Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
Генетические регуляторные элементы, контролирующие экспрессию структурных локусов у эукариот.
Гормональная регуляция развития насекомых 20
Влияние высокой температуры на развитие насекомых. 54
III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 61
Характеристика линий 101 и 147 Drosophiia viriiis. . 61
Характеристика спектра эстераз линий 101 и 147 Drosophiia viriiis. 62
Электрофорез в крахмальном геле 63
Электрофорез в полиакриламидном геле 64
Гистохимическое выявление эстеразной активности 65
Количественная оценка активности ЮГ-эстеразы 65
Получение антисыворотки против ЮГ-эстеразы 66
Метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлони в модификации Гусева и Цветкова 68
Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини. 69
Иммунологическая техника непрямого окрашивания флуоресцирующих антител по методу Кунса 70
Синхронизация культур Drosophiia viriiis 71
Изучение влияния высокой температуры на состояниенейросекреторной системы мозга личинок D.viriiis.. 71
Получение тотальных препаратов кольцевой железы, слюнной железы и имагинальных дисков 74
Влияние высокой температуры на активность ПТЖ личинок термочувствительной 147 линии D.viriiis 75
Обработка экзогенными гормонами (КГ и Л -экдизоном) устойчивой (101) и неустойчивой (147) к действию высокой температуры ЛИНИЙ D.viriiis "76
Селекция термоустойчивой сублинии из неустойчивой линии D.viriiis 77
Статистическая обработка результатов 77
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ 79
Влияние высокой температуры на состояние нейросекреторной системы мозга личинок линии 101 и 147 Drosophila virilis 79
Влияние высокой температуры на состояние кольцевой Железы личинок линии 101 И 147 Drosophila virilis.. 85
Влияние повышенной температуры на размеры имагинальных дисков, слюнных желез и кольцевой железы линии 101 и 147 Drosophila virilis 87
Влияние повышенной температуры на спектр эстераз личинок линии 101 И 147 Drosophila virilis 91
Влияние oi -экдизона и аналогов КГ на спектр эстераз и выживаемость особей линий 101 и 147 D.viriiis в условиях нормальной температуры 97
Влияние oi -экдизона и ZR-512 на выживаемость линий 101 и 147 D.viriiis в условиях высокой температуры 97
Влияние аналога ИГ (ZR-512) на размеры слюнных желез, имагинальных дисков и ПТЖ личинок линии 147 в различных температурных условиях 99
Селекция термоустойчивой сублинии 102
Анализ неиросекреторнои системы, эндокринной системы и активности КГ-эстеразы у личинок сублинии в различных температурных условиях 105
Генетический контроль уровня активности ЮГ-эстеразы и выживаемости D.viriiis в условиях высокой температуры
Стадио- и органоспецифичность КГ-эстеразы у Dro-sophila virilis 127
Влияние высокой температуры на содержание ЮГ-эстеразы у Drosophdla virilis 129
V. ОБСУЖДЕНИЕ 134
VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 147
VII. ВЫВОДЫ 149
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 151
- Генетические регуляторные элементы, контролирующие экспрессию структурных локусов у эукариот.
- Характеристика линий 101 и 147 Drosophiia viriiis.
- Влияние высокой температуры на состояние нейросекреторной системы мозга личинок линии 101 и 147 Drosophila virilis
title1 Генетические регуляторные элементы, контролирующие экспрессию структурных локусов у эукариот
Регуляция экспрессии генов у эукариот в ходе их индивидуального развития, при изменяющихся условиях внешней среды является одной из основных проблем современной генетики.
В настоящее время установлено, что координация функционирования структурных генов осуществляется, в определенной степени, регуляторними локусами, контролирующими экспрессию первых (Swank et al., 1973; Dickinson, 1975,1978; Paigen et al., 1975, 1976; Chovnic et al.,1976,1980 ; Abraham , Doan, 1978; КОРОЧКИН И др., 1978; Mc Donald, Ayala , 1978; Paigen, 1979; Корочкин, 1982).
Контроль экспрессии структурных генов может осуществляться на нескольких уровнях - от транскрипционного до посттрансляционного. Процессы, вовлекаемые в регуляцию, включают детерминацию: I) скорости транскрипции; 2) последующего процес-синга и транспорта и-РНК; 3) скорости трансляции, посттранс -ляционных модификаций, деградации и связывания с мембранами; 4) синтеза индукторов или ингибиторов синтеза мембранных белков, контролирующих межклеточные взаимодействия (Paigen,1979; Корочкин, 1982).
Достаточно часто активность ферментов определяется не только кодирующими их структурными локусами, а в значитель -ной степени зависит от генов-регуляторов. Используя инбред -ных мышей и Drosophila многие исследователи изучали функции регуляторных генов (Swank et al., 1973; Dickinson, 1975;Paigen et al., 1975, 1976) и их генетическую организацию по отношению к структурным локусам ( Paigen et al., 1975, 1976; Chovnic et al., 1976; Abraham, Doan , 1978).
За последние годы накоплен большой экспериментальный мате -риал, касающийся природы генов-регуляторов. Сделана попытка классифицировать их по месту локализации относительно структурных сайтов и по механизму их действия на экспрессию структурных генов (Paigen, 1979).
Согласно классификации, предложенной в 1979 году Пейд -женом (Paigen, 1979), различают два класса регуляторных генетических элементов - тесно сцепленных со структурными ло -кусами и дистантные регуляторные гены, не сцепленные с соответствующим структурным локусом, расположенные в других хромосомах генома.
Гены-регуляторы, тесно сцепленные со структурными локу-сами обнаружены дия ксантиндегидрогеназы, алкогольдегидро-геназы, альдегидоксидазы, амилазы и других ферментов у Dro-sophila (Dickinson, 1975; Chovnick et al., 1978, 1980; Thompson et al., 1978) и для глюкуронидазы, алкоголь -дегидрогеназы, альдегидоксидазы, глицерофосфатдегидрогеназы, ft -галактозидазы и некоторых других ферментов у мышей (Coleman, 1971; Kozak, 1972; Paigen et al., 1976; Holms, 1979).
Одним из наиболее хорошо изученных ферментов у Drosophi-la является амилаза, функция которой заключается в разрушении больших молекул карбогидрата пищи ( Doane, 1969 ). У Dro-sophila melanogaster известно два тесно сцепленных локуса Amy (Bahn , 1967), возможно, возникших через дупликацию структурного гена. Эбрэхэм и Доун в 1978 году (Abraham, Doan, 1978) установили, что у Dr. melanogaster существует регуляторний ген (map ), контролирующий уровень активности амилазы в задней части средней кишки мух и являющийся, следовательно, ткане-специфичным. Этот регуляторний ген локализован в хро -мосоме 2R в положении около двух единиц карты правее структурного локуса Amy.
Характеристика линий 101 и 147 Drosophiia viriiis
1. Линия ЮІ - аутбредная, дикий тип. Линия устойчива к действию высокой температуры. Личинки этой линии, помещен -ные в начале Ш возраста в температуру 32С окукливаются че -рез 84 часа (на 12 часов позднее, чем контрольные, развивающиеся при температуре 25С). После перенесения куколок линии 101 в условия нормальной температуры (25С) они развиваются до вылета имаго. В термообработанных культурах выживает столько же особей, что и в контрольных (90-92$). У особей линии 101, подвергнутых действию высокой температуры, КГ-эстераза в спектре эстераз практически не выявляется (Раушенбах и др., 1977).
2. Линия 147 - аутбредная. В хромосоме 2 имеет три рецессивные мутации: broken (ъ) - отсутствует задняя поперечная жилка крыла (П - 143,5), brick (bk) - кирпичный цвет глаз (П - 203,5) и detached (dt) продольные жилки не доходят до края крыла (П - 210,5). Эта линия неустойчива к действию вы сокой температуры: личинки Ш возраста в данных условиях окуклиться не способны. Если экспозиция при температуре 32С составляет 72 часа, то при помещении культур в температуру 25С личинки окукливаются, однако, вылетает из них 24-26$ особей (в контроле 93$), но остается в живых через I час после вы лета лишь 12-14$ особей. При экспозиции личинок Ш возраста в условиях высокой температуры в течение 96 часов, выживает BGero 3-4$ особей. Столь низкая выживаемость в условиях высокой температуры позволяет рассматривать линию 147 как термочувствительную. Активность КГ-эстеразы в спектре эстераз термообработанных куколок линии 147 не ниже, чем в спектре контрольных особей (Раушенбах и др., 1977).
Влияние высокой температуры на состояние нейросекреторной системы мозга личинок линии 101 и 147 Drosophila virilis
Исследование активности нейросекреторной системы у термообработанных и контрольных личинок линии 101 и 147 показало,, что в условиях высокой температуры активность HGK сни -жается в обеих линиях. Об этом свидетельствует значительное уменьшение объемов ядер и объемов НСК, а также резкое снижение секреторной активности НСК у термообработанных личинок как линии 101, так и линии 147 по сравнению с контролем. На рисунках 6 и 7 представлены распределения натуральных лога -рифмов объемов ядер НСК, объемов НСК и распределения НСК по типу секреторной активности обеих линий, развивающихся в условиях высокой (32С) и нормальной (25С) температуры. Из данных, приведенных на рисунках, видно, что различия между распределениями достоверны (расчетная достоверность составляет Р 0.95). На рисунке 8 представлены микрофотографии НСК мозга группы 3+4 термообработанных и контрольных личинок линии 101.
Нами было установлено, что часть НСК термообработанных личинок линии 147 остаются в активном состоянии (примерно 20$ НСК) и имеют размеры и тип нейросекреторной активности характерный для контрольных личинок (рис.7). Это две клетки в каждом полушарии. Они входят в медиальную группу НСК 3+4 и занимают в этой группе латеральное положение (рис.9).
