Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Генетическая предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям 12
1.2. Алкоголизм. Этиология и патогенез 15
1.2.1. Краткие сведения об эпидемиологии алкоголизма в Российской Федерации и в Республике Саха (Якутия) 22
1.3. Наследственные факторы развития алкоголизма 28
1.3.1. Молекулярно-генетические аспекты алкоголизма 31
1.3.1.1. Полиморфные маркеры генов дофаминергической системы 32
1.3.1.2. Полиморфные маркеры генов серотонинергичской системы 40
1.3.1.3. Полиморфные маркеры генов ферментов, участвующих в метаболизме нейромедиаторов 45
1.3.1.4. Полиморфные маркеры генов ферментов метаболизма алкоголя 48
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Материалы исследования 52
2.2. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови 52
2.3. Амплификация полиморфных участков ДНК 53
2.4. Электрофорез амплифицированньгх фрагментов ДНК 59
2.5. Статистический анализ результатов исследования 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора D2 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия)... 71
3.1.1. Анализ ассоциаций полиморфного варианта 32806С>Т гена DRD2 с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 71
3.1.2. Анализ ассоциаций полиморфного варианта 939С>Т гена рецептора D2 дофамина (DRD2) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 76
3.1.3. Анализ ассоциаций гаплотипов генаDRD2, составленных на основе полиморфных маркеров 3280бС>Т и 939С>Т с хроническим алкоголизмом в популяциях якутов и эвенков Республики Саха (Якутия) 82
3.2. Анализ ассоциаций полиморфного варианта 25G>A гена рецептора D3 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 83
3.3. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов рецептора D4 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия)... 87
3.3.1. Анализ ассоциаций полиморфного маркера -616C>G гена рецептора D4 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 88
3.3.2. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 120 п.о. VNTR гена рецептора D4 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 92
3.3.3. Анализ ассоциаций гаплотипов генаDRD4, составленных на основе полиморфных маркеров VNTR и -6160G с хроническим алкоголизмом в популяции якутов из Республики Саха (Якутия) 97
3.4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов переносчика дофамина (SLC6A3) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 98
3.4.1. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 2319G>A в гене SLC6A3 с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 99
3.4.2. Анализ ассоциаций полиморфного маркера VNTR в гене SLC6A3 с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 105
3.4.3. Анализ ассоциаций гаплотипов гена SLC6A3, состоящих из полиморфных маркеров VNTR и 2319G>A, с хроническим алкоголизмом в популяциях якутов и эвенков Республики Саха (Якутия) 111
3.5. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов серотонинергическои системы с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 112
3.5.1. Анализ ассоциаций полиморфного маркера -1438A>G гена рецептора 2А серотонина (HTR2A) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 113
3.5.2. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 861G>С гена рецептора 1В серотонина (HTR1B) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 117
3.5.3. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров 5HTTLPR и rs25531 гена 5НТТ с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 123
3.6. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов фермента моноаминоксидазы (МАО) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 132
3.6.1. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 1460С>Т"гена фермента моноаминоксидазы А {МАОА) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 132
3.6.2. Анализ ассоциаций полиморфного маркера LPR гена фермента моноаминоксидазы А {МАОА) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 141
3.6.3. Анализ ассоциаций полиморфного маркера rs 1799836 гена фермента моноаминоксидазы В (МАОВ) с хроническим алкоголизмом в группе мужчин якутской этнической принадлежности из Республики Саха (Якутия) 148
3.6.4. Анализ ассоциаций гаплотипов гена МАОА состоящих из полиморфных маркеров 1460С>Т и MAOA-LPR с хроническим алкоголизмом в популяциях якутов и эвенков Республики Саха (Якутия) 150
3.7. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов фермента алкогольдегидрогеназы с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 152
3.7.1. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 143A>G гена алкогольдегидрогеназы В (ADH1B) с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия) 152
3.8. Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к развитию хронического алкоголизма в Республике Саха (Якутия) 160
3.8.1. Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к хроническому алкоголизму у якутов 163
3.8.2. Анализ межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к развитию хронического алкоголизма в объединенной выборке (якуты+эвенки) 173
Заключение 182
Выводы 188
Список литературы 189
- Алкоголизм. Этиология и патогенез
- Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови
- Анализ ассоциаций полиморфного варианта 25G>A гена рецептора D3 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия)
- Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к развитию хронического алкоголизма в Республике Саха (Якутия)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно мировой статистике аддиктивные расстройства входят в первую десятку причин смертности и представляют важную социальную проблему в большинстве стран мира. Алкоголизм - это вызванное злоупотреблением спиртными напитками хроническое психическое заболевание, характеризующееся патологическим влечением к алкоголю и связанными с ним физическими и психическими последствиями алкогольной интоксикации [Альтшуллер, 1999].
Алкогольная ситуация в Республике Саха (Якутия), как и в целом по России, за последние годы стала чрезвычайной. Показатель распространенности хронического алкоголизма (ХА) в РС(Я) за 2008 год составил 1884,7 на 100 тысяч населения, что на 8,5% ниже показателя по Дальневосточному федеральному округу (2055,9 на 100 тысяч населения по итогам 2008 года), но выше на 20,3% показателя по Российской Федерации (1566,3 на 100 тысяч населения за аналогичный период времени) [Белолюбская, 2009]. Таким образом, по данным официальной статистики к 1 января 2009 года у врача-нарколога наблюдались 23565 человек, имеющих болезненное пристрастие к алкоголю, что составляет 2,5% всего населения республики.
В основе формирования данной патологии, наряду с социальными, важную роль играют и генетические факторы, которые отражают индивидуальные особенности деятельности нейромедиаторных систем и ферментов метаболизма алкоголя [Tyndale, 2003; Goldman, 2005; Hiroi, 2005]. Особая роль наследственности в формировании ХА состоит в возникновении компенсаторных механизмов, обеспечивающих нормальное функционирование нейромедиаторных систем при длительном влиянии алкоголя на организм.
Наиболее плодотворным подходом к исследованию наследственной предрасположенности к ХА является изучение ассоциаций между полиморфными локусами генов-кандидатов и заболеванием с учетом этнической принадлежности исследованных индивидов [Bishop et al., 2000]. Якуты и эвенки из РС(Я) представляют особый интерес в плане анализа ассоциаций в связи с низким уровнем генетических различий между их субпопуляциями, то есть большей гомогенностью по сравнению с остальными европейскими и азиатскими популяциями, как было показано в многочисленных исследованиях мтДНК, Y-
хромосомы и некоторых аутосомных микросателлитных локусов [Федорова, 2005; 2008].
В РС(Я) молекулярно-генетическое изучение алкоголизма ранее не проводилось и выявление полиморфных вариантов генов-кандидатов, наиболее значимых в развитии заболевания, представляет собой актуальную задачу, как для фундаментальной науки, так и практической медицины.
Цель исследования - анализ роли полиморфных вариантов генов-кандидатов в развитии хронического алкоголизма в популяциях якутов и эвенков из Республики Саха (Якутия).
Задачи исследования:
1. У больных ХА и в контрольных группах якутской и эвенкийской
этнической принадлежности из Республики Саха (Якутия) провести анализ
распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов:
рецептора D2 дофамина (32806С>Ти 939Т>С),
рецептора D3 дофамина (25G>A),
рецептора D4 дофамина {VNTR и -616C>G),
переносчика дофамина {VNTR и 2319G>A),
рецептора 2А серотонина (-1438A>G),
рецептора 1В серотонина (861G>C),
переносчика серотонина {5НТТLPR и rs25531 A>G),
моноаминоксидазы А {МАОA LPR и 1460С>Т),
моноаминоксидазы В (rsl799836 A>G),
алкогольдегидрогеназы IB (143A>G).
Провести анализ ассоциаций 15 полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития ХА в популяциях якутов и эвенков из Республики Саха (Якутия).
Провести анализ гаплотипов гена D2 рецептора дофамина, DRD2 (32806С>Т и 939Т>С); D4 рецептора дофамина, DRD4 (VNTR и -6160G); гена переносчика дофамина SLC6A3 (VNTR и 2319G>A); гена моноаминоксидазы А МАОА (МАОА LPR и 1460С>Т) и оценить их роль в формировании хронического алкоголизма у якутов и в объединенной выборке из Республики Саха (Якутия).
4. Провести анализ межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов
нейромедиаторных систем и фермента метаболизма алкоголя в развитии
хронического алкоголизма в популяциях якутов и эвенков из Республики
Саха (Якутия).
Научная новизна исследования. Впервые в РС(Я) собрана коллекция ДНК больных хроническим алкоголизмом. В популяциях якутов и эвенков впервые охарактеризованы частоты генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов DRD2, DRD3, DRD4, SLC6A3, HTR2A, HTR1B, 5НТТ, МАОА, МАОВ, ADH1B и проведен анализ ассоциаций с риском развития ХА. Показано, что полиморфные варианты генов DRD2, DRD4, HTR1B, МАОА, ADH1B и SLC6A3 участвуют в формировании генетической предрасположенности к ХА в исследованных коренных этносах РС(Я).
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярно-генетических механизмов формирования ХА в двух наиболее многочисленных коренных этносах Якутии -якутов и эвенков. На основе полученных данных можно предложить новые направления в разработке методов лечения, диагностики и формирования групп риска данной патологии. Полученная информация может быть использована в области генетической эпидемиологии, в популяционной и эволюционной генетике для углубленного описания генофонда народонаселения Якутии. Результаты исследования могут быть использованы в преподавании спецкурсов по медицинской генетике на медицинских и биологических факультетах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные результаты научно-исследовательской работы были представлены на второй Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008), на республиканском семинаре «Актуальные проблемы женского алкоголизма. Вопросы профилактики и медико-социальная реабилитация» (Якутск, 2009), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицинской генетики на Крайнем Севере» (Якутск, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 229 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 40 таблицами. Список литературы включает 396 источников, из них 326 - на иностранном.
Алкоголизм. Этиология и патогенез
Алкоголизм - заболевание, вызываемое систематическим употреблением спиртных напитков, характеризующееся патологическим влечением к ним, развитием психической (непреодолимое влечение) и физической зависимости (появлением абстинентного синдрома при прекращении употребления). Это заболевание входит в рубрику психических, так как, во-первых, в основе развития ХА лежат биологические и психологические особенности личности, обусловливающие непреодолимое влечение к алкоголю, а во-вторых, длительное злоупотребление им приводит к стойким психическим и соматическим расстройствам. В настоящее время алкоголизм рассматривают как первичное хроническое прогрессирующее заболевание с возможным летальным исходом, на развитие и проявление которого влияют генетические, психосоциальные факторы и условия окружающей среды [Mericandas, 1990, Головко и др., 2006]. Для алкоголизма характерны утрата самоконтроля, тяга к спиртному, продолжение употребления алкоголя, несмотря на неблагоприятные последствия, когнитивные нарушения (отрицание пристрастия к спиртному). Эти изменения могут быть постоянными или периодическими [Каплан, Сэдок, 1994; Анохина, 2004].
Факторы, участвующие в формировании алкоголизма, принято разделять на_ генетические, социальные и психологические [Бородкин, Грекова, 1987; Коркина с соав., 1995; Light et al., 1996; Динеева, 1999; Анохина, 2004]. Поэтому, аддиктивные болезни химической этиологии, отнесенные Международной классификацией болезней десятого пересмотра к F10 - F19, иногда называют "бир-психо-социальными". [Иванец, 2000; Каражанова, 2003]. -Приводятся даже примерные параметры "вклада" в вероятность развития аддиктивной болезни: 40% - наследственные факторы, 60% - факторы внешней среды [Судаков, 2004].
Роль генетических факторов. Наследственный фактор играет большую роль в развитии алкоголизма [Вартанян, 1988, Юрьев, 2001; Горбунова, 2002; Strat, 2008; Тараскина, 2009]. Алкоголизм имеет тенденцию проявляться у членов одной семьи. Так, Seixas J. et al., (1985) и Cardoret et al., (1986) сообщили о том, что дети алкоголиков заболевают алкоголизмом в 4 раза чаще, чем дети, родители которых не страдают от алкогольной зависимости, даже в том случае, если они воспитываются в разных семьях, причем риск возникновения заболевания у сыновей алкоголиков выше, чем у дочерей. По данным Goodwin (1995), риск заболеть алкоголизмом в общей популяции у мужчин составляет 3-4%, у женщин - до 1%.
Роль социальных факторов. Немаловажное значение в этиологии алкоголизма имеют питейные традиции народа. Эйфоризирующее, растормаживающее действие алкоголя сделало его посредником, облегчающим общение людей. Обычай взаимоугощения вином и совместное потребление спиртного как символ взаимного доверия являются одними из древнейших (Тиганов с соав., 1999).
Эпидемиолигия синдрома зависимости от ПАВ показывает влияние внешних факторов, среды: алкоголизм более распространен в странах виноградорских (Франция), опиомания и гашишизм - в странах с традиционным выращиванием мака и конопли (Ближний Восток, Северная Африка, Юго-Восточная Азия).
Определенное значение в этиологии алкоголизма имеет социальное положение индивидуума, особенно влияние на него окружающей микросоциальной среды [Goodwin, 1988].
Роль психологических факторов. Отрицательные социальные факторы не только определяют отношение личности к алкоголю, но и в какой-то мере формируют личность, предрасположенную к злоупотреблению алкоголем. В формировании алкоголизма немаловажную роль играет сама личность, ее способность адаптироваться к требованиям общества и умение использовать приемлемые, дозволенные обществом способы снятия напряжения. Личность с хорошими адаптационными качествами успешно справляется с внешними и внутренними стрессорами. Личность же с плохо развитыми адаптационными механизмами легко выводится стрессорами из равновесия и постоянно нуждается в компенсирующих факторах, роль которых часто выполняет алкоголь [Schuck.it, 1995].
Синдром психической зависимости от психоактивных веществ является важнейшим элементом патогенеза аддиктивных болезней (наркомании и алкоголизма). Развитие представлений о синдроме психической зависимости возможно с учетом достижений ряда наук: нейробиологии, нейрохимии, физиологии, психологии. В последние годы подробно исследованы изменения систем трансдукции сигнала в процессе хронического воздействия психоактивными веществами. Предполагается, что подобные нарушения вовлечены в формирование синдрома психической зависимости [Головко и др., 2006].
И.Н. Пятницкая (1994) определяет синдром психической зависимости как совокупность психического влечения к ПАВ и способности достижения состояния психического комфорта в интоксикации. В интерпретации психологов под синдромом психической зависимости понимают "психическое новообразование, проявляющееся в непреодолимом стремлении (влечении) человека постоянно принимать наркотический или другой препарат с тем, чтобы вновь испытать желаемые ощущения, либо устранить явления психологического дискомфорта" рііабалина В.В., 2004]. В рамки данных толкований синдрома укладываются и определения других авторов [Звартау, 1988; Cami et. al., 2003].
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови
Образцы ДНК получены из 9 мл цельной венозной крови человека. В качестве антикоагулянта использовали 0,5 мл 0,5 М раствора ЭДТА. Для получения фракции клеточных ядер добавляли 30 мл лизирующего буфера (0,32 М сахароза; 5 мМ MgCl2; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-НС1, рН=7,5), центрифугировали 15 мин при температуре 4С и 2500g. Полученный осадок промывали в ТЕ буфере с рН=7,5-8,0 (10 мМ трис НС1; 1 мМ ЭДТА). После этого осадок ресуспендировали в 3 мл буфера, содержащего 10-20 мМ трис HC1 рН=8,0; 2,5 мМ ЭДТА; 0,5% SDS и 100 мкг/мл протеиназы К и инкубировали при температуре 37С в течение 10-16 часов. Из полученного лизата выделяли ДЕЖ. Для этого проводили две экстракции по 10 минут смесью фенол-хлороформ (1:1) и одну экстракцию хлороформом в течение 10 мин. ДНК осаждали двумя объемами 96% этанола в присутствии 100 мМ ацетата натрия (рН=4,8). Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 1мл ТЕ буфера с рН=8.0 Выход ДНК составлял 50-100 мкг на один мл образца крови [Johns, 1989].
Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре «Beckman» (США) М 40 США при длине волны 260 нм.
Амплификацию проводили на аппарате «Терцик» (Россия) и «PCR Sprint» (США) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Олигонуклеотидные праймеры синтезированы в фирме «Литех» (Москва), эндонуклеазы рестрикции в фирме «Сибэнзим» (Новосибирск) и «Fermentas» (EU), ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Год-полимераза) получены от фирмы «Силекс» (Москва). Реакционная смесь объемом 15 мкл, которая содержала 1,5 мкл буфера (670 мМ трис-HCl, рН=8,6, 166 мМ (NH SO 25 мМ MgCl2, 0,01% Тритон Х-100), смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мМ каждого), 10-30 нг геномной ДНК, 7& 7-полимеразу и соответствующие праймеры с определенной концентрацией в зависимости от. амплифицируемого маркера. Количество праймера в 30 мкл амплификационной смеси рассчитывали по следующей формуле: V=(0,137-L)/Cpr, где L - длина праймера, Срг - концентрация праймера в оптических единицах на 1 мл [Innis, 1990].
Последующую рестрикцию эндонуклеазами также проводили в зависимости от амплифицируемого маркера.
Перечень амплифицированных полиморфных маркеров, последовательности праимеров, названия эндонуклеаз рестрикции, размеры амплифицированных фрагментов представлены в таблице 1. Для проведения амплификации использовали программы, запрограммированные на объем 10 и 15 мкл в режиме точного регулирования (Таблица 2). Температура отжига рассчитывалась по формуле: T=4-(G+C)+2-(T+A)-5, где G - гуанин, С -цитозин, Т - тимин, А - аденин [Innis, 1990].
Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле.
Условия электрофореза (концентрацию агарозы, концентрацию акрил амида и соотношение количеств акрил амида и N,N метиленбисакриламида) варьировали в зависимости от размера амплифицированных фрагментов ДНК. Электрофорез проводили в IxTBE буфере (0,089 М трис; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Пробы, перед тем как нанести на гель, смешивали в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол и 15% фикол. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали при УФ-освещение. Для визуализации амплифицированных фрагментов использовали систему гель видеодокументации Vilber Lormat (Франция). Результаты электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов исследованных полиморфных маркеров представлены на рисунках 6-19.
Анализ ассоциаций полиморфного варианта 25G>A гена рецептора D3 дофамина с хроническим алкоголизмом в Республике Саха (Якутия)
Ген рецептора D3 дофамина располагается на хромосоме 3 в области 3ql3.3. Его кодирующая последовательность включает 6 экзонов и распределена на участке размером 40 килобаз. В экзоне 1 гена DRD3 располагается несинонимичный полиморфный локус, первоначально идентифицированный как рестрикционный полиморфный вариант Ball/MscI (Ser9Gly) [Crocq et al., 1992] и в настоящее время определяемый как rs6280 (25G A). Транзиция аллеля Т на нуклеотидной цепи соответствует замене аминокислоты серии на глицин в положении 9 в N-терминальном внеклеточном домене белка. Исследования Lundstrom и Turpin показали, что в результате изменяется способность рецептора D3 связываться с агонистом [Lundstrom and Turpin, 1996].
Всего в изученных группах было обнаружено два генотипа: DRD3 A/ A и DRD3 A/ G. Наиболее распространенным в контрольных выборках был гомозиготный генотип DRD3 A/ A, определенный в 80,23% случаев у якутов и в 95,35% у эвенков, и, соответственно, аллель DRD3 A, выявленный в 90,12% случаев у индивидов из якутской популяции и в 97,67% случаев у здоровых индивидов эвенкийской этнической принадлежности. Аллель DRD3 G встречался с частотой 9,88% в контрольной выборке якутов и 2,33% в контрольной группе эвенков (Таблица 8).
Распределение частот аллелей и генотипов данного локуса оказалось схожим в группах пациентов с ХА и контроля (Р 0,05) как у якутов, так и у эвенков.
При сравнительном анализе контрольных групп якутов и эвенков было выявлено статистически достоверное различие в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 25G A гена DRD3 (Р=0,03).
Анализ распределения частот аллелей полиморфного маркера 25G A гена DRD3 в разных популяциях выявил, что изученные нами популяции достоверно отличаются от всех ранее исследованных (Таблица 9). Данное различие связано с низкой частотой встречаемости редкого аллеля DRD3 G у якутов и эвенков.
Исследования полиморфного маркера 25G A гена DRD3 при различных психических расстройствах многочисленны. Показан вклад данного локуса в развитие шизофрении [Dubertret et al., 1998; Jonsson et al., 2004]. Huang и коллеги исследовали 13 однонуклеотидных замен в гене DRD3 в двух популяциях Америки и обнаружили наличие ассоциации полиморфного маркера 25G A с никотиновой зависимостью у американцев европейского происхождения [Huang 2008]. Sander и коллеги (1995) изучали ассоциацию полиморфного варианта Ser9Gly гена DRD3 с алкоголизмом на 168 больных, поделенных на 6 подгрупп по клиническим признакам и в соответствующем контроле. В 5 группах ученым не удалось выявить ассоциацию данного полиморфного локуса с развитием заболевания, однако, в группе из 55 больных с алкогольным делирием частота аллеля DRD3 A была достоверно выше, по сравнению с контролем. Gorwood и др. обнаружили отсутствие ассоциации данного локуса с алкоголизмом (1995). Проведенное нами исследование полиморфного маркера 25G A гена DRD3 с ХА в РС(Я) также не выявило вклад данного полиморфного варианта в развитие заболевания.
Научный интерес к исследованию гена рецептора D4 дофамина (JDRD4) при алкоголизме значительно возрос после сообщения Long и коллег о наличии сцепления с алкоголизмом маркера Dl 1S1984, располагающегося на хромосоме 11, рядом с геном DRD4 [Long et al., 1998]. Исследования на животных обнаружили интересную роль рецептора D4 дофамина в формировании поведения: наряду с гиперчувствительностью к алкоголю [Rubinstein et al., 1997] мыши-нокауты по гену DRD4 демонстрировали пониженный «поиск новизны» по сравнению с мышами дикого типа [Dulawa et al;, 1999]. Результаты фармакологических исследований свидетельствуют о том, что рецептор D4 дофамина отличается высоким сродством к клозепину (атипичный нейролептик) [D Souza, 2004].
Нами проведено исследование двух полиморфных маркеров (-6J6C G и 120 п.о. VNTR) в гене DRD4 у больных ХА и в соответствующих контрольных группах из РС(Я).
Промоторный регион гена DRD4 характеризуется большим количеством однонуклеотидных замен [Okuyama et al., 1999; Bookman et al., 2002], наиболее исследованными из которых являются маркеры -521С Ти -616C G. Поскольку полиморфный л оку с -616C G находится в непосредственной близости от регуляторных участков гена DRD4 (промотора и негативного модулятора) [Kamakura et al., 1997], то его изучение представляет интерес. Кроме того, было отмечено, что наличие аллеля DRD4 C приводит к потере АР-2-связывающего сайта и объясняет таким образом репрессию транскрипции гена [Barr et al., 2001].
Нами проведено исследование полиморфного маркера -616C G гена рецептора D4 дофамина (DRD4) в популяциях якутов и эвенков Республики Саха (Якутия). Результаты распределения частот генотипов и аллелей данного полиморфного маркера представлены в таблице 10. Распределение частот аллелей и генотипов соответствовало распределению Харди-Вайнберга.
В контрольной выборке якутов преобладающим генотипом оказался DRD4 C/ G, частота которого составила 55,43%. Генотипы DRD4 C/ C и DRD4 G/ G встречались с частотой 14,13% и 30,43% соответственно. В контрольной выборке эвенков также преобладающим генотипом оказался гетерозиготный генотип DRD4 C/ G, частота которого составила 56,52%, частота остальных генотипов составила: для генотипа DRD4 C/ C - 17,39%, для генотипа DRD4 G/ G - 26,09%. Частота аллелей DRD4 C и DRD4 G в группах здоровых индивидов якутской и эвенкийской этнической принадлежности составила 41,85% и 58,15%; 45,65% и 54,35% соответственно для каждой исследованной выборки.
Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к развитию хронического алкоголизма в Республике Саха (Якутия)
Известно, что многофакторные признаки находятся как под влиянием генетических факторов, так и окружающей среды, причем развитие такого мултифакториального заболевания как алкоголизм опосредовано взаимодействием факторов окружающей среды и наследственности. До недавнего времени считалось, что наиболее эффективным методом исследования полигенных свойств и заболеваний является изучение аддитивного эффекта функционально родственных групп генов [Comings et al., 2000], однако эпистатические взаимодействия генов, при которых эффект одного гена подавляется или усиливается другими генами, играют важную роль в детерминации биологических признаков [Ebstein, 2006]. Большое количество доказательств говорит о возможном взаимодействии дофаминергической, серотонинергической и норадренергической систем мозга [Serretti et al., 2006]. Кроме того, опубликованные в отношении алкоголизма литературные данные во многом противоречивы. Одной из причин несогласованности результатов является отсутствие рассмотрения эпистатического эффекта кандидатных маркеров и влияния факторов окружающей среды в большинстве проводимых исследований. Поскольку ранее было постулировано, что вклад каждого генетического маркера в развитие предрасположенности к алкоголизму составляет менее 1% [Reif et al. 2003], а роль наследственности в формирование этого - 64% [Heath et al., 1997], для выявления роли генетического компонента в развитие алкоголизма и получения повторяемых результатов необходимо совместное исследование более 50 кандидатных генов с учетом факторов окружающей среды.
Традиционно в генетических исследованиях для изучения межгенных взаимодействий в случае «случай-контроль» используется метод логистической регрессии, однако данный метод имеет ограниченные возможности при одновременном анализе большого числа переменных [Ma et al., 2005]. К настоящему времени для моделирования взаимодействия генов разработан целый ряд прикладных статистических методов: SAA (Set Association Approach) [de Quervain et al., 2004; Ott et al., 2005], PIA (Polymorphism Interaction Analysis) [Mechanic et al., 2008], GENN Grammatical Evolution Neural Network [Motsinger-Reif et al., 2008] и др.
Одним из таких методов моделирования ген-генных и ген-средовых взаимодействий является MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction), предложенный Ritchie и соавт. [Ritchie et al., 2001]. Данный подход позволяет при определении межгенных и ген-средовых взаимодействий учитывать и качественные, и количественные признаки, дихотомические и непрерывные фенотипы. В настоящей работе для моделирования межгенных взаимодействий были использованы программы MDR и ее модифицированная версия — GMDR (Generalized MDR), предложенная Lou X.Y. и соавт., преимуществом последней является возможность анализа неодинаковых по числу выборок больных и контроля [Lou et al., 2007].
В этих программах путем многократного перекрестного пересчета вводимых первичных данных выбирается оптимальная модель ген-генного или ген-средового взаимодействия, позволяющая с наиболее высокой точностью предсказать человеку наличие или . отсутствие предрасположенности к определенному заболеванию. По одной оптимальной модели выбирается для разного количества взаимодействующих признаков моделей - одно-, двух-, трех-,..., n-локусной. Для каждой из этих моделей определяется сбалансированная точность (Balanced Accuracy, Bal.Acc), которая зависит от чувствительности (Sensitivity, Se) и специфичности (Specifity, Sp) модели, определяемыми при многократных перекрестных проверках по доле верно и неверно классифицированных моделью случаев.
Многократная перекрестная проверка результатов позволяет достоверно определить точность и ошибку предсказания модели путем отделения части данных в качестве независимого тестируемого набора. Например, при 10-кратной перекрестной проверке, все исследуемые данные делятся на десять равных по количеству индивидов частей, и модель взаимодействия признаков разрабатывается на основании анализа так называемой проверочной выборки, которая составляет 9/10 часть всей выборки. После этого результат действия модели оценивается на независимой тестируемой выборке (1/10 оставшейся части выборки) и определяется ошибка предсказания. Этот процесс повторяется десять раз для каждой из возможных десяти тестируемых частей выборки и, по данным десяти проверок определяется-средняя ошибка предсказания модели. Далее, из.всех предложенных вариантов моделей выбирается модель с достоверным уровнем значимости, с наибольшей точностью, и, соответственно, с наименьшей ошибкой предсказания, которая в наибольшем числе перекрестных проверок была признана лучшей из возможных, что выражается показателем Cross-validation Consistency (CV Consistency). Кроме выбора оптимальной комбинации взаимодействующих факторов, модель определяет, какие сочетания признаков (например, генотипов) являются факторами повышенного риска, а какие - пониженного.
Нами проведена оценка роли межгенных взаимодействий 15 полиморфных локусов генов нейротрансмиттерных систем мозга и фермента, участвующего в деградации алкоголя, в детерминации риска развития алкоголизма у якутов и в объединенной выборке якутов и эвенков.
