнительная продолжительность этих стадий у разных видов варьирует. гаплоид (одноядерные клетки) диплоид (одноядерные клетки)

Стадии, на которых возможен гетерокариоз: гаплоид М дикарион (многоядерные клетки) (двуядерные клетки) образование диплоида при половом процессе. Продолжительность этой стадии зависит от особенностей жизненного цикла. Можно выделить у грибов пять основных жизненных циклов, различающихся по относительной продолжительности гаплоидной и диплоидной стадии: асексуальный, диплоидный, гаплоидный, гаплоидно-диплоидный и гаплоидно-дикариотический (Biimeit , 1974). (Основные характеристики этих жизненных циклов представлены в подписи к рис.2). Существование вегетативно размножающихся дикарионов характерно для гаплоидно-ди-кариотического жизненного цикла. Стадия дикариона непродолжительна у некоторых видов (Feurospora crassa ), у других видов составляет основную часть жизненного цикла (Ustllago maydis ). Промежуточное положение занимают виды (Goprinus, Schisophillum ), у которых как гаплоидная, так и дикариотическая формы способны к длительному вегетативному размножению. При наличии генетических различий между ядрами в дополнение к различиям по факторам половой совместимости форма представляет собой гетерокарион (гетерокарио-тический дикарион - Burnett , 1974).

1-2. Основные механизмы образования гетерокарионов.

Одним из путей образования гетерокариона может быть возникновение мутационных изменений в ядрах гомокариона.

Показано накопление мутаций в гомокарионах как у форм, выделенных из природных популяций (Atwood, Mukai, 1953; Raper et al, 1972; Ming et al.'V 1966), так и у форм, культивируемых в лабораторных условиях ( Mitchell , цит. по Burnett , 1974).

Другой путь образования гетерокарионов - это слияние гиф гомо-карионов. Гетерокариотические дикарионы возникают как этап полового процесса. Гетерокариотические монокарионы могут образовываться при слиянии вегетативных гиф. У видов с одноядерными клетками мицелия такой способ образования и поддержания гетерокариоти-ческого состояния является единственно возможным ( Hastie > 1962; Puhalla, Hayfield , 1974).

Существуют виды, у которых в норме слияния вегетативных гиф не происходит. Это, например, Pfoyeomyees » у которого тем не менее можно производить искусственное сращение гиф ( Ootaki ,1973; Heisenberg,Cerda-01me>I968).

Образованию гетерокарионов путем слияния гомокарионов может препятствовать явление вегетативной или половой несовместимости.

Цри вегетативной несовместимости гетерокариотические монокари-оны, образующиеся при слиянии гиф, дегенерируют. Генетический контроль вегетативной несовместимости подробно изучен у видов Heuro-spora ( Gamjobst, Wilson , 1956; Нешеуег et al , I973;Mishra 1971; Metzenberg, Ahlgren, 1973; Mylyk ,1975; Perkins ,1977), Aspergillus (Jinks, Grindle , 1963; Grindle , 1963; Caten , 1971), Podospora (Bizet, Baser, 1953; Baser , 1954; Bernet , 1967; Selettre, Bernet , 1976; Boucherie, Bernet , 1980).

Как оказалось, вегетативная несовместимость находится под контролем мультилокусных систем. Для того, чтобы формы были совместимы, необходимо наличие у них одних и тех же аллелей в локусах совместимости (гетерогенная несовместимость по классификации,предложенной Эссером: Esser , 1971).

Наличие вегетативной несовместимости между гомокарионами не связано ни с географической, ни с экологической изоляцией. Нередко формы, выделенные из одной и той же почвенной или древесной пробы, проявляют вегетативную несовместимость ( Mylyk , 1976; Rayner, Turton , 1982). Следовательно, такой способ образования гетерокариотических монокарионов в природе вряд ли имеет большое значение.

Для образования гетерокариотических дикарионов необходимо наличие половой совместимости между скрещивающимися формами. При половой совместимости необходимо, чтобы формы несли различающиеся аллели в локусе (локусах), контролирующих половую совместимость (гомогенная несовместимость: Esser , 1971).

В условиях эксперимента слияние вегетативных гиф является наиболее удобным способом получения гетерокарионов при подборе совместимых форм. Гетерокарионы можно выделять селективно при наличии комплементарных маркеров ауксотрофности у гомокарионов (см. Burnett , 1974).

В условиях эксперимента можно также получать гетерокарионы методом пересадки ядер, как это показано для Heurospora,Phycomyces ( Wilson, 1963; Diacumacos et al. , 1965; Zalokar , 1969).

Разработана также методика слияния протопластов, позволяющая получить гетерокарионы yPenicillum (Anne et al , 1976; Anne, РеЪегЯу , 1975), Aspergillus ( Ferenczy et al , 1975) и других видов (РеЪегау , 1979).

1-3. Гетерокариоз у дрожжей.

В жизненном цикле одноклеточных грибов более или менее продолжительная стадия гетерокариоза обычно отсутствует. У форм, способных к половому размножению, при копуляции гаплоидных клеток вслед за плазмогамией сразу же следует кариогамия. Однако для некоторых видов дрожжей ( SaccharonQrcea cerevisiae* Wright, Ъейет -beTg, 1957; Юрченко, 1982; Piehia gnillennondii , Жирова и др. 1981), показано, что в некоторых случаях происходит отсрочка кариогамии ( до Ъ% зигот SaechaEomyces и до 8% у Picbda ,являются гетерокариотичными). Известны также случаи образования гетерокарионов при внутривидовых и межвидовых слияниях протопластов дрожжей ( Goodey, Bevan , 1983; Wilson et al. , I982;Eakar, Magee, 1982; Eerrera » 1981)

Методика слияния протопластов позволяет проводить гибридизацию клеток дрожжей, неспособных к копуляции, например, межвидовые скрещивания, скрещивания клеток вида, у которого половой процесс неизвестен, или клеток одного и того же типа спаривания. При межвидовых слияниях протопластов, как правило, образуются гетерокари-оны ( S.cerevisiae х ЗсЬиаипіощусе alluviua - Wilson et al. , 1982; S. ceatevisiae x Sclizosaecbaroiajrces pombe — ЗтоЪойа » 1980). При слиянии протопластов у видов, лишенных полового процесса, можно получить гибриды ( Scnwanniomyees allraritta* Wilson et al. , 1982; Debariomyces formicaria » Чепурная и др., 1981), в других случаях и гибриды, и гетерокарионы (Candida albicanг PauLter et al. 1981; Saracnek et al. , 1981; Candida utilise Deleado, Herrera , 1981). Уз. eererisiae при слиянии протопластов получают гибриды (ran Solingen, ran der Plaat , 1977; Ferenezy, Haras , 1977; Gmge, Tamaru » 1978; Магаи et al. , 1978). Несмотря на то, что стабильные гетерокарионы при слиянии протопластов у сахаромицетов не образуются, имеются косвенные данные об образовании высоко нестабильных гетерокарионов. Гуди и Биван проводили слияние протопластов штаммов с маркированным геномом и хондриомом ( Goodey > Bevan , 1983). Авторы получили "фьюзанты" (содержащие ядерные и цитоплазматические геномы обоих родителей) и "цибриды" (содержащие геном только одного из родителей и цитоплазму обоих). Частота образования цибридов составляла 50-90% от общего количества продуктов слияния. Если цибриды являются продуктом сегрегации гетерокарионов, то высокая частота их появления не соответствует низкой частоте появления гетерокарионов при копуляции (не более Ъ% зигот Юрченко, 1982). Копуляции у сахаромицетов предшествует стадия синхронизации клеточных циклов копулирующих клеток ( Har-Well , 1973; Wilkerson, Pringle , 1974; BucMng^Throm et al» , 1973).При слиянии протопластов возможно объединение в одной цитоплазме асинхронизовэнных ядер. Возможно, высокая частота образования цибридов (т.е. цитодуктантов) при слиянии протопластов обусловлена тем, что кариогамия асинхронизовэнных ядер затруднена. С другой стороны, повышенная частота образования гетерокарионов может объясняться тем, что проводили слияние клеток одного и того же типа спаривания, в норме не копулирующих. К сожалению авторы не проводили слияние клеток противоположных типов спаривания, и частота образования цибридов в этом случае неизвестна.

Показано, что главная роль в процессе кариогамии принадлежит полярным тельцам веретена ( spb ) и микротрубочкам, соединяющим ядра перед кариогамией ( Byers, GoetsU , 1975). Беномил,- агент, ингибирующий формирование микротрубочек и SPB у дрожжей (Quin- ' Ian et азД980)» - повышает частоту гетерокариоза ( Delgado,Conde, 1984). Мутации в генах, контролирующих клеточный цикл: cdc4, cdc28, cdc34, cdc37 »~ приводящие к нарушению функции SPB , блокируют не только митотические деления, но и кариогамию (Dutcher, Hartwell 1982).

Специфический эффект на кариогамию оказывают также мутации в генах fcarl ( Conde, ЇІпЬ , 1976), kar2 и ЕВД ( Polaina, Conde 1982). В этом случае механизм нарушения кариогамии неизвестен.Ча-стоту образования гетерокарионов повышает также мутация іпоА (Юр-ченко, 1982), приводящая к потребности в инозите. В этом случае к отсрочке кариогамии, возможно, приводят нарушения структуры мембран, связанные с тем, что у мутантов ino нарушен синтез инозит-содержащих фосфолипидов ( Culbertson, Henry , 1975; Henry eta!977)

Процесс кариогамии находится также под контролем локуса типа спаривания МАТ. Показано, что частота образования гетерокарионов повышается у мутантов ±аок о^-типа спаривания, по сравнению с мутантами а-типа спаривания (Юрченко, 1982).

2. Основные особенности гетерокариоза у грибов. 2-І. Парасексуальный процесс.

Парасексуальный процесс был впервые продемонстрирован yAsper- gillus nidulane.B гетерокарионах аспергилла иногда происходит слияние гаплоидных ядер с образованием гетерозиготного диплоидного ядра ( Еорег , 1952). В диплоидных ядрах происходит митотический кроссинговер и гаплоидизация ( Pontecorvo, Дорег , 1953; Eafer, 1961). Гаплоидизация является следствием нерасхождения хромосом, приводящего к образованию моносомиков 2п-1 и трисомиков 2n +1. Трисомики восстанавливают диплоидное состояние, моносомики продолжают терять хромосомы, пока не становятся гаплоидами (Safer, 1961)

Парасексуальный процесс обнаружен не у всех генетически изученных видов. Так, например, у Feurospora crassa диплоидные ядра в мицелии не образуются ( Barratt, 1974).

Интересными особенностями обладает парасексуальный процесс в дикарионах базидиомицетов. У Schisophiiium показано существование нескольких типов рекомбинации: рекомбинация с чертами митотичес-кой рекомбинации, мейотической рекомбинации, и перенос отдельных генов (Ellingboe, Eaper , 1962; Ellingboe , 1964; Gaber,Leonard 1981). Каков конкретный механизм переноса генов, пока неясно.

Различные этапы парасексуального процесса осуществляются у различных видов с различной частотой. Виды различаются по частоте образования диплоидных ядер в гетерокарионах. У Pyricularia oryzae образование диплоидов происходит с частотой 10 (Genove-si, Magill , 1976). У Aspergillus - с частотой 10"" ( Roper, 1952), у Penicillum ezpansura менее I0~⁹ ( Barron, 1962). Гаплоидизация у Aspergillus происходит с частотой около 2?/о на митоз (Eafer, Upshaii , 1973). У некоторых других видов спонтанная гаплоидизация не обнаружена - например у Ustiiago ( Burnett 1974).

В связи с этим при проведении генетических исследований с использованием парасексуального процесса применяют агенты, стимулирующие различные этапы процесса. Диплоиды отбирают на селективных средах, пропорцию диплоидов можно увеличить при обработке камфорой. Предположительно, камфора не индуцирует диплоидизацию, а приводит к селекции диплоидов ( Barron , 1962). Гаплоидизацию можно индуцировать различными агентами, например, р-флюорофенилала-нином ( Ihoas , 1961).

2-2. Элементы парасексуального процесса

У S.cerevisiae. Для Saccharomyces cerevisiae характерно в основном диплоидное но не гетерокариотическое состояние. В диплоидах наблюдается спонтанно только митотическая рекомбинация, но не гаплоидизация. Ми-тотическая рекомбинация может быть индуцирована ультрафиолетовым и рентгеновым излучением, различными химическими рекомбиногенами ( Zimmerman et al. , 1966; Паках, Mortimer , 1969). Можно также индуцировать гаплоидизацию различными агентами: беномилом ( Wood, 1982), р-флюорофенилаланином ( Emeis, 1966; Stromnaes, 1968),солями тяжелых металлов и акрифлавином (OJakafcashi , 1972). Спонтанная гаплоидизация наблюдается также у мутантов chll ( Liras et al, 1978), cdc6 И cdcI4 ( Kawasaki ,1979, цит. no Mortimer, Shild » 1981), spol (KLapholz, Esposito, 1981). Косвенные указания на возможность спонтанной гаплоидизации диплоидных ядер содержатся в работе Столбовой и Нестеровой (1979). Авторы обнаружили, что от 8 до 90% зигот при первых делениях образуют гетерогенное потомство, состоящее из клеток родительских штаммов, цитодук-тантов, а так же клеток, рекомбинантных по маркерам родительских штаммов. Авторы предполагают, что в ранних делениях зигот с высокой частотой идут митотическая рекомбинация и гаплоидизация. Имеются данные, указывающие на возможность осуществления пара- сексуального процесса в гетерокарионах дрожжей.

При отборе цитодуктантов были получены цитодуктанты с переносом хромосом ( Kilsson-Tillgren et al. , 1980; Dutcher , 1981). Перенос хромосом наблюдается в скрещиваниях штаммов дикого типа ( Sigurdson et al. 1981), но наличие karl увеличивает частоту переноса в несколько десятков раз ( Polaina, Conde , 1982).

Для объяснения явления переноса хромосом предложено несколько гипотез. (I). Датчер предполагает, что в гетерокарионе каждое ядро с определенной степенью вероятности может терять хромосомы.Такое ядро является донором хромосом, другое ядро, если оно не претерпело потерь хромосом, может служить реципиентом ( Batcher , 1981). Действительно, для скрещиваний Ьагі х КА.ЕІ характерна высокая частота летальности среди гаплоидного потомства зигот (Ьап-fcashire, Mattoon 1979; Butcher , 1981). Предположительно это нуллисомики, возникшие за счет потери хромосом гаплоидным ядром. С этой гипотезой согласуются данные о том, что жизнеспособность одноядерных потомков karl х шві повышается при использовании в скрещиваниях диплоидов. Очевидно, одноядерные диплоидные цитодуктанты выживают, т.к. моносомики у дрожжей жизнеспособны ( Dutcher, 1981).

Можно предположить также (2), что перенос хромосом осуществляется при гаплоидизации диплоидных ядер, возникающих в гетерокарионе. При этом при полной гаплоидизации ядра по хромосомам одного родителя должны образовываться цитодуктанты, при неполной - цитодуктанты с переносом хромосом. Датчер показала, что помимо цитодуктантов с дополнительной хромосомой появляются цитодуктанты с замещением хромосомы, которые возникают в результате потери хромосомы реципиента у цитодуктантов с дополнительной хромосомой ( Dutcher , 1981). Возможно, в этом случае происходит завершение процесса гаплоидизации. Высокая частота одновременного переноса двух хромосом свидетельствует в пользу механизма гаплоидизации.

Возникает вопрос о причинах гаплоидизации и (или) потерь хромосом гаплоидными ядрами. В гетерокарионах наблюдается дееинхро-низация штотических циклов различных ядер ( Conde, Hnk , 1976). Возможно, десинхронизация является причиной потери хромосом некоторыми ядрами, а затем и гибели этих ядер. Так, например, показана гибель одного из ядер при слиянии асинхронизовэнных клеток млекопитающих ( Johnson, Еао , 1970). Косвенные данные о значении ядерного баланса и синхронизации ядер можно получить из опытов по слиянию дрожжевых протопластов. При слиянии протопластов Candida aiiDicans с высокой частотой образуются нестабильные продукты слияния, у которых происходит потеря как целых геномов, так и отдельных хромосом (Eakar, Magee , 1982). При слиянии протопластов с изолированными ядрами у дрожжей-сахаромицетов образуются анеу-плоидные продукты слияния (Becher et ai. , 1982). Потеря хромосомы Щ наблюдается и у продуктов слияния протопластов сахаромицетов ( Агіша, Tabano , 1979).

Еще один механизм переноса хромосом (3) предложили Полаина и Конде. По их мнению, может происходить аномальная кариогамия,приводящая к образованию ядра с неполным набором хромосом. В дальнейшем нестабильные множественные дисомики могут выщеплять гаплоиды и дисомики 2п+1. В гетерокарионах, очевидно, создаются условия для аномально осуществляющейся кариогамии. ( Polaina, Conde, 1982). Предположение основано на том, что мутации karl, понижающие частоту кариогамии, повышают частоту переноса хромосом. Вместе с тем действие мутации karl может быть обусловлено просто повышением стабильности гетерокариона и, следовательно, увеличением вероятности потери хромосом гаплоидными и диплоидными ядрами гетерокариона. Не исключено, что осуществляются все три предложенных механизма переноса хромосом.

2-3. Сегрегация гетерокарионов. Для гетерокарионов характерна возможность выщепления гомокарио-нов. Сегрегация гетерокарионов может быть обусловлена особенностями строения организма. У видов, у которых многоядерны только апикальные клетки, происходит закономерная сегрегация при формировании мицелия ( PuhaUa, Mayfield , 1974). Сегрегации способствует неравномерное распределение разных типов ядер в мицелии. Такое неравномерное распределение проявляется при ограничениях миграции ядер, которые могут быть обусловлены, например, наличием клеточных перегородок. У Eeurospora crassa свободная миграция ядер обусловливает равномерное распределение ядер в мицелии ( Shatkin, latum, 1959; Pittenger, Atwood , 1956), поэтому для выщепления секторов гомокарионов необходимы методы селекции. У Aspergillus миграция ядер ослаблена по сравнению с Ueurospora ( Rosenberger, Eessei » 1968), поэтому нередко наблюдается выщеп-ление секторов гомокарионов в мицелии.

Неравномерности в распределении ядер могут быть обусловлены различиями в скорости деления ядер различных типов. Ун. crassa показано существование гена I , контролирующего скорость деления ядер. Наличие аллели І в одном из компонентов гетерокариона тормозит деления компонента с аллелью і (Pittenger, Browner ,1961).

Если гетерокарион одновременно является и гетероплазмоном, то к сегрегации гомоплазмонов также могут приводить различия в скорости репликации различных компонентов гетероплазмона. С этим эффектом связано распространение фактора старения у Podospora anserina ( Rizet , 1952). Старение сопровождается накоплением кольцевых молекул ДНК ( аепША ), которые содержат тандемные повторы фрагментов митохондриальной ДНК, способные к автономной репликации (Laz-dins, Cummings , 1982). Повторы содержат копии структурных генов oxL2 и ozij митохондриальной ДНК Podospora , которые селективно амплифицируготся в процессе старения ( Wright et al. , 1982). Мутант , у которого делетирован локус озеіЗ, не претерпевает старения ( Vierny et al., 1982). Аналогичные процессы, видимо, лежат в основе распространения фактора "stopper " у Heurospora crassa ( Bertrand et al , 1968; Bertrand et al , I98G), и "Vegetative death " У Aspergillus ( Jinks » 1959; lasarus et al. » 1980).

2-4. Сегрегация гетерокарионов S.cerevisiae. У S.cerevisiae гетерокарионы, полученные в скрещиваниях как : штаммов дикого типа (Юрченко, 1982), так и мутантов karl ( Conde, Fink, 1976; Lancashire, Matton , 1979) выщепляют при почковании клетки, как гетерокариотические, так и гаплоидные и диплоидные. При росте гетерокариотической колонии гаплоидные клетки могут копулировать, образуя диплоиды или гетерокарионы (Юрченко 1982). Соотношение клеток различных типов в клонах гетерокарионов варьирует. Доля гетерокариотических клеток в таких клонах позволяет судить о стабильности гетерокариона. Исследуя гетерокарионы, полученные при скрещивании штаммов дикого типа, Юрченко показала, что их стабильность сильно варьирует (Юрченко, 1982). В экспериментах Конде и Финка показано, что гетерокарионы в скрещиваниях karl зс ШВІ нестабильны, сегрегация происходит вскоре после образования зиготы. Относительно стабильные гетерокарионы возникают в скрещиваниях karl х karl (Conde, Fink , 1976). Некоторые штаммы в скрещиваниях karl х karl стабильных гетерокарионов не образуют ( bankashire, Mattoon 1979). Следовательно, стабильность гетерокарионов сзависит от генотипа скрещиваемых штаммов.

Процесс сегрегации гетерокарионов был подробно изучен с использованием мутации karl . В гетерокарионах происходило асинхронное деление ядер, несогласованное с почкованием. В результате в гетер-окарионе накапливалось до 14 ядер. В почку отходило как одно, так и несколько ядер (Conde, Fink, 1976). Нестабильность гетерокари- онов может быть связана с такими событиями, как кариогамия, гибель одного из ядер в дикарионе или образование одноядерных почек. Частота образования диплоидов зависит от генотипического фона ( lankashire , Mattoon 1979) и может быть достаточно высока. Гибель одного ядра при почковании дикариотической зиготы также происходит с частотой, превышающей частоту гибели ядер в почкующихся диплоидных зиготах (bankashire , Mattoon, 1979; Dutcher, 1981). С высокой частотой образуются одноядерные почки ( Dutcher ,Hartwell, 1982). При этом одноядерными преимущественно оказываются почки, возникающие на концах зиготы, в отличие от медиальных, в основном дикариотических (Dutcher, Hartwell, 1982).

Образование цитодуктантов зависит не только от сегрегации геномов, но и от сегрегации хондриомов. Некоторые данные свидетельствуют о том, что перемешивание цитоплазмы в зиготах не всегда эффективно. Почки, возникающие на концах диплоидных зигот, значительно чаще содержат хондриом одного из родителей, чем медиальные почки ( Callan, 1974; Strausberg, РегЗтап , 1978). Правда, этот эффект положения почки наблюдается не во всех скрещиваниях (Auf-derheide, 1975). Гетерокариотические зиготы более удобны для изучения перемешивания цитоплазмы, поскольку позволяют оценить, насколько часто хондриом одного из родителей сегрегирует совместно с геномом другого. Оказалось, что в скрещиваниях с участием мутанта karl хондриомы проявляют тенденцию оставаться ассоциированными с собственным ядром (bankashire, Mattoon, 1979). Вместе с тем передача митохондриальной ДНК в скрещиваниях rho⁺ х rho⁺ происходит с большей частотой, чем в случае rho⁺ х rho"" ( Lanka-shire, Mattoon, 1979; Dutcher, 1982). Эти результаты свидетельствуют о том, что передача митохондрий в делениях клетки неслучайна, и возможно существует механизм, обеспечивающий их сегрегацию.

Получены данные о генетическом контроле процесса сегрегации митохондриальной ДНК. Показано, что мутанты cdc5 и cdc27 в ге-терокарионах являются хорошими донорами, но плохими реципиентами митохондрий. Специфический эффект именно на сегрегацию митохондриальной ДНК показан цитологически: менее 1% почек с ядром cdc27 и ЗФ6 почек с ядром cdc5 получали митохондрии в скрещиваниях rhocdc х rho⁺CDC ( Dutcher, 1981). Следовательно, гены cue оказывают эффект не только на клеточные деления, но и на сегрегацию митохондрий.

Мутация karl, используемая обычно для получения гетерокарио-нов, проявляет специфическое взаимодействие с некоторыми мутациями гЬо" в отношении их передачи в гетерокарионе. Показано, что высоко супрессивная мутация J^¹*¹-⁵ (супрессивность 90%) при объединении с karl становится менее супрессивной (20-30%) и не передается с ядром в скрещиваниях J>~^*^ ^_{т1 х r}ho~EARl ( Sena 1982).

Для многих организмов показано, что локализация митохондрий коррелирует с локализацией микротрубочек ( Wang, Goldman, 1978; Bioss, 1979). Действие колхицина на трубочки нарушает не только движение хромосом, но и распределение митохондрий внутри клетки ( Eeggeness et ai., 1978) В связи с этим Датчер предполагает, что гены CDC5 и CDC27 контролируют сборку или функцию микротрубочек ( Dutcher, 1982) Для продукта ша также предполагается участие в сборке или функции микротрубочек ( Polaina, Conde, 1983; Delga-do, Conde 1984).

3. Значение гетерокариоза в жизненном цикле грибов. При сравнении жизненных циклов основных групп грибов оказывается, что преимущественной стадией жизненного цикла является гаплоидная в основном. Однако гаплоиды грибов не являются гаплоидами в строгом смысле этого слова, благодаря многоядерности и возникающему на ее основе гетерокариозу.

Многие авторы предполагают, что гетерокариотическое состояние обеспечивает селективные преимущества по сравнению с гаплоидным.

Гетерокариоз у грибов, очевидно, служит аналогом диплоидного состояния ( Raper, Eleser, 1970). Гетерокариотическое состояние обусловливает возможность образования скрытого резерва наследственной изменчивости, обусловливает возможность осуществления генетической рекомбинации. Для видов, лишенных полового процесса, парасексуальный процесс в гетерокарионах должен играть особенно существенную роль (Левитин, Федорова, 1972). Кроме того, сегрегация гетерокарионов предоставляет возможность для рекомбинации геномов и плазмонов.(Аналогичный эффект может быть достигнут при половом процессе, но при этом в диплоиде происходит объединение и рекомбинация геномов родительских штаммов , и выщепление родительских геномов в чистом виде в сочетании с определенным плазмоном событие достаточно редкое).

Гетерокарион - мобильная система, позволяющая организму быстро приспосабливаться к изменяющимся условиям внешней среды. Приспособление обеспечивается сегрегацией гетерокариона, которая приводит к образованию гомокарионов или гетерокарионов с иным соотношением ядер по сравнению с исходным гетерокарионом ( Jinks,1952).

Для дрожжей, характеризующихся нерегулярным образованием гетерокарионов, гетерокариоз вряд ли играет существенную роль в жизненном цикле.

2. Использование явления гетерокариоза в генетическом анализе. I. Взаимодействие генов в гетерокарионе. Гетерокарион содержит в общей цитоплазме несколько геномов, пространственно изолированных друг от друга. Показано, что эти специфические особенности, отличающие гетерокарион от гаплоида, могут оказывать влияние на характер межаллельных и межгенных взаимодействий.

1-І. Исследование характера доминантно-рецессивных отношений и межгенных взаимодействий в гетерокарионах в зависимости от соотношения различных типов геномов.

Изучение характера взаимодействия генов в гетерокарионах позволяет подойти к изучению проблем доминирования. Для ряда локусов Eeurospora crassa показано, что степень доминирования аллели дикого типа зависит от соотношения ядер различных типов. Для некоторых локусов пределы, в которых может варьировать соотношение ядер различных типов, и при этом проявляться дикий фенотип, достаточно широки. Так, например, нормальная скорость роста гетеро-карионов наблюдалась даже при соотношении типов ядер 5% pan-l⁺ : 9Ь% рап-1 (потребность в пантотенате) ( Pittenger, Atwood, 1956).

В других случаях существует оптимальное соотношение ядер в ге-терокарионе, отклонения от которого в ту или другую сторону неблагоприятны. Так, например, нормальный рост гетерокарионов раъ⁺/ patT (потребность в пара-аминобензойной кислоте) наблюдали лишь при соотношении ядер 1:2 ( Emerson, 1948, цит. по Burnett , 1974). Как недостаток (при увеличении числа ядер раъ~), так и сверхпродукция пара-аминобензойной кислоты (при увеличении числа ядер раъ"¹) лимитируют рост гетерокариона.

Влияние соотношения аллелей в гетерокарионе на проявление доминирования было так же изучено у Pbycomyces blakesleeanus . Шли созданы гетерокарионы с различными соотношениями ядер, маркированных мутантной аллелью madll7 (мутация приводит к аномальному росту) , или аллелью дикого типа mad⁺. При изменении соотношения ядер madII7H mad⁺наблюдали различные степени доминирования mad⁺ ( Yillet , 1970).

Подобные примеры свидетельствуют о том, что в гетерокарионе соотношение генных продуктов пропорционально соотношению аллелей гена.

В гетерокарионах, как и в диплоидах, выявляется межаллельная комплементация ( Case, Giles , 1958; Pincham, Pateman , 1957; Giles et al, 1957; Catcheside, Overton , 1958).

В связи с этим изменение характера доминирования, зависящее от дозы соответствующей аллели, можно объяснять тем, что изменяются количественные соотношения активного и неактивного продукта. При этом в случае белка-мультимера на характер доминирования может влиять негативная комплементация.

Негативная комплементация может влиять и на характер межгенных взаимодействий в гетерокарионе в случае, если генные продукты объединены в мультиэнзимный комплекс. В этом случае следует ожидать, что изменение соотношения аллелей разных генов приведет к изменению эффективности функционирования подобного комплекса. У Phyco-myces blakesleeanus проведено исследование взаимодействия ферментов цепи биосинтеза е,-каротина ( de la Guardia et al , 1971) .Авторы получили мутанты, накапливающие различные пигменты - предшественники ^-каротина,- и не накапливающие пигментов вообще.Авторы предположили, что ферменты"пути биосинтеза каротиноидов образуют мультиэнзимный комплекс. Каждый фермент получает субстрат от предыдущего фермента и передает продукт следующему ферм^эту. Передача промежуточного субстрата в другой комплекс невозможна. Генные продукты всех ядер мицелия случайным образом перекомбинируются при образовании комплекса. Исходя из этих соображений, авторы рассчитали ожидаемые соотношения различных пигментов в зависимости от соотношений в гетерокарионе ядер, мутантних и не мута- - ЗО - нтных по генам, кодирующим ферменты пути биосинтеза каротиноидов. Конструируя гетерокарионы с различными соотношениями мутантних и немутантных ядер, изучали в каждом случае количественные соотношения -каротина и его предшественников. Характер полученной в опыте зависимости количества различных пигментов от соотношений ядер различных типов соответствовал рассчитанным теоретически, и, таким образом, подтвердилась предложенная авторами модель комплекса. Следовательно, использование гетерокарионов является одним из способов исследования механизма доминирования и взаимодействия генов.

1-2. Сравнение характера взаимодействия генов у гетерозиготных диплоидов и гетерокарионов.

У Aspergillus nidulans ( Apirion , 1966; Prasad , 1969),Cop-rinus einereus.( Lewis » I96I;be*ri.s, Vakeria , 1977; Uortb, 1982) известны примеры, когда характер взаимодействия генов в гетерока-рионах и гетерозиготных диплоидах различается. У A.nidulans мутации в трех генах: f&eA, facB, facC (устойчивость к флюороацетату) рецессивны в диплоиде и в гетерокарионе. Однако эти мутации комплементарны в гетерозиготе (дикий фенотип), но не комплементарны в гетерокарионе (устойчивость к флюороацетату) ( Apirion , 1966). Формально эти результаты можно истолковать как изменение характера доминирования при взаимодействии генов в гетерокарионе.

Понтекорво, предсказавший обнаружение этого феномена, предположил, что объяснением таких фактов может служить ограничение миграции продуктов регуляторних генов. (Poirtecorvo , 1963).

С помощью этой гипотезы различные авторы объясняют характер взаимодействия модификаторов доминирования modio"¹* ( Senathirajan, Lewis , 1975; Lewis, Vakeria , 1977) и mod cy⁺ ( Nortb , 1982) У Coprinus - ЗІ -

У Coprinus cinereus modi I0⁺ и mod cy⁺ , которые приводят к доминированию мутаций устойчивости к р-флюороаланину и циклоге-ксимиду соответственно, проявляются в гетерозиготе у диплоида, но не у гетерокариона. Авторы предполагают, что модификаторы доминирования контролируют сборку мультимерных комплексов (в случае mod су⁺ это рибосома), причем определяют преимущественное включение в такой комплекс однотипных компонентов - продуктов одной аллели. При этом при ограниченной миграции продуктов генов modiO⁺ и mod су⁺ их действие проявляется вблизи ядра, чем и объясняется их проявление у диплоида, но не у гетерокариона.

В гетерокарионах н. crassa , в системе регуляции щелочных фос-фатаз, видимо, справедливо иное объяснение изменения характера доминирования, основанное на изменении соотношений продуктов ре-гуляторных генов в зависимости от соотношений ядер различных типов ( Metzenberg , 1979). Система регуляции фосфатаз у Neurospora включает четыре регуляторних гена, среди них nuc-I⁺. Получены две мутации в этом гене: nucl^c , приводящая к избыточной продукции активатора структурных генов, и nuel , инактивирующая продукт nuc-I . Частичные диплоиды nuc-I /nuc-I или nuc-I / nuc-I конститутивно продуцируют фосфатазы, то есть доминирует nuc-I^c.B гетерокарионах происходит разбавление продукта nuc-I^c , поэтому, при избытке ядер nue-I ( nuc-I⁺ ) nuc-I^c рецессивен.

1-3. Взаимодействие генов в гетерокарионах *S. cerevisiae. Гетерокарионы S. cerevisiae нестабильны, соотношение типов ядер в них непостоянно, поэтому проводить изучение комплементации в гетерокарионах дрожжей достаточно сложно.

При гибридизации штаммов с мутацией karl наблюдается замедление роста на среде, селективной для выделения гибридов. Замедление роста на селективной среде может быть связано с нарушениями доминирования в гетерокарионе, или с нестабильностью гетерокариона, которая приводит к выщеплению клеток родительских штаммов, неспособных к делению на используемой селективной среде. Вероятно, оба этих фактора вносят свой вклад в замедление роста.

Мутации, влияющие на кариогамию и сегрегацию митохондрий, проявляются в гетерокарионе, но не в гетерозиготном диплоиде. Это может быть связано с тем, что продукты этих генов являются структурными компонентами органелл, принимающих участие в процессах кариогамии и сегрегации. Видимо, для структурных элементов клетки характерна затрудненная миграция. Кроме того, возможно, обновление этих структурных элементов происходит достаточно медленно. (Conde, ПпЫ , 1976; Datcher , 1982; Dateher, Hartwell , 1982). Пока это единственный случай изменения доминантно-рецессивных отношений в гетерокарионе у дрожжей. В других исследованных случаях не наблюдается отсутствия комплементации в гетерокарионе, например для

ГеНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ИНДуЦИбеЛЬНуЮ СИСТему реКОМбиНаЦИИ (Ifeibre, Roman , 1977), споруляцию ( KLar , 1980).

2. Генетическая рекомбинация в гетерокарионах В гетерокарионах наблюдаются две формы рекомбинации: парасек-суальный процесс и рекомбинация геномов и плазмонов в результате сегрегации гетерокариона. Обе эти формы используются в генетическом анализе как для локализации генетических детерминантов, так и для конструирования форм с заданными комбинациями генов.

2-І. Использование сегрегации геномов и плазмонов для локализации генетических детерминантов. Тест с гетерокарионом Наследование признаков, детерминируемых цитоплазматическими генами, отличается от наследования признаков, детерминируемых яд- ерными (хромосомными) генами: среди гаплоидных сегрегантов, возникших вследствие одного мейоза, наблюдается расщепление 4 :0~, в отличие от 2⁺:2~, характерных для ядерно-детерминируемых признаков, Таким образом, характер мейотической сегрегации может служить одним из критериев нехромосомной локализации детерминанта.

Для идентификации цитоплазматических факторов может быть также использован тест с гетерокарионом. При постановке этого теста получают гетерокарион, скрещивая формы, маркированные ядерными генами. При этом одна из форм несет генетический детерминант, который необходимо локализовать в ядре или цитоплазме. При ядерной локализации детерминант сегрегирует совместно с определенным типом ядер. При цитоплазматической локализации сегрегация исследуемого детерминанта и ядерных маркеров происходит независимо.

Этот критерий особенно удобен для форм грибов, лишенных полового процесса, также, как и для мутантов с нарушениями полового процесса, формирования плодовых тел (например, мутации mi-4 : Pittenger, 1956; stp^A и stp-B : Bertram!, Pittenger , 1969; у Нетзгозрога crassa ) Этот критерий цитоплазматической локализации использовали многие авторы ( Jinks, 1958; 1959; Subak-Sharpe, 1956; Gowdridge, , 1956; Manony, Wilkie , 1958; Mitchell, Kitchen , 1956) у мицелиальных грибов н. crassa, A. nidulans.

Примером подобной работы может служить изучение наследования у A. nidulans признака red , определяющего продукцию красного пигмента (Arlett et al. , 1962; Grindle , 1964). При скрещивании мутанта red со штаммом дикого типа red⁺c марки/фов энными ядрами образуется гетерокарион, который выщепляет четыре типа гомокарио-нов: гомокарионы red и red⁺ с ядрами мутанта red , и гомокарионы red и red с ядрами штамма дикого типа. Таким образом, выщепляются как родительские, так и рекомбинантные сочетания ядерных маркеров и маркера red, что свидетельствует о цитоплазматической локализа- ции red .

2-2. Тест с гетерокарионом у S.cerevisiae

Благодаря тому, что ys. eere-orieiae возможно образование гете-рокарионов, оказалось возможным проведение теста с гетерокарионом в исследованиях с сахаромицетами.

Впервые этот тест использовали Райт и Ледерберг (Wright, Lede-rberg , 1957) для доказательства цитоплазматической природы детерминантов petite . Авторы скрещивали штаммы arg~ thr⁺ rho⁺ х arg⁺ thr" rho" (фенотип petite - дыхательная некомпетентность), и исследовали потомство зигот. В результате того, что в ряде зигот происходила отсрочка кариогамии, образовывались гетерокарионы, которые выщепляли гаплоидные почки с ядрами, происходящими от одного из родителей, и цитоплазмой, от обоих. От 91 такой гаплоидной почки были получены клоны, среди которых было II рекомбинантных (5 arg" thr⁺ rho~ и 6yarg⁺ thr" rho⁺ ). Таким образом было получено доказательство цитоплазматической природы мутаций rho~.

Однако тест с гетерокарионом в той форме, в которой его проводили Райт и Ледерберг, достаточно трудоемок в связи с низкой частотой образования гетерокарионов. Поэтому необходима селекция продуктов сегрегации гетерокариона. Первая такая методика селекции была предложена Захаровым с соавторами (1969).

Принцип селекции состоит в том, что у родительских штаммов не только геном, но и плазмон (хондриом) содержат селективные маркеры. В результате можно селектировать цитодуктанты, содержащие новую комбинацию селективных маркеров генома и плазмона. В качестве селективных маркеров цитоплазмы используют признак rho⁺ в скрещиваниях rho⁺x rho"(Захаров и др., 1969; Conde, Pink , 1976), или митохондриальные мутации устойчивости к антибиотикам (Kielland -Brandt et al. , 1980). При этом донор цитоплазмы (штамм rho⁺ или устойчивый к антибиотикам) несет одновременно детерминант, локализацию которого предполагается установить. Передача детерминанта от донора к реципиенту при цитодукции свидетельствует о цито-плазматической локализации.

В соответствии с этим принципом в гетерокариотическом тесте были локализованы в цитоплазме детерминанты устойчивости к эритромицину (Яровой, 1973), элемент, контролирующий синтез 20S РНК ( Garviek, ЕаЪег , 1978), ш?еЗ (Aigle, Lacroute , 1975), киллер факторы (Сподина, Кожина, 1977; (РоЬ-е et ai. , 1978; Toh-e, Wick-ner , 1979; 1980; wickner , 1980), фактор psi ( link, Conde , 1977, цит. no Sherman , 1982), показана ядерная природа мутации устойчивости к беренилу ( Yatighan et ai. , 1979).

Поскольку цитодуктанты ("цибриды") могут быть получены при слиянии протопластов дрожжей ( Goodey, Bevan , 1982; Katsuoka _et ai, 1982), метод цитодукции может быть использован для доказательства цитоплазматической локализации факторов у дрожжей, у которых половой процесс не обнаружен, или затруднен анализ мейоти-ческих продуктов. У дрожжей Saccharomycopsis lipolytiea была показана таким образом цитоплазматическая локализация признака устойчивости к олигомицину ( Ma-fcsuoka et al. , 1982).

Локализация детерминантов с помощью цитодукции представляет собой экспресс-метод и особенно удобна в случае, если нужно исследовать большое количество штаммов. Примером может служить работа Кокса с соавторами ( Сох et al , 1980) по идентификации ядерных и цитоплазматических супрессоров фактора psi . Фактор psi у s.ce-revisiae , природа которого не установлена, является слабым суп-рессором нонсенс-аллелей УАА и повышает эффективность супрессоров УАА (biehman, Sherman , 1979) и супрессоров сдвигов считывания ( Culhertson et al, 1977). Так, например, супрессор SUQ5 (УАА) в присутствии фактора psi суцрессирует нонсенс-(УАА)-аллели гена ade2 , в отсутствие супрессора приводящие к ауксотрофности по ад-енину и накоплению красного пигмента. В отсутствие psi⁺ супрессор неактивен ( Соя , 1965; 1971). На фоне SUQ5 были получены ревер-танты psi⁺-*psi~ , характеризующиеся красной окраской колоний и скрещены со штаммом SUQ5⁺fcarl [psi+J (красная окраска колоний). В этом скрещивании изолировали индивидуальные зиготы и анализировали их потомство. При реверсии вследствие возникновения ядерного супрессора, обозначенного 2WL , он сегрегировал совместно с SUQ5 при образовании цитодуктантов. В результате появлялись только ци-тодуктанты SUQ5 PHMppsi+J и SUQ5⁺[psi⁺J , накапливающие красный пигмент. При реверсии вследствие инактивации фактора psi у ревертанта psi⁺-*psi~ среди цитодуктантов наряду с зиа5⁺Граі⁺| красного цвета появлялись SUQ5 [psi⁺J белого цвета. Появление колоний белого цвета на среде, селективной для цитодуктантов, не содержащей аденина, свидетельствовало о цитоплазматической природе реверсии. Таким образом авторы проанализировали несколько сотен ревертантов.

Помимо того, что тест с гетерокарионом менее трудоемок, чем анализ сегрегации маркера в мейотическом потомстве, и позволяет поэтому значительно увеличить объем исследуемой выборки штаммов, этот критерий оказывается в ряде случаев более эффективным, как, например в случае локализации 2мкм плазмиды дрожжей и созданных на ее основе химерных плазмид.

2мкм плазмида S.cerevisiae содержится у гаплоидов в количестве 30-50 копий на гаплоидный геном. (Clark-Walker,Miklos, 19746) Характер наследования у гаплоидных мейотических сегрегантов свидетельствует о цитоплазматической локализации плазмиды. Однако результаты теста с гетерокарионом вступают в противоречие с этими данными.

При скрещивании штамма rho⁺, содержащего 2мкм плазмиду ( cir⁴) и бесплазмидного штамма rho~ ( cir), плазмиду получает не более 50% цитодуктантов, несмотря на то, что при случайном перемепшвании плазмид в цитоплазме ожидается частота передачи около 100% (Livingston , 1977; Sigurdson et al. , 1981; Nilsson-Tillgren et al.,I980) Низкие частоты передачи наблюдаются и для химерных плазмид на основе 2мкм ДНК (Юрченко и др., 1983; Юрченко, 1984). Эти данные свидетельствуют о том, что свободная миграция плазмид отсутствует, плазмиды должны быть локализованы внутри какой-либо клеточной органеллы. Повышенная частота передачи плазмиды совместно с хромосомами свидетельствует об их внутриядерной локализации (Sigurdson et al. , 1981).

2-3. Использование сегрегации геномов и плазмонов для изучения взаимодействия ядерных и цитоплазматических генов.

Для исследования взаимодействия генов необходима методика, позволяющая создавать и проверять на взаимодействие большие количества различных комбинаций геномов и плазмонов.

Различные комбинации геномов и плазмойов можно получить при і скрещивании форм, различающихся по ядерным и цитоплазматическим маркерам. Однако при этом гибрид будет объединять не только различные плазмоны, но и различные геномы. Отсутствие изогенности по ядерным генам не позволит изучать в чистом виде ядерно-цитоплаз-матические взаимодействия, в особенности в случае взаимодействия рецессивных ядерных генов. Гаплоидные сегреганты, полученные у гибрида, будут представлять собой продукт рекомбинации родительских геномов, так что изучить взаимодействие родительских геномов с плазмоном опять-таки не удастся. Вместе с тем наличие изогенно-го ядерного фона существенно не только для изучения взаимодействия генома и плазмона, но особенно для изучения взаимодействия и рекомбинации цитоплазматических генов.

Наиболее простым способом получения комбинаций геномов и плаз-монов является отбор сегрегантов гетерокарионов-тетероплазмонов.

Так, например, у A.nidulans было исследовано взаимодействие ядерных мутаций oli-I_r oliC2, oli-4, oli-ЗІ с митохондриальной мутацией oliAI . Гены, маркированные олигомицин-устойчивостьго,контролируют биогенез митохондриальной АТФ-синтетазы. Авторы скрещивали штаммы с ядерными и цитоплазматичеснои мутациями олигомицин-устойчивости и исследовали биохимически гаплоидные сегреганты ге-терокарионов, проявлявшие фенотип, отличный от фенотипа родительских штаммов, в результате взаимодействия мутаций ( Rowlands , Turner , 1977).

Методика получения гаплоидных сегрегантов гетерокарионов была использована и для изучения ядерноголсупрессора митохондриальной мутации poky yHeurospora crassa (Bertrand, Zohout , 1977).

Получение сегрегантов гетерокарионов, содержащих ядро одного из родителей и цитоплазму обоих, было использовано для изучения комплементации митохондриальных мутаций mi и року у п.crassa ( Pittenger , 1956).

2-4. Использование цитодукции у S.cerevisiae для изучения взаимодействия ядерных и цитоплазматических генов. У s.cerevisiae методика цитодукции была использована для изучения взаимодействия ядерных супрессоров с митохондриальными мутациями mit" ( Dujardin et аХ. , 1980). Авторы получили несколько сотен ревертантов мутаций miir . Была исследована специфичность полученных супрессоров в отношении 250 мутаций mit~. Среди супрессоров были митохондриальные и ядерные - доминантные и рецессивные. Специфичность митохондриальных и доминантных ядерных еупрес- соров исследовали на диплоидном уровне, рецессивных ядерных суп-рессоров - на гаплоидном уровне, для чего использовали методику цитодукции. У штаммов с рецессивным ядерным супрессором получали мутанты гііо⁰, скрещивали мутанты Sup* rh.o со штаммом m±t~ barl-I и перепечатывали скрещивание на среду с глицерином вместо глюкозы в качестве источника углерода. На этой среде могли вырастать только цитодуктанты Sup⁺ mit" , в случае, если происходила супрессия мутаций mit" и восстановление дыхательной компетентности. Метод отпечатков позволил быстро идентифицировать среди мутаций тііГ супрессируемые. Без применения методики цитодукции оказалось бы невозможным исследование специфичности рецессивных ядерных су-прессоров в таких масштабах ( проверено 54 супрессора, 250 мутаций mit").

Методика цитодукции позволяет перекомбинировать геномы и плаз-моны в скрещиваниях, в которых один из родителей был обработан каким-либо агентом. Так, например, Степанова и Захаров (1983) обрабатывали один из скрещиваемых гаплоидов ^-излучением, затем получали цитодуктанты, содержащие облученное ядро и необлученную цитоплазму, и наоборот. Это позволило четко дифференцировать роль повреждений ядра и цитоплазмы в гибели клетки.

Поскольку методика цитодукции позволяет получить сегреганты гетерокарионов с гаплоидными ядрами, прошедшими через скрещивание это позволило продемонстрировать индуцибельность системы рекомбинации у дрожжей ( Eabre, Roman , 1977). Авторы скрещивали облученный рентгеновыми лучами гаплоид karl с необлученным диплоидом,ге-тероаллельным по айе2 , и отбирали цитодуктанты, получившие диплоидное ядро. Несмотря на то, что хромосомы облученного гаплоида и необлученного диплоида в гетерокарионе были пространственно разобщены, среди диплоидных цитодуктантов была повышена частота ре-комбинантов по аае2 по сравнению с контролем. Это послужило од- ним из доказательств того, что облучение индуцирует рекомбинацию не просто за счет индукции разрывов в ДНК, но за счет активации специализированных систем рекомбинации.

Методика цитодукции была также использована у S.cerevisiae для изучения рекомбинации митохондриальных генов. В работе Кальдма (1975) были сконструированы изохромосомные и анизомитохондриаль-ные штаммы с митохондриями из нескольких гомо- и гетероталличных штаммов S.cerevisiae и S.paradoxus . Оказалось, что происхождение митохондрий влияет на частоту и полярность рекомбинации.

Возможность получения изогеномных и гетероплазмонных штаммов методом цитодукции с целью изучения рекомбинации и взаимодействия митохондриальных генов была также исследована в нескольких других работах ( Uagley, Irfnnane , 1978; bankashire, Mattoon , 1979).

2-5. Парасексуальный процесс в генетическом анализе Основные возможности для картирования, предоставляемые использованием парасексуального процесса были сформулированы в ранних работах по исследованию этого процесса ( Pontecorvo , 1956; Pontecorvo, Eafer » 1958).

Первым этапом генетического анализа с использованием парасексуального процесса, является конструирование гетерокариона, а затем диплоида, гетерозиготного по картируемому маркеру. При этом скрещиваемые формы должны быть дополнительно маркированы. Локализация исследуемого маркера производится относительно этих дополнительных маркеров. У полученного диплоида изучают спонтанную или индуцированную гаплоидизацию и митотическую рекомбинацию. Га-плоидизация обеспечивает определение группы сцепления, к которой принадлежит исследуемый маркер, а митотическая рекомбинация - локализацию относительно центромера и других маркеров группы сцепления.

Картирование при парасексуальном процессе является единственн-ным методом гибридологического анализа у видов, лишенных полового процесса. Традиционно этот метод применяли к мицелиальным грибам рода Aspergillus .

Использование методики слияния протопластов позволило получить гетерокарионы и диплоиды у дрожжей, у которых половой процесс не обнаружен. В связи с этим появилась возможность картирования у этих организмов с использованием парасексуального процесса. Таким образом был проведен генетический анализ у Candida albicans ( Poulter et al , 1981; Eakar, Hagee , 1982).

2-6. Генетический анализ у S.cerevisiae с использованием элементов парасексуального процесса. У диплоидов S.cerevisiae для картирования используется индуцированная митотическая рекомбинация (Nakai, Mortimer , 1969; Mortimer, Hawthorne , 1973; VJickner , 1979) и гаплоидизация ( KLapholz, Esposito , 1982; Wood , 1982).

Элементы парасексуального процесса в гетерокарионах S.cerevisiae также могут быть использованы для картирования. Датчер при исследовании переноса хромосом при цитодукции, отметила, что совместный перенос исследуемого маркера и хромосомных маркеров может служить критерием его локализации в данной группе сцепления ( DutcherI98I).

Еще более интересное применение методу переноса хромосом при цитодукции нашла группа датских исследователей. В серии работ этой группы сообщалось о переносе хромосомы Ш ( Nilsson-Tillgren et al. 1981), а затем хромосомы У (Holmberg et al. , 1982) из промышленного штамма Saccharomyces carlsbergensis в S.cerevisiae . При этом были получены цитодуктанты как с дополнительной хромосомой из S.carlsbergensis > ^так и цитодуктанты с хромосомой Ш (или У) S.cerevisiae , замещенной на хромосому из S.carlsbergensis . Пито- дуктанты с замещенной хромосомой скрещивали со штаммами S.cerevisiae Тетрадный анализ полученных гибридов показал, что в хромосомах Ш и У S.carlsbergensis , имеются лишь ограниченные участки гомологии с соответствующими хромосомами S.cerevisiae , по которым происходит рекомбинация. В негомологичных участках рекомбинация отсутствует. Было также показано, что в геноме s.carlsbergensis содержится еще один тип хромосомы Ш (и У), негомологичной хромосоме Ш (У) S.cerevisiae . В целом эти данные свидетельствуют о том, что геном S.carlsbergensis состоит из двух геномов: частично гомологичного и негомологичного геному S.cerevisiae . Таким образом, методика отбора цитодуктантов с переносом хромосом позволяет осуществлять геномный анализ у Saccharomyces - устанавливать гомологию и гомеологию геномов и хромосом.

Перенос плазмид, локализованных в дрожжевом ядре, также можно отнести к элементам парасексуального процесса у дрожжей.

Перенос химерных плазмид при цитодукции может служить дополнением к существующим методам генетической инженерии. Методика цито-дкции технически проще, чем трансформация ( Hinnen et al. , 1978;

Ito et al. , 1983), может быть применена к штаммам, у которых снижена способность к трансформации. Плазмиды in vivo претерпевают перестройки. Так, например, существуют данные о рекомбинации 2мкм ДНК и химерных плазмид с репликатором 2мкм ДНК ( Toh-e, Wi - cbner » 1981), о рекомбинации химерных плазмид с репликатором 2мкм ДНК при совместной трансформации этими плазмидами (Захаров и др., 1982). Технически проще было бы выделить такие рекомбинанты при цитодукции путем селекции по маркерам, которые желательно объединить у рекомбинантов. Поскольку при цитодукции переданное число копий плазмиды ограничено (Sigurdson et al. , 1981; ТоЬ-е, Wicbner , 1981), выборка цитодуктантов с переносом плазмид при одновременной селекции по маркерам обеих плазмид, должна быть обо- гашена рекомбинантами. Перенос при цитодукции гоїазмид эписомного типа, каковыми например являются химерные плазмиды с фрагментами 2мкм ДНК, возможно, позволит клонировать ядерные гены in vivo , так как при интеграции и дальнейшем исключении из хромосом эти плазмиды могут захватывать фрагменты ДНК дрожжей.

3. Заключение.

Обнаружение явления гетерокариоза и цитодукции у дрожжей позволило разработать у s.cerevisiae методы генетического анализа, аналогичные используемым у других видов грибов. Цитодукция как метод картирования, конструирования штаммов с заданными комбинациями геномов и плазмонов была использована во многих генетических исследованиях. Возможности этого метода не исчерпаны.

В связи с низкой частотой цитодукции для изучения этого явления и использования в генетическом анализе необходимы методы селекции цитодуктантов.

Впервые оригинальную полуселективную систему выделения цитодуктантов предложили Захаров с соавторами (1969). Донор цитоплазмы в этой системе маркирован ядерной мутацией дыхательной некомпетентности alc4 , а реципиент цитоплазмы - ядерной мутацией айе2 и ци-топлазматической мутацией дыхательной некомпетентности гЬо". Нотация ade2 приводит к накоплению красного пигмента у штаммов rho⁺ но не у штаммов гїю". На среде, содержащей этанол вместо глюкозы в качестве источника углерода, и аденин, донор Pet" Ade⁺ и реципиент Pet" Ade" не растут, так как не способны усваивать этанол. Способны к росту на этой среде гибриды Pet⁺ Ade⁺ и цитодуктанты Pet⁺ Ade~ . Цитодуктанты можно отличить от гибридов по красной окраске колоний. Поскольку на селективной среде вырастают не только цитодуктанты, но и гибриды, эту систему нельзя считать селективной в строгом смысле слова. Цитодуктанты составляют менее

1% колоний, вырастающих на селективной среде, что создает трудности при их выделении.

Другие применяемые в настоящее время методы позволяют селектировать только цитодуктанты. Эти методы основаны на использовании в качестве селективных маркеров рецессивных мутаций устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Так, например, в системе, использованной Конде и Финном для отбора мутантов Kar⁺ , реципиент rho~ несет рецессивные мутации устойчивости к канаванину ( сапі) и нистатину ( Hys^R). На селективной среде с глицерином в качестве источника углерода, канаванином и нистатином не растут донор и гибрид, чувствительные к канаванину и нистатину, реципиент - дыхательно-некомпетентный,- вырастают только цитодуктанты Pet⁺ Can^R Nys¹¹ ( Conde, Jink, 1976). Аналогично используется рецессивная мутация устойчивости к циклогексимиду ( Dutcher , 1981; Sigurdson et ai. , 1981). Ряд авторов использует двойную селекцию цитодук-тантов - по устойчивости к антибиотикам и по окраске колоний ( Hilsson-Iingren et al. , 1980; ІОрченко и др., 1983; Юрченко 1984). (Табл.1).

В нашей работе мы поставили задачу разработать селективную систему цитодукции на основе штаммов Петергофских генетических линий дрожжей. Система должна была обладать универсальностью, то есть предоставлять возможность переноса митохондрий, плазмид,хромосом, а так же отбора мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой ( Hfc⁺- Захаров и др. 1969).

Мутанты Hfc⁺ мы предполагали использовать для повышения эффективности селекции цитодуктантов в нашей системе. Кроме того получение таких мутаций представляло интерес для изучения генетического контроля цитодукции. Несмотря на то, что получен ряд мутаций, повышающих цитодукцию, систематическое изучение генетического контроля этого процесса затруднено в связи с несовершенством ме-

Таблица I

Селективные системы цитодукции

Донор и реципиент

Цитодуктанты

Автор

Д: rho⁺ a ale4 ADE2

Р: rho" о( ALC4 ade2

Д: rho⁺ a САЖІ NYS^S

Р: rho"" «< canl nys

Захаров и др., 1969 о( Pet⁺Ade" U Pet⁺ Can^R ITys^R Conde, Fink, 1976

Ы Pet⁺ Can^R Ade" oi Pet⁺ Cyh^R Ade~

Д: rho⁺6< karl-I CTH^S a Pet⁺ Cyh^R p_: rho" a KARI cyh^R

Д: rho⁺ a EARI CANI ADE2 P: rho" U karl canl ade2

Д: rho⁺ а СУНА ADE2 P: rho" <^ cyhA ade2 Duteher, I981; Sigur-dson et al., 1981 Nilsson-Tillgren et al., 1980

Юрченко и др., 1983 Юрченко, 1984

ПРИМЕЧАНИЕ: Указана только часть генотипа (фенотипа), существенная для селекции цитодуктантов. "Д" - донор, "Р" - реципиент. ade2 - мутация, приводящая к потребности в аденине и накоплению красного пигмента; alc4 - ядерная мутация, rho" - цитоплазмати-ческая мутация, приводящие к дыхательной некомпетентности; canl, nys^R , cyh^R , cyhA - мутации устойчивости к канаванину, нистатину, циклогексимиду, соответственно. тодик выделения мутантов.

В настоящее время известно несколько способов получения мутаций Efc⁺ ( Еаг⁺). Прежде всего это методика, разработанная Конде и Шинком: неселективный поиск мутантов Каг⁺ среди цитодуктантов, полученных после обработки мутагеном реципиента (Conde , Pink, 1976). Методика трудоемка и малоэффективна. Для повышения ее эффективности авторы стали выявлять мутанты не по признаку повышения частоты цитодукции, а по признаку ослабления комплементации при выделении гибридов ( Poiaina, Conde , 1982). Поскольку идентификация мутантов проводится по ослаблению комплементации при выделении гибрида, кроме того поиск идет среди цитодуктантов, прошедших через скрещивание, это сужает спектр выявляемых мутаций.

Другой способ - поиск мутаций, повышающих частоту цитодукции, среди мутаций, затрагивающих жизненно-важные функции клетки ( Dut-cher, Hartwell» 1982). Эта методика также неселективна, спектр выявляемых мутаций также ограничен.

В связи с отсутствием селективной методики получения мутантов Hfc*,нашей задачей была также разработка метода, позволяющего селективно выделять мутанты Hfc⁺B разработанной нами системе цитодукции и оценивать частоту их возникновения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Г л а в а 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

I. Исходные штаммы Объектом исследования служили гаплоидные штаммы Петергофских генетических линий дрожжей (Инге-Вечтомов, 1963; 1971). Номенклатура и генотипы исходных штаммов представлены в табл.2. Обозначения генов соответствуют общепринятым ( Shermn , 1981). adel-б , his7-S,13*39-^21 _>leu2-2 (УАА), thr4-BI5 (УГА) ,2уа2-АІ2(УАГ ): нонсенс-аллели, природа остальных маркеров неустановлена.

2. Среды и условия культивирования штаммов Для выращивания штаммов были использованы среды следующего состава (на 1л дистиллированной воды): а). Среда TAPD: пептон 20г, глюкоза 20г, дрожжевой автолизат 10мл, агар-агар 20г. б). Среда для микроманипулирования: отличается от taps тем, что вместо 20г обычного агар-агара содержит 25г агар-агара " Difco". в). Среда СП: отличается отїШ) тем, что содержит вместо глюкозы 20мл этанола. г). Минимальная среда М: глюкоза 20г,Ен₂Р04 " 0,9г, К2НРО4 -0,1г, MgSO^- 0,5г, (l^4)2^S04 - 3»Е>^Г> тиамин 200мг, биотин 2мкг, &-ала-нин 500мкг, агар-агар 20г. д). Среда АЛК: отличается от М тем, что вместо глюкозы содержит 20мл этанола. е). Среда ААК: глюкоза 20г, КН₂Р04 -0,9г,К2НРС>4 - 0,1г, MgStty -0,05r,D- Ъ -oi-ашшоадипиновая кислота "Sigma " 1,5г, лизин 30мг, тишшн 200мкг, ^,-аланин бООмкг, биотин 2мкг, агар-агар"Difco "20г.

Таблица 2

Исходные штаммы

Штамм Генотип

7А-ПІ92 ЕкТз. adel-б his7-I meUI

42Б-Е3990 МТа adel-14 his7-I lys2-AI2

60Б-П3990 хазе* adel-14 his7-I thr4-BI5 metA.1 І8В-П3663 HAT* ade2-I63 his7-I leu2-2

38А-ГО663 MAT* ade2-I63 adel-б lys2-AI2 thr4-BI5 leu2-2

4Б-П3663 HA.Ta ade2-I63 his7-I thr4-BI5 metAJ leu2-2

8А-П3924 HAT* adel-б his7-I leu2-2 asp5-07 ІГ-П3736 MAT* lys2-AI2 ф2-с/»І M^ leu2-2 phol-100

ДС5 Mia his3-II,I5 Ieu2-3,II2 І4Г-Д290 HATa adel-14 his7-I metAI karl-I І2Б-Д290 HAT* adel-14 leu2-3 mettl karl-I

2В-Д290 MAT* adel-14 leu2-3 metAI

ПРИМЕЧАНИЕ: ДС5 - штамм из генетических коллекций США; 14г-, І2Б-2В-Д290 - штаммы гибридного происхождения, любезно предоставлены А.А.Филатовым, (каф. генетики ЛГУ).

При необходимости в М, АЛК, ААК добавляли аминокислоты и азотистые основания, в которых нуждались штаммы: аденин 20мг, гисти-дин 20мг, лизин 30мг, метионин 20мг, треонин 150мг, лейцин 30мг, аспарагиновая кислота 100мг. ж). Среда для индукции споруляции АЦ: сн^соок - Юг, агар-агар 20г. Штаммы инкубировали при 30С, за исключением случаев, оговоренных особо;

3. Методы

В ходе работы использованы стандартные методики частной генетики дрожжей (метод рассева истощающим штрихом, метод селективных сред, метод отпечатков), которые в связи с их широкой распространенностью мы описывать не будем (см. Захаров и др. 1976; Йнге-Ве-чтомов, 1982).

Разработанный нами качественный тест на цитодукциго, и созданные на его основе методика отбора цитодуктантов с переносом митохондрий, хромосом, плазмид, получения мутантов, способных к цито-дукции с повышенной частотой ( Hfс⁺), постановки теста на доминантность признака Hfc⁺, описаны в гл.3-5.

Разработанный нами экспресс-тест различения гаплоидов и авто-диплоидов описан в гл.4.

I Отбор мутантов При индукции мутантов ультрафиолетовым светом источником облучения служили две спаренные лампы БУВ-30 (мощность излучения 5 дж/сек иг).

1-І. Индукция мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой ( Hfc⁺) Исходный штамм рассевали истощающим штрихом на YAPD для получения отдельных клонов. Клон отсевали на YAPD. Через сутки клетки суспендировали в 10мл дистиллированной воды (густота 10 мл ) и облучали в чашке Петри ультрафиолетовым светом при перемешивании (доза 300 дж/м²). Облученную суспензию разводили в ТО² и рас-севали по 0,1мл на yapd (вырастало около 200 колоний на чашку). Одновременно высевали на YAPD по 0,1мл необлученной суспензии, разведенной в ТО⁴ раз. Выживаемость (количество колоний на чашку из рассева облученной суспензии / количество колоний на чашку из рассева необлученной суспензии) составляла около 1%. Методы идентификации мутантов Hfc⁺ описаны в гл.4.

1-2. Отбор дыхательно-некомпетентных мутантов Спонтанные дыхательно-некомпетентные мутанты rho" выделяли, рассевая исходный штамм на yapd . На третьи сутки инкубирования отсевали мелкие колонии, проверяли, распечатывая на СП, и отбирали rho" . Кроме того, мы индуцировали мутации rho~, рассевая исходные штаммы на среде YAPD с 60 мг/л бромистого этидия. После трех пересевов рассевали штаммы истощающим штрихом на yapd . Все отобранные колонии оказывались дыхательно-некомпетентными. Методика обработки бромистым этидием позволяет получить мутанты rho⁰ лишенные митохондриальной ДНК ( Sionimski et al. , 1968).

1-3. Отбор мутантов по гену Iys2 При получении мутантов по гену lys2 ( chat-boo et al , 1979), исходные штаммы клонировали, рассевая истощающим штрихом на yapd, затем .отсевали по 32 клона на чашку Петри на YAPD. Через сутки перепечатывали на среду ААК и облучали ультрафиолетовым светом (доза 300 даАг), затем инкубировали 3-4 суток. Появляющиеся коло' нии клонировали и проверяли на селективных средах.

2. Гибридологический анализ Методика тетрадного анализа приведена в ( Sherman , 1975).Изоляцию аскоспор осуществляли с помощью микроманипулятора MMI. Для каждой пары маркеров мы проверяли соответствие соотношения типов тетрад 1Р:Ш:4Т или 1(Р+Н):2Ш теоретически ожидаемому при отсутствии сцепления маркеров между собой и с центромерами. Сцепление между генами (в сантиморганах) оценивали по формуле: D=C0,5f/T/ + 2/&/)х ЮО где f/т/ - частота тетратипов, f/н/ - частота неродительских ди-

Таблица З Соотношение типов тетрад у трисомика (2п+1) ІРШДЕЧАНИЕ: А,В - аллели одного гена у трисомика А/А/В. s - частота тривалентной конъюгации (от 0 до І), в - вероятность того, что две хроматиды, присоединенные к одному центромеру, будут нести идентичные аллели ( s=2r-(4/3)r² , где г - частота рекомбинации ген-центромер, определенная в расщеплении диплоидов. г брали из сводки Мортимера и Шильда ( Mortimer , Shild , 1980)). типов.

При анализе аномального расщепления по маркерам хромосомы Ш мы использовали формулы для определения соотношения типов тетрад у трисомика ( Shaffer et ai, 1971) (табл.3).

Цри анализе соотношения фенотипов в случайной выборке аскоспор теоретически ожидаемое для триплоида (А/А/В) рассчитывали, исходя из соотношения генотипов 2А/В:1А/А:2А:1В для маркеров, сцепленных с центромером, 6А/А:8А/В:1В/В:10А:5В для маркеров, не сцепленных с центромером (Савченко, 1970).

3. Тест на супрессивность мутаций йкГ. %танты riio" и тестерный штамм rho⁺ рассевали истощающим штрихом на YAPD . Через трое суток проводили скрещивание мутантов с тестерным штаммом. Для этого на поверхность плотной XAPD нанасили каплю (0,1 мл) дистиллированной воды. В каплю переноси- ли колонию мутанта rho" и тестера rho"*" и тщательно перемешивали. Инкубировали смесь культур при 30 в течение четырех часов. Затем смывали клетки и высевали на среду, селективную для роста гибридов. Через трое суток выраставшие в виде отдельных колоний гибриды (около 200 на чашку Петри) перепечатывали на СП. Супрессивность определяли как отношение числа гибридов rho~ к общему количеству гибридов ( Ephrussi et al , 1955).

4. Оценка частоты спонтанного ревертирования

При оценке частоты ревертирования ауксотрофных по аденину гаплоидов и диплоидов использовали методику флуктуационного тесна.

Из отдельной колонии используемой культуры приготовляли суспензию густотой 10 мл" . Суспензию выносили на селективную среду полуобогащенную аденином (концентрация аденина в этой среде ниже стандартной в 12,5 раз и составляет 1,6 мг/л). При нанесении суспензии на среду использовали метод упорядоченного посева (Хромов-Борисов, 1973). 0,1 мл суспензии (около 10 клеток) наносили на селективную среду специальным репликатором в виде упорядочению расположенных равноудаленных друг от друга 151 капли. На месте капель впоследствии формировались макроколонии клеток, ауксотрофных по аденину. Рост макроколоний прекращался после истощения в среде аденина. На поверхности макроколоний, прекращавших рост,через 7-9 суток инкубирования появлялись колонии вторичного роста, возникавшие в результате деления клеток ревертантов, прототрофных по аденину.

Метод упорядоченного посева позволяет выявить распределение Пуассона для вторичных колоний ревертантов на макроколониях. Соответствие распределению Пуассона проверяли по методу Кемпбелла и Оприана (Campbell , Oprian , 1979).

Распределение Пуассона характеризуется параметром Я - средним значением (в нашем случае среднее количество вторичных колоний ревертантов на макроколонию). В качестве оценки этого параметра использовали выборочное среднее ж (число вторичных колоний ревертантов, деленное на количество макроколоний). Стандартную ошибку s_m рассчитывали по формуле:

5_m JuJL. , где и - число колоний вторичных ревертантов,

Ж - количество макроколоний.

Частоту образования ревертантов на клетку на генерацию (М) определяли по формуле (von Borstel , 1978): М s ~- , где с - количество клеток в макроколонии после остановки роста.

При определении с поступали следующим образом: макроколонии без колоний вторичного роста смывали с селективной среды и определяли количество клеток в полученной суспензии методом последовательных разведений. В случае, если макроколонии без колоний зторичного роста отсутствовали, о определяли, смывая макроколоши до появления на них колоний вторичного роста (5е сутки инкубирования) .

5і Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили стандартными

5иометрическими методами (Глотов и др., 1982).

В качестве оценки параметрар биномиального распределения ис- юльзовали относительную частоту (или просто частоту, или долю): b«g . __, , где к - число наблюдаемых событий, S. _s +\|b(I-h) п - объем выборки. п і it ^

Однородность полученных результатов проверяли по критерию /( [о таблице сопряженности.

Соотношение типов тетрад в тетрадном анализе сравнивали с тео-іетически ожидаемым по критерию X

Гетерокариоз в жизненном цикле грибов

Возможности для образования гетерокарионов создаются при много-ядерности клеток. Для многих видов грибов характерна более или менее продолжительная стадия многоядерности клеток в жизненном цикле (рис.2).

Вегетативная стадия многих видов представлена мицелием, который нередко состоит из многоядерных клеток. Так, например гифы мицелия Hiyeomycetes лишены клеточных перегородок, весь мицелий представляет собой так называемый коэноцит. У мицелиальных Аесо-mycetes гифы мицелия разделены перегородками (септами), которые перфорированы, через поры в септах возможна свободная миграция ядер и цитоплазмы по всему мицелию. У Basiuiomycetes гифы разделены на клетки перфорированными септами, у многих видов клетки многоядерны, либо во всем мицелии, либо только апикальные. При наличии генетических различий между ядрами форма представляет собой гетерокарион (гетерокариотический монокарион) ( Burnett, 1974) Вместе с тем гетерокарионы у грибов могут возникать на основе дикарионов. Клетки дикарионов содержат по два ядра, различающихся по факторам половой совместимости. Стадия дикариона предваряет образование диплоида при половом процессе. Продолжительность этой стадии зависит от особенностей жизненного цикла. Можно выделить у грибов пять основных жизненных циклов, различающихся по относительной продолжительности гаплоидной и диплоидной стадии: асексуальный, диплоидный, гаплоидный, гаплоидно-диплоидный и гаплоидно-дикариотический (Biimeit , 1974). (Основные характеристики этих жизненных циклов представлены в подписи к рис.2). Существование вегетативно размножающихся дикарионов характерно для гаплоидно-ди-кариотического жизненного цикла. Стадия дикариона непродолжительна у некоторых видов (Feurospora crassa ), у других видов составляет основную часть жизненного цикла (Ustllago maydis ). Промежуточное положение занимают виды (Goprinus, Schisophillum ), у которых как гаплоидная, так и дикариотическая формы способны к длительному вегетативному размножению. При наличии генетических различий между ядрами в дополнение к различиям по факторам половой совместимости форма представляет собой гетерокарион (гетерокарио-тический дикарион - Burnett , 1974).

Отбор мутантов

-І. Индукция мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой ( Hfc+) Исходный штамм рассевали истощающим штрихом на YAPD для получения отдельных клонов. Клон отсевали на YAPD. Через сутки клетки суспендировали в 10мл дистиллированной воды (густота 10 мл ) и облучали в чашке Петри ультрафиолетовым светом при перемешивании (доза 300 дж/м2). Облученную суспензию разводили в ТО2 и рас-севали по 0,1мл на YAPD (вырастало около 200 колоний на чашку). Одновременно высевали на YAPD по 0,1мл необлученной суспензии, разведенной в ТО4 раз. Выживаемость (количество колоний на чашку из рассева облученной суспензии / количество колоний на чашку из

рассева необлученной суспензии) составляла около 1%. Методы идентификации мутантов Hfc+ описаны в гл.4.

1-2. Отбор дыхательно-некомпетентных мутантов Спонтанные дыхательно-некомпетентные мутанты rho" выделяли, рассевая исходный штамм на YAPD . На третьи сутки инкубирования отсевали мелкие колонии, проверяли, распечатывая на СП, и отбирали rho" . Кроме того, мы индуцировали мутации rho , рассевая исходные штаммы на среде YAPD с 60 мг/л бромистого этидия. После трех пересевов рассевали штаммы истощающим штрихом на YAPD . Все отобранные колонии оказывались дыхательно-некомпетентными. Методика обработки бромистым этидием позволяет получить мутанты rho0 лишенные митохондриальной ДНК ( Sionimski et al. , 1968).

1-3. Отбор мутантов по гену Iys2 При получении мутантов по гену lys2 ( chat-boo et al , 1979), исходные штаммы клонировали, рассевая истощающим штрихом на YAPD, затем .отсевали по 32 клона на чашку Петри на YAPD. Через сутки перепечатывали на среду ААК и облучали ультрафиолетовым светом (доза 300 даАг), затем инкубировали 3-4 суток. Появляющиеся коло нии клонировали и проверяли на селективных средах.

Принципиальная схема селективной системы цитодукции

Нашей целью была разработка высоко селективной системы цитодукции у штаммов Петергофских генетических линий.

Очевидно для создания селективной системы можно воспользоваться любыми рецессивными мутациями, для которых существуют селективные системы выделения. Для штаммов Петергофских генетических линий характерна устойчивость к низким концентрациям циклогексимида, канаванина, что затрудняет использование в качестве селективных маркеров рецессивных мутаций устойчивости к этим антибиотикам. Мы предпочли поэтому использовать хорошо изученные в нашей лаборатории мутации в генах, кодирующих рибосомные белки: sttpi из-ыр2 , -обладающие рецессивным супрессорным фенотипом (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970; Сургучев, 1984).

Селекцию цитодуктантов предполагали осуществлять в системе из двух штаммов противоположного типа спаривания, которые должны нести комплементарные мутации supl и sup2 , и одну и ту же суп-рессируемую рецессивными супрессорами мутацию, например, нонсенеы adel-б и Ms7-I (УАА), или adel-14 (мутация неизвестной природы). (Рис.3). Среда, селективная для цитодуктантов, должна была содержать этанол в качестве источника углерода, и все необходимые для роста реципиента метаболиты за исключением глюкозы. На этой среде не должны расти дыхательно-некомпетентный (неспособный усваивать этанол) реципиент и донор, содержащий дополнительные селективные маркеры ауксотрофности. Поскольку в среде отсутствуют аденин или гистидин, не должны расти также гибриды, ауксотрофные по аденину и гистидину, так как они гомозиготны по нонсенс-аллелям и гетерозиготны по рецессивным супрессорам.

Метод отбора мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой

Впервые влияние генотипического фона на частоту цитодукции показали Захаров с соавторами (1969). В 1976 г. Конде и Финк получили мутацию karl-I , повышающую частоту цитодукции ( Conde , Шик, 1976). В дальнейшем Полаина и Конде получили аналогичные мутации kar2 и Ш13 ( Polaina , Conde , 1982). Эти мутации приводят к блоку кариогамии и образованию нестабильных гетерокарионов, в ходе митотических делений которых сегрегируют цитодуктанты.

Присутствие мутации kaxl-l не только повышает частоту цитодукции до 95%, но и по данным ряда авторов приводит к увеличению частоты переноса хромосом в несколько десятков раз ( Butcher , 1981; Polaina , Conde, 1982).

Для увеличения селективности системы цитодукции мы предполагали получить мутации, повышающие частоту цитодукции ( Hfc+ . В связи с этим была предпринята разработка метода селекции таких мутантов, основанного на использовании нашей селективной системы.

I. Метод отбора мутантов, способных к цитодукции с повышенной частотой ( Нс+) Для отбора мутантов Не+ мы видоизменили методику качественного теста на цитодукцию. Отдельные колонии донора (примерно по 200 колоний на чашку), выросшие из рассева облученной суспензии, печатали на чашки T&PD , предварительно засеянные газоном (10 клеток) реципиента, и через двое суток перепечатывали на среду, селективную для цитодуктантов. С матричных чашек отбирали колонии донора, на отпечатках которых возникало повышенное количество цитодуктантов (рис.11), рассевали истощающим штрихом, затем проверяли по четыре клона в качественном тесте на цитодукцию.

Отбор цитодуктантов с переносом хромосом II и III (исключительных цитодуктантов)

Схема экспериментов по переносу хромосом П и Ш представлена на рис.14. Донорами хромосом служили 7А-ПІ92 и мутанты Hfe+, реципиентами - мутанты по гену LYS2 , полученные у I-ayI6-3IB-П3585 (л5-, л8-І-ауІ6-ЗІВ-ГО585). Реципиенты были маркированы Ieu2-I » his4-B26 t thr4-BI5 по хромосоме Ш, и Ms7-I и 2ys2 по хромосоме П; доноры, соответственно, LEU2 , HIS4 , IHR4 и bis7-I, LTS2 . Цитодуктанты с переносом хромосомы П или Ш должны были быть прототрофами или по лизину, или совместно по лейцину, гисти-дину и треонину, поэтому их отбор мы вели на средах без лизина, или без лейцина, соответственно.

В случае переноса хромосомы Ш маркеры his4 и thr4 были не селективными, и прототрофность по ним, а также отсутствие способности к копуляции (вследствие гетерозиготности по МАТ), служили дополнительным критерием переноса хромосомы.

Колонии, отобранные на селективных средах, рассевали истощающим штрихом, и в дальнейшем проверяли по 2-4 клона каждой колонии на серии селективных сред, СП и в тесте на копуляцию. Перенос хромосомы регистрировали в случае, если хотя бы один из нескольких проверенных клонов, полученных из рассева одной колонии, оказывался исключительным цитодуктантом (то есть, колония содержала клетки с переносом хромосомы).