Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1.. Гетерогеноость наследственных форм тугоухости и глухоты 10
1.2. Анатомия и физиология органа корти 20
1.3. Участие коннексинов в процессе звуковосприятия..22
1.4. Гены коннексинов 26 и 30 (gjb 2 и gjb6) 25
1.5. Спектр мутаций в генах gjb2 и gjb6 25
1.6. Мутации в генах митохондриальной днк, обусловливающие нарушение процесса звуковосприятия 29
1.7. Краткие сведения об эпидемиологии наследственной глухоты в республике саха (якутия) 32
ГЛАВА 2. Материал и методы 35
2.1. Объект исследования 35
2.1.1. Группа обследованных больных 35
2.1.2. Популяционная выборка 37
2.2 . Методы исследования 38
2.2.1 Выделение геномной ДНК 38
2.2.2 Методы амплификации и детекции исследуемых локусов 38
2.2.2.1 Исследование мутаций генов GJB2 и GJB6 39
2.2.2.1.1. Анализ мутации 35delG в гене GJB2 39
2.2.2.1.2. Скрининг мутаций 235deIC и 167delT в гене GJB2 39
2.2.2.1.3. Скрининг мутации D(G/56-D13S1830) гена GJB6 40
2.2.2.2. Исследования генов tRNASER и 12SrRNA мтДНК 41
2.2.2.3. SSCP-анализ 45
2.2.2.3.1. Поиск мутаций в гене коннексина 26 (GJB2) 45
2.2.2.3.2. Определение нуклеотидной последовательности 46
2.3 Методы статистического анализа 47
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Анализ спектра и частоты мутаций в гене коннексина 26 (gjb2) у больных наследственной глухотой из республики Саха (Якутия) 50
3.1.1. Анализ мутации 35delG в гене коннексина 26 (GJB2) у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 50
3.1.2. Скрининг мутации 167delT в гене коннексина 26 (GJB2) у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 54
3.1.3. Скрининг мутации 235delC в гене GJB2 у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 55
3.1.4. Поиск мутаций в гене коннексина 26 (GJB2) у больных с наследственной глухотой из PC (Я) 57
3.1.4.1. Анализ мутации V37I в гене GJB2 у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 57
3.1.4.2. Анализ мутаций 333-334delAA и 312-326dell4 в гене GJB2 у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 62
3.1.4.3. Анализ мутаций R127H и R98L у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 64
3.1.4.4. Анализ полиморфных вариантов гена коннексина 26 (GJB2) у больных наследственной несиндромальной глухотой из PC (Я) 67
3.1.5. Спектр и частота идентифицированных мутаций в гене коннексина 26
(GJB2) у больных наследственной несиндромальной глухотой из
Республики Саха (Якутия) 71
3.2. Скрининг делеции d(gjb6-d\3s№0) в гене коннексина 30 (gjb6) у больных наследственной несиндромальной глухотой из рс(я) 75
3.3. Анализ мутаций в генах 12srrna и trnaser митохондриальной днк у больных несиндромальной сенсоневральной глухотой из республики саха (якутия) 77
3.4. Алгоритм днк-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в республике саха (якутия) 81
3.5. Исследование частоты мутаций гена коннексина 26 (gjb2) в некоторых популяциях рс(я) 85
3.5.1. Анализ мутации 35delG в гене коннексина 26 (GJB2) в популяции якутов и русских РС(Я) 85
3.5.2. Анализ мутаций 167delT и 235delC гена коннексина 26 (GJB2) в популяции якутов 91
3.5.3. Анализ мутации V37I гене коннексина 26 (GJB2) в популяции якутов 98
3.5.4. Частота полиморфного варианта V27I в гене коннексина 26 (GJB2) в популяции якутов 101
3.5.5. Анализ мутации a1555g гена 12srrna в популяции якутов 103
3.5.6. Спектр и частота мутаций генов gjb2 и usrrna в популяции якутов 105
Заключение 107
Выводы 113
Список литературы
- Гетерогеноость наследственных форм тугоухости и глухоты
- Мутации в генах митохондриальной днк, обусловливающие нарушение процесса звуковосприятия
- Методы амплификации и детекции исследуемых локусов
- Анализ спектра и частоты мутаций в гене коннексина 26 (gjb2) у больных наследственной глухотой из республики Саха (Якутия)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дефекты органов слуха занимают существенное место среди наследственной патологии. Общепопуляционная частота врожденной тугоухости и глухоты составляет 1 на 650-1000 новорожденных детей [Mehl et. al., 2002, Nance, 2003; Cryns et. al., 2004; Morton, 2006; Chalestori et. al., 2007]. По данным ВОЗ за последние 20 лет число людей с различными формами тугоухости и глухоты увеличилось в 2 раза и составляет только в России около 13-20 млн. [Зинченко и соавт., 2007; Гинтер и соавт., 2002]. По опубликованным данным, наследственная сенсоневральная тугоухость является одним из пяти наиболее распространенных наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия) наряду с такими частыми моногенными болезнями, как спиноцеребеллярная атаксия 1 типа и миотоническая дистрофия Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена [Платонов, 2003; Тарская и соавт., 2004; Сухомясова, 2005].
Врожденная глухота и снижение слуха в прелингвальный период приводит к нарушению речевой и социальной адаптации, поэтому дети с такими сенсорными нарушениями нуждаются в своевременно начатой коррекции дефектов органов слуха [Некрасова и соавт., 2002]. Примерно половина врожденных форм нарушений слуха имеют наследственную этиологию [Marazita et. al., 1993; Friedman et. al., 1999], другая половина может быть связана с повреждающим действием факторов внешней среды: инфекциями, осложнениями в родах (асфиксии, родовые травмы), приемом женщиной во время беременности ототоксических лекарственных препаратов, бактериальными менингитами, продолжительными отитами, тяжелыми травмами головы и др. [Блюмина с соавт., 1987; Jacobson et. al., 1995]. Для наследственных форм потери слуха характерен клинический и генетический полиморфизм [Murgia et. al., 1999; Маркова с соавт., 2003]. Генетическая гетерогенность наследственных сенсоневральных форм тугоухости обусловлена тем, что в процессе эмбрионального развития кортиева органа принимает участие более 60 генов [Morton et. al. 2006; Chalestory et. al., 2007].
Мутации в генах коннексинов являются наиболее частой причиной потери слуха и встречаются у больных с наследственными и спорадическими формами глухоты практически во всех странах мира [Kelley et. al., 1998; Liu et. al., 2000].
На сегодняшний день известно более 100 мутаций в гене коннексина 26 (GJB2) и около 10 мутаций в гене коннексина 30 (GJB6), являющихся основной наследственной причиной повреждения процесса звуковосприятия у человека. Трансмембранные белки, кодируемые генами GJB2 и GJB6, участвуют в образовании межклеточных контактов - коннексонов - в тканях внутреннего уха, которые ответственны за перенос малых молекул, и обеспечивают, в основном, циркуляцию К+ в улитке. При дефектах синтеза этих белков происходит нарушение гомеостаза эндолимфы, что приводит к отмиранию волосковых рецепторных клеток и развитию потери слуха по сенсоневральному типу [Kikuchi et. al., 1995]. Согласно опубликованным данным, мутации в гене коннексина 26 (GJB2) могут приводить как к рецессивным, так и доминантным формам глухоты. Основными клиническими проявлениями мутаций в гене GJB2 являются врожденные нарушения слуха и преобладание выраженной степени тугоухости [Murgia et. al., 1999; Cryns et. al., 2004]. Однако, некоторые миссенс-мутации (M34T, V37I, V27I, E114G и т.д.) могут приводить к умеренным и легким формам тугоухости, а в ряде случаев описываются как полиморфные варианты [Kelley et. al., 1998; Cryns et. al., 2004; Snoeckx et. al., 2005; Bicego et. al, 2006].
Кроме генов белков-коннексинов, непосредственно участвующих в процессе звуковосприятия, рядом исследователей [Prezant et. al., 1993; Estivill et. al., 1998] показано, что некоторые мутации генов митохондриальной ДНК могут обуславливать «гиперчувствительность» к ототоксическим лекарственным препаратам и вызывать потерю слуха. Рибосомальная РНК в волосковых клетках - наиболее вероятная мишень для таких препаратов аминогликозидного ряда как канамицин, гентамицин, стрептомицин, мономицин и т.д., наравне с «естественной мишенью» данных антибиотиков -бактериальной рРНК. Показано, что замена 1555A>G в гене 12SrRNA мтДНК
делает митохондриальную рРНК человека похожей по структуре на бактериальную рРНК, вследствие чего она становится мишенью для данных лекарственных препаратов [Prezant et. al., 1993]. Поскольку применение антибиотиков из группы аминогликозидов широко распространено, изучение частоты мутаций A1555G в гене 12SrRNA, и мутаций A7445G и Т7511С в гене tRNASER является актуальным для оценки риска возникновения сенсоневральной глухоты в семьях с отягощенным наследственным анамнезом.
Несмотря на то, что в последнее десятилетие достигнуты значительные успехи в изучении причин наследственной глухоты и тугоухости, много вопросов остается невыясненными. В связи с этим, молекулярно-генетическое изучение наследственных форм тугоухости и глухоты в Республике Саха (Якутия), является актуальным и обоснованным.
Целью настоящего исследования является анализ генов коннексина 26 (GJB2), коннексина 30 (GJB6), генов митохондриального генома HSrRNA и tRNASER у больных с наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой и в популяциях Республики Саха (Якутия)
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:
1. Провести поиск мутаций и полиморфных вариантов в генах GJB2 и
GJB6 у больных несиндромальной глухотой из Республики Саха (Якутия);
2. Провести скрининг патогенетически значимых мутаций в
митохондриальных генах 12SrRNA и tRNA**" у больных несиндромальной
глухотой из Республики Саха (Якутия);
Изучить частоту обнаруженных мутаций гена GJB2 в популяциях якутов и русских из Республики Саха (Якутия).
Оценить частоту мутации A1555G в гене 12SrRNA митохондриальной ДНК у больных несиндромальной глухотой и в популяции якутов из Республики Саха (Якутия).
5. Разработать на основе полученных данных алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в Республике Саха (Якутия).
Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые проведено молекулярно-генетическое изучение наследственной несиндромальной глухоты в Республике Саха (Якутия). Впервые получены данные о спектре и частоте мутации в генах GJB2, GJB6, 12SrRNA и tRNASER у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой в Республике Саха (Якутия). Оценен вклад мутаций 35delG, V37I гена GJB2 и мутации A1555G гена 12SrRNA в развитие несиндромальных форм глухоты в Якутии. Показана этническая неоднородность по спектру и частоте найденных мутаций гена GJB2 в исследованной выборке больных. Установлена частота носительства идентифицированных мутаций гена GJB2 в популяциях якутов и русских из РС(Я).
Практическая значимость. Разработан оптимальный для Республики Саха (Якутия) алгоритм выявления носителей мутаций генов GJB2 и 12SrRNA и проведения ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты в семьях высоко риска, что является необходимой предпосылкой повышения эффективности медико-генетического консультирования и профилактики наследственной патологии в регионе. В 13,1 % обследованных семей из РС(Я) выявлены носители мутантных хромосом и установлена причина глухоты у больных. Результаты настоящего исследования внедрены и применяются в работе Якутского научного центра РАМН и Правительства РС(Я), а также в практической деятельности медико-генетической службы региона.
Положения, выносимые на защиту.
1. Спектр и частоты мутаций 35delG, 333-334delAA, 312-326dell4, V37I, R127H и R98L и полиморфных вариантов V27I, E114G и М34Т гена GJB2 у больных несиндромальной глухотой из Республики Саха (Якутия).
Идентификация мутации A1555G гена HSrRNA мтДНК у пациентов с несиндромальной глухотой, якутов по этнической принадлежности, и частота A1555G в популяции якутов.
Неоднородность популяций русских и якутов по частоте гетерозиготного носительства мутации 35delG в гене коннексина 26 (GJB2).
Частота носительства мутации V37I в гене GJB2 в популяции якутов.
5. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственной
несиндромальной сенсоневральной глухоты в Республике Саха (Якутия).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы
доложены и обсуждены на республиканской научно-практической
конференции «Теория и практика комплексной реабилитации детей с
ограниченными возможностями здоровья» (Нерюнгри, 2005), на
международной научно - практической конференции «Генетические аспекты
патологии человека. Проблемы сохранения генофонда коренных народов
Севера» (Якутск, 2005), на международной научной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (Москва 2006),
межлабораторном семинаре Отдела молекулярной генетики Якутского
научного центра Российской Академии медицинских наук и Правительства
РС(Я), на 13 международном конгрессе «Приполярная медицина»
(Новосибирск, 2006).
По теме диссертации опубликовано 7 работ Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 источника (45 - отечественных и 147 - иностранных). Диссертация иллюстрирована 42 рисунками, 16 таблицами и дополнена приложением (7 стр.).
Гетерогеноость наследственных форм тугоухости и глухоты
Врожденная глухота - одна из наиболее частых патологий человека, регистрируемая с частотой 1 на 650-1000 новорожденных детей [Mehl et. al., 1998; 2002; Nance, 2003; Cryns et. al., 2004; Morton, 2006; Chalestori et. al., 2007]. Примерно 50-60% всех случаев врожденной глухоты имеют наследственные причины [Marazita et. al., 1993; Friedman et. al., 1999; Gasparini et. al., 2000; Morton, 2006]. Наиболее частая форма наследственной глухоты -несиндромальная глухота - характеризующаяся клиническим полиморфизмом и генетической гетерогенностью [Cryns et. al., 2004; Petersen et. al., 2006; Morton, 2006].
В Российской Федерации общая распространенность наследственной тугоухости составляет 13: 105 [Шокарев и соавт., 2005]. В Ростовской области распространенность наследственной глухоты 36,6: 10 [Шокарев и соавт., 2005]. В ходе медико-генетического исследования популяции 7 районов Республики Мари Эл - распространенность наследственной нейросенсорной глухоты составила 12,8: 105 [Гинтер и соавт., 2002], в Республике Чувашия -32,5: 105 [Зинченко и соавт., 2007].
Проведенные эпидемиологические исследования нарушений слуха в Республике Саха (Якутия) отмечают достаточно высокую частоту сенсоневральнои тугоухости среди детей до 14 лет [Федотова, 2005]. В PC (Я) распространенность стойкой сенсоневральнои тугоухости превышает аналогичный показатель по Центральному Федеральному округу РФ в 1,85 раз [Федотова, 2005]. В 43% среди обучающихся в школе для слабослышащих и в 31% в школе для глухих прослеживается наследственная этиология заболевания [Федотова, 2005]. Следует отметить, что наследственная глухота является одной из наиболее генетически и клинически гетерогенных моногенных патологий, при которой клиническая картина заболевания может существенно варьировать.
Широкий спектр клинических проявлений нарушений слуха обусловливает неоднозначность подходов к классификации данного заболевания. Большинство современных классификаций нарушений слуха учитывают этиологию (наследственные или приобретенные), время манифестации (доречевые или с более поздним началом), сопутствующую патологию (синдромальные или несиндромальные), характер снижения слуха (кондуктивный, сенсоневральный или смешанный тип тугоухости), характер течения (прогрессирующий, стабильный и т.д. (табл. 1.1).
По характеру снижения слуха выделяют кондуктивную и сенсоневральную тугоухость, между тем нередко наблюдаются и промежуточные - смешанные формы. Смешанная тугоухость характеризуется присутствием у пациента обоих типов нарушений - кондуктивного и сенсоневрального [Альтман и соавт., 2003; Маркова, 2004].
Причиной кондуктивной тугоухости являются поражения наружного, среднего уха и носоглотки. К патологии наружного уха можно отнести аномалии развития ушной раковины и наружного слухового прохода (атрезии, микротии, аномалии развития слуховых косточек, фиксации стремечка и т.д.). Если говорить об аномалиях наружного и среднего уха, то очевидно, что данные виды патологий являются врожденными, с возрастом же по кондуктивному типу тугоухость развивается в основном за счет отосклероза [Таварткиладзе и соавт., 1996].
Сенсоневральная тугоухость может быть обусловлена поражением различных отделов внутреннего уха: улитки (органа Корти), слухового нерва, проводящих путей или соответствующих структур головного мозга. Сенсоневральную тугоухость обычно подразделяют на улитковую, возникающую при повреждении волосковых клеток кортиева органа и ретрокохлеарную, при которой диагностируется неврит слухового нерва [Таварткиладзе и соавт., 1996; Альтман и соавт., 2003]. В результате патоморфологических исследований височных костей глухих индивидов был описан ряд аномалий строения внутреннего уха и установлено, что врожденная глухота может быть обусловлена первичными изменениями в самой улитке [Fish et. al., 1959; Маркова, 2004].
Наиболее распространенной наследственной формой глухоты являются так называемые несиндромальные или изолированные формы, характеризующиеся только потерей слуха [Petersen et. al., 2006]. Около 70-77% всех случаев несиндромальной глухоты приходятся на аутосомно-рецессивные формы, 20-25% на аутосомно-доминантные, а на Х-сцепленные и митохондриальные формы глухоты - все остальные [Cryns et. al., 2004].
Мутации в генах митохондриальной днк, обусловливающие нарушение процесса звуковосприятия
Республика Саха (Якутия) расположена на северо-востоке Евразии и занимает значительную часть Восточной Сибири: это самый большой по площади субъект Российской Федерации (3,1 млн. кв. км.). Несмотря на это, численность населения не больше 1 млн. человек [Торговкина и соавт., 2005]. По данным статистического ежегодника PC (Я) на 2005 г., численность населения республики составила 950,7 тысяч человек [Торговкина и соавт., 2005]. Этнический состав Республики Саха (Якутия) неоднороден и характеризуется многонациональностью. По данным Всероссийской переписи населения 2002 г. численность якутов в РС(Я) составляла 45,5%, русских -41,2%, украинцев - 3,6%, эвенков -1,9%, эвенов -1,2%, татар -1,1%, бурятов -0,8%, белорусов - 0,4%, армян - 0,3%, азербайджанцев, корейцев, киргизов - по 0,2%, ингушей, осетин, чеченцев, китайцев и грузин - по 0,1%, юкагиров, долган и чукчей также по 0,1%. [Торговкина и соавт., 2005]. Наиболее многочисленными этническими группами, проживающими на территории РС(Я), являются якуты и русские.
Наиболее древним этносом, проживающим на территории Якутии с эпохи каменного века, принято считать юкагиров [Алексеев, 1996; Гоголев, 2004]. Позднее на территории Якутии появились тунгусо-маньчжурские племена предков современных эвенков и эвенов. Наиболее поздними мигрантами на территорию современной Якутии считаются тюркоязычные скотоводческие племена якутов [Алексеев, 1996; Гоголев, 2004].
Якуты (саха) относятся к центральноазиатскому антропологическому типу монголоидной расы и говорят на языке, принадлежащем к тюркской группе алтайской языковой семьи. Общая численность якутского этноса составляет около 430 тысяч человек [Окладников, 1955; Торговкина и соавт., 2005]. Согласно традиционным взглядам историков и археологов, предками якутов являются тюркоязычные племена скотоводов Прибайкалья, переселившиеся с региона озера Байкал в бассейн средней Лены и Вилюя в относительно недавнее время, начиная с I в.н.э. [Ксенофонтов, 1994], VI в. н.э. [Алексеев, 1996], X в н.э. [Окладников, 1955].
Впервые русские появились на территории Якутии в XVII веке в связи с освоением Восточной Сибири, Камчатки и Дальнего Востока [Гоголев, 2004]. В последующем миграция русских на территорию Якутии становится более значительной в связи с развитием ясачного режима, обнаружения полезных ископаемых, а в период реформ Якутия становится местом ссылки для многих заключенных [Гоголев, 2004].
По опубликованным данным, наследственная нейросенсорная тугоухость является одним из пяти наиболее частых наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия) (1:16140) и занимает второе место после спиноцеребеллярной атаксии 1 типа (1:6850) [Тарская и соавт., 2004]. В более ранних работах [Пузырев и соавт., 2002] сообщается, что в результате проведенного медико-генетического исследования в четырех районах (улусах) республики было выявлено всего 2 семьи с аутосомно-рецессивной наследственной сенсоневральной тугоухостью и 3 семьи с аутосомно-доминантной формой заболевания. Причем, все пробанды с аутосомно-доминантным типом передачи болезни проживали на территории одного района (улуса) - Амгинского [Пузырев и соавт., 2002].
Следует отметить, что неоднозначность приводимых данных по распространенности наследственной несиндромальной глухоты на территории РС(Я) свидетельствует о немногочисленности эпидемиологических исследований, что в первую очередь является следствием высокой гетерогенности данной патологии и трудностей клинической дифференциации наследственных и приобретенных форм. Развитие молекулярно-генетических технологий и применение их на практике позволит получить более четкую характеристику такой гетерогенной патологии, как глухота наследственной этиологии. На основе полученных результатов исследования возможна оптимизация стратегии профилактики наследственной несиндромальной глухоты в Якутии.
В качестве материала для данной работы были использованы пробы ДНК 79 пациентов из 65 неродственных семей с диагнозом двухсторонняя сенсоневральная тугоухость III-IV степени предположительно наследственной этиологии, а также образцы ДНК членов их семей (всего 86 человек). Материал для исследования предоставлен медико-генетической консультацией РБ№1-НЦМ г. Якутска, Сурдологопедическим центром РБ№1-НЦМ г. Якутска из числа амбулаторных больных, а также получен в ходе выездов в Республиканскую специализированную (коррекционную) школу-интернат I вида для глухих детей, и в Республиканскую школу интернат II вида для слабослышащих детей. Под «больными» в данной работе подразумеваются лица, имеющие стойкие нарушения слуха по сенсоневральному1 типу, предположительно наследственной этиологии без сопутствующей патологии других органов и систем2. Упоминаемые в тексте термины «снижение слуха», «тугоухость», «глухота» являются степенью выраженности нарушения процесса звуковосприятия. Все пациенты были осмотрены врачами сурдологами-оториноларингологами и генетиками. Всем больным были проведены тональные аудиометрические исследования по костному и воздушному проведению, в некоторых случаях, по показаниям была проведена импедансометрия и РКТ (рентгеновская компьютерная томография) височных костей.
Методы амплификации и детекции исследуемых локусов
ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]. Кровь из локтевой вены собирали в пробирку, содержащую 300 мкл 0,5 М ЭДТА. Для выделения ДНК к 9 мл крови добавляли 50 мл лизирующего буфера содержащего 1% тритона Х-100, 0,001М триса НС1, рН 7,5; 0,001М MgCb, 0,32 М сахарозы. Ядра лимфоцитов осаждали центрифугированием в течении 20 мин при 2600 об/мин и промывали 2 раза сахарозным буфером в течении 10 минут при 2600 об/мин. Сливали супернатант, добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К 10 мкл 20% додецилсульфата Na и 10 мкл протеиназы К в концентрации 20 мг/мл. Смесь инкубировали в течении 16-20 часов при температуре 37С. По окончании инкубации белки из раствора удаляли последовательной экстракцией фенолом, насыщенным трис НС1, рН 8,0; смесью фенол-хлороформ (1:1) и хлороформом. Из полученной водной фазы ДНК осаждали добавлением 50 мкл 3 М ацетата Na рН 8,0 и добавлением 2,5V 96% охлажденного до -20С этанола. Осадок ДНК собирали центрифугированием в течении 10 мин. При 6800 об/мин, дважды промывали 70%» этанолом, подсушивали при комнатной температуре и растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис -НС1, рН7,5; ImM ЭДТА). Оценку количества и качества ДНК проводили с помощью спектрофотометрического анализа на аппарате «Beckman» (США) М 40 при длине волны 260 нм.
Амплификацию проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на аппарате «Терцик» производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс».
Анализ мутации 35delG в гене GJB2 проводили прямым методом с использованием праймеров (табл. 2.2). Реакция амплификации была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1 (рН=8,8), 16,6 мМ (NHO2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 ед. активности ДНК-полимеразы. Реакцию амплификации проводили по схеме (табл. 2.3). Результат амплификации оценивали путем проведения вертикального электрофореза в 9% полиакриламидном геле (АА: бисАА= 29:1,3), длиной 20 см. В качестве буфера для электрофореза использовали ІхТВЕ. Электрофорез проводили в течение 4 часов при 300 V. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага ApUC 19/Mspl. После разделения продуктов ПЦР гель окрашивали бромистым этидием.
Амплификацию фрагмента гена GJB2 фланкирующих область мутаций проводили с помощью оригинальной последовательности олигопраймеров (табл. 2.2.), подобраных с помощью программы PnmerSelect 5.05 из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002). Первичная последовательность (сиквенс) гена была получена из базы генетических последовательностей GenBank. Реакция была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН=8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04, 1,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 ед. активности ДНК-полимеразы. Детекцию мутаций 235delC и 167delT проводили с помощью ПДРФ-анализа с применением эндонуклеаз рестрикции Apal (GGGCCAC) и PstI (CTGCAAG), соответсвенно, производства НПО «Fermentas» (Литва). Реакцию амплификации проводили по схеме (табл. 2.3). После амплификации 5 мкл амплификата обрабатывали рестриктазой Apal, а другие 5 мкл амплификата PstI в течение 16 часов при 37С в соответствии с протоколами фирмы производителя. Результат ПДРФ-анализа оценивали при проведении вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле (АА:бисАА=29:1). В качестве буфера для электрофореза использовали ІхТВЕ. Электрофорез проводили в течение 2 часов при 300 V. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага A,pUC19/Mspl. После разделения продуктов ПДРФ гель окрашивали бромистым этидием.
Скрининг мутации D(GJ2?6-D13S1830) выполнен с использованием двух последовательных ПЦР, охватывающих район делеции, с помощью праймеров позволяющих выявить breakpoints-junction фрагменты в 390 п.н. и 335 п.н., соответственно (табл.2.2). Реакция амплификации была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН=8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04,1,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 ед. активности ДНК-полимеразы.
Реакцию амплификации проводили по схеме (табл. 2.3). Результат амплификации оценивали путем проведения вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле (АА:бисАА=29:1,3). В качестве буфера для электрофореза использовали ІхТВЕ. Электрофорез проводили в течение 3 часов при 300 V. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага l$\JC\9IMspl. После разделения продуктов ПЦР гель окрашивали бромистым этидием.
Анализ спектра и частоты мутаций в гене коннексина 26 (gjb2) у больных наследственной глухотой из республики Саха (Якутия)
Учитывая соотношение числа гомо - и гетерозиготных носителей, мы провели оценку частоты мутации 35delG, которая составила 11,5% в исследованной выборке больных. Полученный результат согласуется с литературными данными о высокой распространенности данной мутации в различных популяциях человека. В основном, эта мутация регистрируется с высокой частотой среди больных наследственной глухотой в Европе, Сев.
Америке, и Евразии [Kelley et. al., 1998; Green et. al., 1999; Mustapha et. al., 2001; Хидиятова и соавт., 2002; Mukherjee et. al., 2003]. Наиболее часто данная мутация встречается среди больных глухотой арабов, греков, турков, итальянцев, французов, немцев, поляков и т.д. [Rabionet et. al., 2000; Tekin et. al., 2001; Zoll et. al., 2002; Kupka et. al., 2002; Pampanos et. al., 2002; Roux et. al., 2004]. Этническая принадлежность пациентов с мутацией 35delG в гене GJB2 представлена в таблице 3.1.
Частота мутации 35delG среди европеоидной группы пациентов составила 42%, среди больных якутов - 2%. Полученные результаты подтверждают данные о высокой частоте этой мутации в популяциях Европы и ее низкой распространенности в популяциях Азии [Kelley et. al., 1998; Brobby et. al., 1998; Abe et. al., 2000; Rabionet et. al., 2000; Tekin et. al., 2001; Kupka et. al., 2002; Mukherjee et. al., 2003; Nagla et. al., 2004].
У 7 пациентов, на обеих хромосомах которых была выявлена мутация 35delG, причину снижения слуха можно считать установленной. Данные пациенты полностью информативны для ДНК-диагностики. В этих семьях возможна как дифференциальная диагностика для установления наследственной этиологии заболевания, так и проспективое медико-генетическое консультирование, включающее возможность проведения пренатальной (дородовой) молекулярно-генетической диагностики.
Пренатальная ДНК-диагностика позволяет проводить профилактику такой тяжелой наследственной патологии как несиндромальная сенсоневральная глухота обусловленная мутацией 35delG в гене GJB2, в семьях с высоким риском рождения больного ребенка, и по требованию лиц, вступающих в брак, т.к. нередко глухой ребенок, патология у которого вызвана мутацией 35delG, бывает рожден в слышащих семьях - где оба родителя являются гетерозиготными носителями данной мутации [Маркова и соавт., 2003; 2006]. Это объясняется, как высокой частотой гетерозиготного носительства мутации 35delG среди многих европеоидных популяций, так и кровнородственными браками [Панахиан, 2005]. На рис. 3.2. представлена родословная семьи А, где оба родителя слышащие, ингуши по этнической принадлежности, а все трое детей глухие. У всех троих сибсов была идентифицирована мутация 35delG в гомозиготном состоянии. Учитывая данные генеалогического анализа о том, что оба родителя являются слышащими, можно предположить, что они гетерозиготы по мутации 35delG. Причем, родители пробандов отказались проходить медико-генетическое консультирование по религиозным причинам. Учитывая частоту кровнородственных браков среди народов Кавказа [Панахиан, 2005], нельзя исключать вероятность того, что супруги состоят в кровном родстве.
Мутация 35delG выявлена у 8 пациентов в гетерозиготном состоянии. Обнаруженная мутация 35delG только в одной копии гена не раскрывает причины развития тугоухости у данных пациентов, т.к. мутантный аллель рецессивен по отношению к аллели дикого типа. Такое количество гетерозиготных носителей делеции 35delG и наличие у них потери слуха может указывать на сегрегацию различных по происхождению мутантных аллелей у исследованных нами больных (табл. 3.1), что, вероятно, является следствием ассортативности браков между индивидами с нарушением слуха.
Степень тугоухости пациентов с генотипом 35delG/35delG составила: 80% - ІУстепени и 20%-Ш степени, что подтверждает многие исследования о практически полной глухоте у носителей данной мутации в гомозиготном состоянии [Cryns et. al., 2004; Snoeckx et. al., 2005]. Усредненные аудиометрические данные пациентов, гомозиготных по мутации 35delG, представлены на рис. 3.3.
У двоих сибсов из одной семьи с мутацией 35delG в гомозиготном состоянии наблюдалась ложная картина аутосомно-доминантного типа наследования. Накопление мутаций и подобная картина ложного типа наследования свидетельствует об ассортативности браков между слабослышащими и глухими в Республике Саха (Якутия).
Учитывая высокую частоту встречаемости мутации 167delT не только в популяции евреев-ашкенази (около 4%), но достаточно высокую частоту этой мутации и в других популяциях Европы, Средиземноморья, Ближнего Востока, Сев. Америки и Евразии [Morell et. al., 1998; Lerer et. al., 2000; Bors et. al., 2004; Chaleshtori et. al., 2005; Джемилева и соавт., 2006], был проведен скрининг мутации в выборке больных из PC (Я). Для детекции мутации 167delT был подобран метод идентификации данной делеции с помощью ПЦР с последующим ПДРФ-анализом. При использовании данного метода теряется 1 из двух сайтов рестрикции для эндонуклеазы Pstl (рис. 3.4), что позволяет выявлять гомозиготных и гетерозиготных носителей этой делеции.
Мутация 167delT гена GJB2 не была идентифицирована ни у одного индивида из изученной выборки больных, что согласуется с данными по распространенности и этнической специфичности данной мутации [Morell et. al., 1998; Lerer et. al., 2000; Bors et. al., 2004].
Рядом авторов была показана этническая специфичность накопления мутаций в гене GJB2 в некоторых монголоидных популяциях Восточной Азии. Среди больных несиндромальной глухотой японцев, китайцев, корейцев, наиболее распространенной мутацией в гене GJB2 оказалась делеция цитозина в 235 положении - 235delC [Fuse et. al., 1999; Park et. al., 2000; Abe et. al., 2000]. Частота данной делеции среди больных наследственной несиндромальной глухотой японцев, китайцев, корейцев, монголов, алтайцев, составляет от 34% до 76% среди всех мутантных аллелей этого гена [Park et. al, 2000; Abe et. al., 2000; Liu et. al, 2002; Ohtsuka et. al., 2003; Posukh et. al., 2005]. Так, среди 35 больных несиндромальной глухотой японцев было обнаружено 2 неродственных пациента с мутацией 235delC в гомозиготном состоянии и 8 в компаунд гетерозиготном состоянии с мутациями Y136X и R143W гена GJB2 [Abe et. al., 2000]. Из 69 неродственных китайских пациентов, страдающих несиндромальной глухотой, было обнаружено 8 гомозигот и 2 гетерозиготы по мутации 235delC [Xiao et. al., 2004]. Среди 147 больных, корейцев по этнической принадлежности, мутация 235delC была зарегистрирована у 5 пациентов в гомозиготном и у 5 в гетерозиготном состоянии [Park et. al., 2000]. Среди 76 пациентов из Алтая мутация 235delC была выявлена у одного в гомозиготном состоянии и у 3 в сочетании с другими мутациями гена GJB2 - 35delG, W172C и R75Q, соответственно [Posukh et. al., 2005]. В Индии среди 100 неродственных больных мутация 235delC была выявлена у одного пациента в гомозиготном состоянии [Ramchander et. al., 2005].
