Введение к работе
Выяснение причин злокачественного перерождения клеток млекопитающих является одной из важных задач молекулярной генетики. Данные последних лет указывают на существенную роль в развитии злокачественных новообразований эпигенетических механизмов, в частности, нарушений в регуляторпом аппарате клеток, приводящих к дисбалансу процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза в клеточных сообществах различных органов и тканей. Известно, что большое значение для поддержания баланса этих процессов имеют регуляторные белки - факторы транскрипции, контролирующие экспрессию множества генов, в том числе ответственных за пролиферацию и дифференцировку различных типов клеток.
Одним из ключевых звеньев в регуляции процессов дифференцировки клеток печени являются факторы транскрипции подсемейства FoxA. В предыдущих исследованиях нашей лаборатории были получены данные, свидетельствующие об опухолесупрессорных свойствах этих белков в ходе химически индуцированного гепатоканцерогенеза [Kropachev ct al., 2001; Merkulova et al., 2005]. В частности, было установлено, что введение мышам и крысам 3 -метил-4-диметиламиноазобензола (З'-МеДАБ) приводит к снижению FoxA ДНК-связывающей активности в печени крыс, чувствительных к его опухолеиндуцирующему действию, но не мышей, у которых данное соединение не вызывает развития опухолей. Наоборот, введение животным орто-аминоазотолуола (ОАТ), гепатоканцерогешюго только для мышей, сопровождается снижением FoxA ДНК-связывающей активности только в печени мышей. В ходе поиска связанных с контролем пролиферации и апоптоза генов-мишеней FoxA, уровень экспрессии которых существенно менялся в ответ на введение животным генатоканцерогепов, в регуляторных районах таких генов был обнаружен новый тип сайтов связывания FoxA белков, представляющий собой тандемный повтор тетрануклеотида TTTG [Брызгалов и др., 2008]. Известно, что микросателлитные повторы часто являются сайтами связывания нескольких близкородственных белков. Поскольку ДНК-связывающие домены Fox белков характеризуются высокой степенью гомологии, можно ожидать, что с обнаруженным микросателлитом (TTTG)n могут связываться не только члены подсемейства FoxA, но и другие белки семейства Fox. Изучение этого вопроса представляет значительный интерес, поскольку для многих представителей этого семейства показана их роль как в супрессии, так и в стимуляции развития опухолей.
В настоящее время одним из основных подходов к изучению моделей химически индуцированного канцерогенеза в современной токсикогеномике является анализ изменения профиля экспрессии генов в ответ на то или иное канцерогенное соединение. Широкомасштабное профилирование экспрессии позволяет эффективно обнаруживать характерные маркеры злокачественного перерождения клеток, а также в ряде случаев выявлять основные биохимические процессы и регуляторные каскады, задействованные в процессах химического канцерогенеза. Поскольку ранее получены данные о видоспецифическом влиянии гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на активность ряда факторов транскрипции в клетках печени, становится очевидным, что наблюдаемые изменения в ансамбле регуляторных белков клетки должны отразиться, в первую очередь, на уровне экспрессии контролируемых ими генов-мишеней. Сопоставление изменений профиля экспрессии таких генов в печени крыс под действием гепатоканцерогенного З'-МеДАБ и близкого ему по структуре, но слабоканцерогенного ОАТ служит отправной точкой в идентификации генов и контролирующих их экспрессию факторов, задействованных в реализации гепатоканцерогенных свойств аминоазосоединсний.
Цель и задачи исследования
Целью исследования было выявление ранних изменений в транскриптоме печени под действием гепатоканцерогенных аминоазосоединений З'-МеДАБ и ОАТ и роли факторов транскрипции семейства Fox в этих процессах.
Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Выявление факторов транскрипции в клетках печени крыс и мышей, связывающихся с микросателлитными ДНК-сайтами (TTTG)n.
-
Исследование влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3'-МеДАБ на FoxO ДНК-связывающую активность в печени мышей линии ICR и крыс Wistar, соответственно.
-
Проведение широкомасштабного микрочипового анализа изменения экспрессии генов в печени крысы в ответ на высококанцерогенный для крыс З'-МеДАБ и слабоканцерогенный ОАТ.
-
Выявление функционально связанных кластеров дифференциально экспрессирующихся генов на основе данных из баз Gene Ontology, KEGG и литературы.
-
Поиск потенциальных сайтов связывания белков FoxA в промоторных районах дифференциально экспрессирующихся генов и их выборочная экспериментальная проверка. Оценка обогащения групп дифференциально экспрессирующихся генов потенциальными генами-мишенями FoxA.
6. Выборочная проверка методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени данных микрочипового анализа по изменению экспрессии генов, связанных с регуляцией пролиферации, в ответ на З'-МеДАБ и/или О AT.
Научная новизна
Впервые получены данные по масштабному изменению экспрессии генов в печени крыс под действием двух аминоазосоединений с различным гепатоканцерогенным потенциалом - слабоканцерогенного ОАТ и высококанцерогенного З'-МеДАБ. Установлено, что эти близкие по структуре соединения вызывают изменения экспрессии различных функциональных груші генов. З'-МеДАБ, в отличие от ОАТ, приводит к значительно более выраженному изменению экспрессии генов, связанных с регуляцией апоптоза и клегочного цикла. Напротив, в ответ на ОАТ, но не З'-МеДАБ, наблюдалась индукция большого числа генов, продукты которых участвуют в метаболизме ксенобиотиков и ответе па окислительный стресс.
Впервые показано, что введение мышам гепатоканцерогенного для них ОАТ и крысам гепатоканцерогенного для них З'-МеДАБ приводит к снижению ДІІК-связывающей активности опухолевого супрессора Fox03 в клетках печени этих животных. Обнаружено, что тандемные повторы (TTTG)n с числом звеньев более трех являются общими сайтами связывания для факторов транскрипции FoxA и FoxO. Выявлено значительное увеличение экспрессии четырех потенциальных генов-мишеней FoxA/FoxO, содержащих этот тип сайта, Ccngl, TnfrsfHa, Klf6 и Репа, в ответ на введение крысам З'-МеДАБ, но не ОАТ.
Теоретическая и практическая значимость
Разработанная совместно с сотрудниками лаборатории теоретической генетики СО РАН система поиска сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA может быть использована как аналитический инструмент для выявления и анализа представленности генов-мишеней FoxA. Материалы данной диссертации используются при чтении лекций по спецкурсу «Новейшие молекулярно-генстические технологии» на кафедре информационной биологии ФЕН НГУ.
Положения, выносимые на защиту
Близкие по структуре аминоазосоединсния З'-МеДАБ и ОАТ обладают значительными различиями в спектре индуцируемых изменений профиля экспрессии генов в клетках печени крыс. Гепатоканцерогснный для крыс 3'-МеДАБ инициирует выраженные изменения экспрессии ряда генов, связанных с регуляцией апоптоза и клеточного цикла. Слабоканцерогенный для крыс ОАТ
вызывает значительное увеличение экспрессии генов, продукты которых участвуют в метаболизме ксенобиотиков и ответе на окислительный стресс.
Прямые тандемные повторы тетрануклеотида TTTG с числом звеньев более трех являются сайтами связывания транскрипционных факторов подсемейства FoxO. З'-МеДАБ вызывает значительное увеличение экспрессии содержащих микросателлитные сайты (TTTG)n потенциальных генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA/FoxO: Ccngl, Tnfrsfl2a, Klf6 и Репа.
Апробация работы и публикации
Результаты работы были представлены на II Съезде общества клегочной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007) и 34th FEBS Congress (Чехия, Прага, 3-9 июля 2009) . По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых отечественных журналах.
Структура и объем работы
Похожие диссертации на Ранние изменения транскриптома печени крысы под действием гепатоканцерогенных аминоазосоединений
