Введение к работе
Актуальность проблемы. Многочисленные исследования процесса терминации трансляции и участвующих в нем белковых факторов, проведенные на дрожжах Saccharomyces cerevisiae, показали плейотропность проявления мутаций в генах, кодирующих факторы терминации трансляции eRFl и eRF3. У дрожжей S. cerevisiae эти факторы кодируются жизненно важными генами SUP45 и SUP35 (Breining and Piepersberg, 1986; Kushnirov et al., 1988). Мутации в этих генах приводят к считыванию стоп-кодонов как значащих, или омнипотентной нонсенс-супрессии. Мутанты sup45 и sup35 могут также проявлять температуро- и осмочувствительность, полную или частичную дыхательную некомпетентность, чувствительность к беномилу и аминогликозидным антибиотикам (Inge-Vechtomov et al., 2003). В большинстве случаев неизвестно, являются ли эти плейотропные эффекты прямым следствием нарушения терминации трансляции, или опосредованы участием белков Sup45 и Sup35 в клеточных процессах, не связанных непосредственно с терминацией трансляции. Получено множество данных о взаимодействии дрожжевых факторов терминации трансляции с компонентами различных клеточных структур, в том числе с системой деградации мРНК с преждевременным стоп-кодоном NMD (Chabelskaya et al, 2007), системой экспорта мРНК из ядра (Gross et al., 2007; Bolger et al., 2008), а также актиновым (Bailleul et al., 1999) и тубулиновым цитоскелетом. Так, недостаток белка Sup35 вызывает дефекты веретена деления, а белок Sup45 прямо взаимодействует с белком Місі, представляющим собой легкую цепь миозина (Valouev et al., 2002, 2004).
У дрожжей S. cerevisiae переход от дрожжевого типа роста к мицелиальному (филаментозному) является ответом на изменение состава среды и сопровождается физиологическими и морфологическими изменениями. При переходе к псевдогифальному (у диплоидов) и инвазивному (у гаплоидов) росту происходит изменение характера почкования клеток и врастание колонии в субстрат. Переход к псевдогифальному росту у диплоидов индуцируется в условиях недостатка источника азота при наличии доступного источника углерода и характеризуется образованием ветвящихся цепочек клеток удлиненной формы, или псевдогиф. Внешний сигнал, природа которого в настоящее время неизвестна, запускает сигнальный каскад, активирующий экспрессию генов семейства FLO. Гены FLO кодируют гликопротеины клеточной стенки, необходимые для межклеточных контактов и адгезии к субстрату. Ген FLO 11 (MUC1) играет ключевую роль в регуляции псевдогифального роста у диплоидных и инвазивного роста у гаплоидных штаммов (Lambrechts et al., 1996). Его промотор является одним из самых протяженных в геноме дрожжей S. cerevisiae и содержит большое количество сайтов связывания транскрипционных факторов, что отражает многообразие регуляторных механизмов, определяющих форму роста дрожжей в зависимости от условий внешней среды. В Лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции СПбГУ была получена коллекция мутантных аллелей sup45 (Москаленко и др., 2004), способных поддерживать жизнеспособность штамма в отсутствие аллели гена SUP45 дикого типа. В дальнейшем было обнаружено, что диплоидные штаммы дрожжей, несущие как нонсенс, так и миссенс-аллели sup45 в гомозиготе или гемизиготе, теряют способность к псевдогифальному росту.
Целью работы являлось изучение новых плейотропных эффектов мутаций в генах SUP45 и SUP35. Задачи исследования:
Изучение влияния мутаций в гене SUP45 на псевдогифальный рост диплоидных штаммов и инвазивный рост гаплоидных штаммов дрожжей.
Анализ экспрессии гена FLO 11 и других генов, связанных с регуляцией псевдогифального роста в штаммах, мутантных по гену SUP45.
Выявление и анализ новых проявлений мутаций в гене SUP45, связанных с нарушением псевдогифального роста.
Изучение влияния мутаций в гене SUP35 на псевдогифальный и инвазивный рост.
Научная новизна исследования. Показано, что мутантные аллели гена SUP45, проявляющиеся как сильные супрессоры, приводят к нарушению псевдогифального роста у диплоидных штаммов дрожжей, имеющих различный генотипический фон. Мутации, повышающие эффективность терминации трансляции, а также мутации, приводящие к нарушению фосфорилирования белка Sup45, не влияют на способность дрожжей к псевдогифальному росту. Показано, что к изменению характера почкования приводит присутствие любой из изученных в данной работе мутантных аллелей, при этом эффект менее выражен на фоне аллелей, в меньшей степени затрагивающих эффективность терминации трансляции. Показано, что нонсенс-супрессорные мутации sup45 приводят к снижению стабильности хромосом и потере гетерозиготности по локусу типа спаривания. Впервые количественно оценена частота потери III хромосомы в присутствии аллели sup45-102. Также впервые показано, что нонсенс-супрессорные аллели sup45 нарушают способность гаплоидных штаммов к инвазивному росту.
Практическая ценность работы. Псевдогифальный и инвазивный рост у дрожжей находятся под контролем одних и тех же регуляторных путей и являются ответной реакцией на изменение условий окружающей среды. До настоящего времени не было данных о взаимодействии компонентов терминационного комплекса с белками семейства Flo, обеспечивающими способность к псевдогифальному росту, или с белками, отвечающими за регуляцию экспрессии генов, кодирующих поверхностные адгезины клетки. Способность к псевдогифальному и гифальному росту является основой патогенности дрожжей рода Candida, и выявление новых регуляторных механизмов может способствовать созданию антимикозных препаратов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на V съезде ВОГиС (Москва, 2009); Международной школе-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (Санкт-Петербург, 2007); на XXII международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Словакия, Братислава, 2005); на II международной конференции «Происхождение биосферы и эволюция» (Греция, Лутраки, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем работы. Работа изложена на 176 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (185 наименований). Работа содержит 15 таблиц и 35 рисунков.
![Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4477/425955.png "Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Рогоза, Татьяна Михайловна")