Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные данные о миотонической дистрофии (обзор литературы) 11
1.1. Распространенность миотонической дистрофии в различных популяциях 11
1.2. Генетика миотонической дистрофии 17
1.3. Клинические особенности миотонической дистрофии 26
1.4. Полиморфизм CTG-повторов гена миотонинпротеинкиназы 40
Глава II. Материалы и методы исследования 48
2.1. Структура и организация эпидемиологического, клинико-генеалогического обследования семей с миотонической дистрофией 49
2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 51
2.3. Статистические методы анализа материала 53
Глава III. Результаты исследования и обсуждение 56
3.1. Распространенность миотонической дистрофии в Республике Саха (Якутия) 56
3.2. Характеристика миграционной активности больных миотонической дистрофией 61
3.3. Клиничесішй полиморфизм миотонической дистрофии в якутской популяции 68
3.4. Репродуктивные показатели в семьях с миотонической дистрофией 112
3.5. Молекулярно-генетические исследования миотонической дистрофии в Республике Саха (Якутия) 115
3.5.1. Анализ нормального полиморфизма (CTG) -повторов гена миотонин протеинкиназы в популяциях коренных народов Республики Саха (Якутия) 115
3.5.2. Молекулярно-генетическая дагностика миотоническои дистрофии в Республике Саха (Якутия) 124
3.6. Медико-генетическое консультирование отягощенных миотоническои дистрофией семей 134
Заключение 139
Выводы 143
Список литературы
- Генетика миотонической дистрофии
- Клинические особенности миотонической дистрофии
- Молекулярно-генетические методы исследования
- Репродуктивные показатели в семьях с миотонической дистрофией
Введение к работе
Актуальность проблемы. Популяционно-эпидемиологические исследования груза наследственных болезней (НБ) в конкретных популяциях и этнических группах свидетельствуют о разном уровне отягощенности популяций наследственной патологией [Гинтер, 1999; Пузырев, Назаренко, 2000; Зинченко, 2001], что указывает на необходимость изучения региональных особенностей распространенности этих заболеваний. На территории Республики Саха (Якутия) показана высокая степень накопления отдельных заболеваний [Ноговицына, 2001; Банщикова, 2002; Платонов, 2003]. Ведущее место в структуре генетической патологии в Республике Саха (Якутия) занимают наследственные болезни нервной системы. Так, в республике установлено высокое накопление группы аутосомно-доминантных болезней с поздним проявлением, в основе которых лежит механизм экспансии числа тринуклео-тидных повторов (спиномозжечковая атаксия I типа, окулофарингеальная мышечная дистрофия, миотоническая дистрофия) [Коротов, Кузьмина, 1994; Платонов, 2003].
Миотоническая дистрофия (МД) представляет собой мультисистемное заболевание с исключительной вариабельностью клинических проявлений, среди которых миотония, прогрессирующая мышечная слабость, поражения сердца, эндокринно-вегетативные расстройства, катаракта, снижение интеллекта. МД передается по аутосомно-доминантному типу. Заболевание начинается в любом возрасте [Emery, 1998], но наиболее часто встречается в 20-30 лет [Зинченко и др., 1979; Harper et al., 2004]. Клинические проявления МД характеризуются выраженным полиморфизмом, представляют сложности в диагностике. В большинстве случаев МД носит прогрессирующее течение, приводя к социальной дизадаптации больных. Смертность при МД выше, чем в здоровом населении, средняя продолжительность жизни составляет в среднем 48,6-53 года [Ахмадеева, 2001; Mathieu et al., 1999]. Причиной смертности при МД в 30% являются сердечные нарушения, в том числе внезапная смерть. В первые несколько дней жизни умирают 15-16% новорож-
6 денных от матерей, больных МД, тогда как в нормальной популяции - 1,9% [Harper et al., 2004; Rudnik-Schoneborn, 2004].
Известно, что МД встречается с разной частотой в популяциях - в среднем 4,0-5,0 на 100 тыс. населения [Harper et al, 2004; Harley et al., 1991; Brun-ner, 1993]. В то же время в различных географических зонах существуют регионы с повышенным накоплением МД [Mathieu et al., 1990; Lopez de Mun-ainetal., 1993].
Первые сообщения, что причина заболевания связана с увеличением числа тринуклеотидных CTG (цитозин-тимин-гуанин) повторов в 3'- конце гена миотонинпротеинкиназы (DMPK), расположенном на коротком плече 19 хромосомы в области 13.2-13.3, появились в 1992 году [Brook et al., 1992; Buxton et al., 1992; Harley et al., 1992; Mahadevan et al., 1992]. Число тринуклеотидных CTG-повторов в разных популяциях полиморфно, в норме колеблется от 5 до 27-37, причем отличия показаны не только между этносами, но и субпопуляциями одного этноса [Иващенко и др., 1997; Лимборская и др., 2002; Фатхлисламова, 1999; Попова и др., 1997, 2003; Сломинский и др., 2000; Novelli et al., 1994а; Pan et al., 2001; Popova et al., 2001; Zerylnick et al., 1995; Watkins et al, 1995]. Количество CTG-повторов от 37 до 50 известно как премутация [Yamagata et al., 1998; Komai et al., 1999]. У больных МД число повторов превышает 50 и может достигать нескольких тысяч.
Предполагается, что в основе всех случаев МД лежит одна или очень малое количество древних мутаций северо-евразийского происхождения с большим количеством носителей мутации или премутации [Novelli et al., 1994]. Новые мутации при МД встречаются крайне редко [Krahe et al., 1995]. Предрасполагающим к мутации фактором многие исследователи считают нестабильность аллелей с большим числом CTG-повторов (19-30 триплетов), которые составляют резерв для мутаций [Горбунова, 2000]. Не исключается и роль факторов окружающей среды [Pineiro et al, 2003; Gomes-Pereira et Monckton, 2004].
Начиная с момента открытия мутации, группами исследователей предпринимались попытки соотношения клинических и молекулярных корреляций, прогнозирование на основании данных ДНК-анализа течение и развитие МД. Большинство опубликованных данных противоречивы, нет однозначных суждений. Показана тесная корреляция между числом CTG-повторов и тяжестью клинического синдрома: больные с небольшой степенью экспансии триплетов (50-160 копий) имеют минимальные клинические проявления, например, только катаракту [Brook et al., 1992; Harley et al., 1992]. Большее число копий триплетов имеют больные с развернутой клинической картиной. Наибольшая степень экспансии CTG-повторов до 4000 отмечена при тяжелой врожденной форме МД [Tsilfidis et al., 1992; Lavedan et al., 1993].
В последние годы помимо классической МД, ген которой расположен на хромосоме 19, картирован на хромосоме 3q ген проксимальной миотони-ческой миопатии (PROMM) - МД2 [Ranum et al., 1998; Ricker et al., 1999], обусловленной расширением цитозин-цитозин-тимин гуанин (CCTG) повторов.
Несмотря на значительное число исследований, касающихся распространенности МД, многообразия клинических проявлений МД, в том числе и в России [Ахмадеева, 1997; Васильева, 1996; Вяткина и др., 1994; Зинченко и др., 1979; Ключиков, Копшицер, 1983; Магжанов, 1988], многие вопросы эпидемиологии, генетических особенностей, вариабельности клинических проявлений, популяционных различий в числе CTG-повторов гена миото-нинпротеинкиназы в норме и патологии для МД в настоящее время остаются недостаточно изученными.
В Республике Саха (Якутия) клиническая диагностика МД проводится с 1984 года, отмечено накопление МД среди коренного якутского населения [Коротов, Кузьмина, 2000]. Для Якутии актуальность изучения МД, являющейся как медицинской, так и социальной проблемой, обусловлена прежде всего количеством больных, регистрируемых в республике.
Территориальная и генетическая подразделенность между разными этносами и популяциями, населяющими Республику Саха (Якутия), определяют необходимость всестороннего исследования МД, направленного на анализ закономерностей распространения МД и разработке мер медико-генетической профилактики [Кучер,2005; Максимова, 2002].
Цель настоящего исследования: изучить этнотерриториальное распределение, клинические проявления миотонической дистрофии и полиморфизм CTG-повторов гена миотонинпротеинкиназы в коренных популяциях Республики Саха (Якутия).
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Определить распространенность, территориальное и этническое распределение миотонической дистрофии в Республике Саха (Якутия).
Охарактеризовать клинический полиморфизм миотонической дистрофии среди якутской популяции.
Оценить репродуктивные показатели в семьях больных МД.
Изучить полиморфизм CTG-повторов гена миотонинпротеинкиназы в популяциях коренных народов Республики Саха (Якутия).
Разработать на основе полученных данных подходы к пренатальной, пресимптоматической и дифференциальной диагностике миотонической дистрофии в Якутии.
Научная новизна: Впервые определена частота МД в Республике Саха (Якутия), изучены особенности ее территориального и этнического распределения в популяциях Якутии. Изучено разнообразие клинических проявлений МД в якутской популяции. Наиболее частыми проявлениями МД определены миотония, прогрессирующая мышечная слабость, кардиальные и ве-гето-эндокринные нарушения. Дана оценка репродуктивных показателей у больных МД. Получены данные о нормальном полиморфизме CTG-повторов гена миотонинпротеинкиназы в популяциях коренных народов PC (Я).
9 Практическая значимость: Создан регистр больных МД в Республике Саха (Якутия). На основе полученных результатов предложен и внедрен в практику алгоритм медико-генетического консультирования МД. Разработана система оказания медицинской помощи семьям с высоким риском рождения детей с данной патологией. В практику медико-генетической консультации Республиканской больницы №1 -Национального центра медицины PC (Я) внедрена ДНК-диагностика МД. Обоснована необходимость проведения пре-симптоматической, пренатальной ДНК-диагностики МД в Якутии. Результаты работы используются в преподавании, на курсах повышения квалификации врачей, Якутского медицинского института.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Распространенность МД в PC (Я) составляет 10,3 на 100 тыс. населения. МД встречается с высокой частотой (21,3 на 100 тыс.) среди коренного якутского населения с преимущественным накоплением в Ви-люйской и Центральной группе улусов.
Установлена клиническая вариабельность МД с разным возрастом начала и тяжести клинических форм, с внутри- и межсемейным полиморфизмом. Наиболее частыми проявлениями МД определены миото-ния, прогрессирующая мышечная слабость, кардиальные и вегето-эндокринные нарушения.
В семьях с МД зарегистрированы низкий уровень рождаемости и высокая частота патологических исходов беременностей и ранней детской смертности.
Частоты аллелей CTG-локуса в популяциях коренных народов PC (Я) характеризуются одномодальным распределением и невысокой частотой нестабильных аллельных вариантов. Достаточно высокая гетерози-готность по CTG-локусу гена миотонинпротеинкиназы в популяциях коренных народов PC (Я) имеет диагностическую значимость при медико-генетическом консультировании.
10 Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на республиканских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы детской неврологии и педиатрии» (Якутск, 2001), «Детское здравоохранение в PC (Я): оптимизация работы и стратегия развития» (Якутск, 2003), конференции молодых ученых (Якутск, 2002), X Российско-Японском симпозиуме по медицинскому обмену (Якутск, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003), межлабораторном семинаре Отдела молекулярной генетики Якутского научного центра Российской академии медицинских наук и Правительства PC (Я) (Якутск, 2003, 2004), научно-практической конференции «Современные проблемы сердечно-сосудистой патологии на Крайнем Севере» (Якутск, 2004), научно-практической конференции «Генетические аспекты патологии человека. Проблемы сохранения генофонда коренных народов Севера» (Якутск, 2005), на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), межлабораторном семинаре ГУНИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005).
Генетика миотонической дистрофии
МД относится к группе болезней экспансии, обусловленных динамическими мутациями [Cummings et al., 2000; Willems et al., 1994]. Тринуклеотид-ные повторы (ТНП) принадлежат к классу простых повторяющихся последовательностей, или микросателлитов, число копий которых может значительно варьировать, не приводя к фенотипическим нарушениям, что обуславливает широкий популяционный полиморфизм [Richards et al., 1992; Willems et al., 1994; Горбунова, 1999]. Болезнь развивается лишь тогда, когда число повторов в этих сайтах превосходит определенный критический уровень. После увеличения числа копий выше порогового уровня темп мутирования резко возрастает. Этим определяется динамическая природа данных мутаций.
Ген МД картирован на коротком плече 19 хромосомы в области 13.2-13.3 [Brook et al., 1985; 1992; Buxton et al., 1992; Harley et al., 1992; Mahadevan et al., 1992]. Продуктом гена является миотонинпротеинкиназа (DMPK), состоящая из 15 экзонов, занимающих 13 кб геномной ДНК [Shaw et al., 1993; Mahadevan et al., 1993]. DMPK активно экспрессируется в скелетной и гладкой мышечной ткани, в миокарде (волокна Пуркинье и вставочные диски кардиомиоцитов) и в центральной нервной системе [Anvret, 1993; Maeda et al., 1995]. Этот белок обнаруживает органную специфичность, т.е. варьирует по молекулярному весу в разных тканях. Ближайшими проксимальными маркерами гена МД являются гены аполипопротеина С2 (АРОС2) и мышечной креатинкиназы {СКММ) [Harley et al., 1991].
Ген DMPK включает регионы, которые подвергаются к сплайсингу, приводящему к множественным типам мРНК DMPK, вероятно имеющим различное функциональное значение [Fu et al., 1993]. Так, более короткие изоформы мРНК находятся в гладких мышцах, более длинные изоформы чаще экспрессируются в скелетных мышцах и в сердце [Salvatori et al., 1994]. В скелетных мышцах выявлен белок 53 kD, содержание которого у больных МД снижено. В сердечной мышце выявлен белок 62 Ш, в мозге обнаружены оба белка - 53 Ш и 62 Ш.
В основе МД лежит нестабильность числа тринуклеотидных CTG (ци-тозин-тимин-гуанин) повторов. Предположением о молекулярных основах заболевания стало обнаружение у больных МД увеличенного EcoRI-фрагмента [Harley et al., 1992; Buxton et al., 1992] и идентификация микроса-теллитного увеличенного CTG-повтора на 3 -нетранслируемой области гена МД [Brook et al., 1992]. Размеры этого фрагмента могут варьировать у разных больных. У здоровых лиц число тринуклеотидных CTG-повторов в разных популяциях полиморфно, колеблется от 5 до 27-37. У больных число повторов превышает 50 и может достигать нескольких тысяч [Pizzuti et al., 1993]. Количество CTG-повторов от 37 до 50 известна как премутация [Yamagata et al., 1998; Komai et al., 1999]. Увеличение количества повторов является фактором риска для перехода премутации в полную мутацию [Martorell et al., 2001], этим объясняется факт, что у больного родители могут быть здоровыми [Тончева и др., 1997].
Предрасполагающим к мутации фактором многие исследователи считают переход от аллеля с 5 GTG-повторами к аллелям из 19-30 триплетов. Эти аллели с популяционной частотой 10% составляют резерв для мутаций [Горбунова, 2000]. Не исключается роль факторов окружающей среды, в том числе химических мутагенов [Pineiro et al., 2003; Gomes-Pereira et Monckton, 2004], наличия другого заболевания [Jinnai et al., 2004].
Случаи новых мутаций при МД крайне редки [Krahe et al., 1995]. Частота мутаций колеблется от 8-10" до 1,6-10 5. Установлена связь с единым древним гаплотипом, обуславливающим нестабильность CTG последовательностей [Yamagata et al., 1996; Basu et al., 2000]. Исследования последних лет в различных популяциях показывают общее происхождение мутаций [Yamagata et al., 1996; Basu et al., 2000; Medica et al., 2000]. Предполагается, что в основе всех случаев МД лежит одна или очень малое количество древних мутаций евразийского происхождения с большим количеством носителей мутации или премутации [Novelli et al., 1994]. Одним из обоснований се-веро-евразийского происхождения мутации стал факт отсутствия в хромосомах народов из центрального и южного Камеруна аллелей «риска» [Novelli et al., 1994].
Малышевой [2000] предложена гипотетическая схема возникновения аллелей гена DMPK, предрасположенных к дальнейшей экспансии. Эти аллели (с числом CTG-повторов 18) произошли от стабильных аллелей с 10-14 CTG-повторами и гаплотипом 1. Возникшие хромосомы с максимальной в пределах нормы длиной повторов закрепились и распространились у потомков вследствие случайных эволюционных процессов. В ряде популяций этот класс хромосом был утрачен вследствие дрейфа генов, эффекта основателя или других случайных процессов. В остальных популяциях, в которых аллели с числом CTG-повторов присутствуют с частотой от 1 до 10-12%, с вероятностью около 2-Ю"4 могут происходить мутации, приводящие к увеличению количества повторов до 30-50 триплетов, которые, в свою очередь, при передаче между поколениями с вероятностью 0,01-0,02 могут достигать длины в 100-150 ТНП, превышая пороговую величину полной мутации.
При МД показана тесная корреляция между числом CTG-повторов и тяжестью клинического синдрома: больные с небольшой степенью экспансии триплетов (50-160 копий) имеют минимальные клинические проявления, например, только катаракту в качестве единственного симптома [Brook et al., 1992; Harley et al., 1992]. Большее число копий триплетов имеют больные с развернутой клинической картиной. Наибольшая степень экспансии CTG-повторов до 4000 отмечена при тяжелой вролсденной форме МД [Tsilfidis et al., 1992; Lavedan et al., 1993].
Клинические особенности миотонической дистрофии
В 1900 г. J. Hoffmann привел наблюдение миотонии в сочетании с атрофией мышц лица, грудино-ключично-сосцевидных мышц и мышц предплечья и кисти у брата и сестры в возрасте 25 и 30 лет. Г.И. Россолимо (1901-1902), подробно описал аналогичное заболевание у мужчины 37 лет и впервые предложил назвать атрофической миотонией. В 1909 году Н. Steinert сообщил 6 случаев заболевания и дал название «амиотрофическая миотония», F. Batten и Н. Gibb описали 5 наблюдений болезни. Н. Gurschmann (1912) определил атрофическую миотонию как самостоятельное заболевание и отметив, что атрофируются не только мышцы, но «весь человек», предложил обозначить заболевание как миотоническую дистрофию. В последующем определены три основных синдрома МД: миопатический, миотонический и эн-докринно-вегетативный [Зинченко с соавт., 1979].
В настоящее время болезнь рассматривается как мультисистемное поражение, складывающееся из мышечных и внемышечных проявлений, преж 27 де всего нарушений деятельности сердечно-сосудистой системы, а также нейроэндокринных, висцеральных, костно-суставных и глазных расстройств [Вельтищев и др., 1998].
Существует значительное число исследований, касающихся многообразия клинических проявлений, внутри- и межсемейного полиморфизма МД, в том числе в России [Большакова и др., 2000; Васильева, 1996; Гринштейн и др., 1993; Зинченко и др., 1979; Ключиков, Копшицер, 1983; Поповьян, Ду-бинская, 1981; Ахмадеева, 1997; Магжанов, 1988].
Заболевание характеризуется широкой вариабельностью в возрасте начала - от рождения до 60 лет и старше [Emery, 1998], но наиболее часто встречается в 20-30 лет [Зинченко и др., 1979; Harper et al., 2004]. Особенностью МД является мультисистемность в поражении, клинический полиморфизм [Бирюков, 1975; Гринио, Агафонов, 1997; Лобзин и др., 1998; Большакова и др., 2000; Вельтищев с соавт., 1998; Иллариошкин с соавт., 2002]. Для МД характерно прогрессирующее течение. Смертность при МД выше, чем в здоровом населении, средняя продолжительность жизни составляет 53 года [Mathieu et al., 1999].
На основе возраста начала заболевания и выраженности клинических проявлений МД разделена на подгруппы [Harper, 1989; Emery, 1998]. Умеренная или старческая МД: имеет начало в возрасте 50 лет и старше, характеризуется наличием катаракты, отсутствием или минимальными мышечными проявлениями. Классическая МД проявляется с юности или во взрослом возрасте. Клиническая картина складывается из миотонического, миопатиче-ского синдромов и внемышечных расстройств.
Тяжелая врожденная форма МД описана в 1960 году [Magee et al., 2002]. Уже в периоде беременности пораженным плодом отмечается много-водие, снижение двигательной активности [Rudnik-Schonebom et al., 1998; Magee et al., 2002]. После рождения эта форма проявляется генерализованной мышечной гипотонией, слабостью лицевых мышц, затруднением при кормлении, респираторными нарушениями, косолапостью, задержкой двигательного развития, умственным отставанием. Эта форма часто приводит к смерти сразу после рождения из-за респираторных осложнений. По данным Harper et al. [2004] - 16%, Rudnik-Schoneborn [2004] - 15% новорожденных от матерей, больных МД, умирают в первые несколько дней жизни, тогда как в нормальной популяции - 1,9%. Новорожденные с МД, находившиеся длительно на искусственной вентиляции, в последующем значительно отстают в развитии, в 25% случаях умирают на первом году жизни [Campbell et al., 2004]. В течение раннего детства двигательные функции пациентов с врожденной МД улучшаются. В младенчестве признаки миотонии отсутствуют, хотя может выявляться при ЭНМГ-исследовании. Но к возрасту 10-11 лет развиваются симптомы, характерные для классической формы МД, у 60-70%) впоследствии развивается умственная отсталость.
Врожденная форма (ВФ) МД наблюдается преимущественно при рождении от больных матерей [Magee et al., 2002], хотя были описаны случаи унаследования от больного отца [Bergoffen et al., 1994; Die-Smulders et al., 1997]. У женщины с МД риск родить ребенка с ВФ составляет 3-9%, при наличии в семье случая врожденной МД риск увеличивается до 20-37% [Koch et al., 1991]. Молекулярно-генетическими методами установлен риск передачи заболевания в зависимости от длины CTG-повторов: если у больной женщины расширение повторов 1КБ, то риск рождения ребенка с ВФ при первой беременности составляет 59%, 1КБ - 17%, если имелся случай врожденной МД - почти 100% [Magee et al., 2002]. Риск рождения ребенка с ВФ при первой беременности существует в том случае, если женщина имеет мульти-системные клинические признаки МД, возраст начала заболевания до 30 лет [Magee etal, 2002].
Молекулярно-генетические методы исследования
Для популяционного исследования нормального полиморфизма CTG-повторов гена миотонинпротеинкиназы материал собран в ходе экспедиционных выездов в 2001-2003 гг. Забор крови производили после медицинского осмотра у коренных жителей республики с подписанием информированного согласия. Этническая принадлежность учитывалась до третьего поколения. В таблице 6 представлена количественная характеристика популяционных выборок коренных народов PC (Я).
Молекулярно-генетические исследования проведены, в лаборатории МПС Республиканской больницы №1-Национального центра медицины PC (Я) и в отделе молекулярной генетики Якутского научного центра РАМН и Правительства PC (Я).
Выделение геномной ДНК! ДНК выделяли из 10 мл периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]. В качестве консерванта использовали 0,5М ЭДТА. Для выделения ДНК к венозной крови добавляли лизирующий-буфер, содержащий 0,32М сахарозы, 1% тритона х 100, 0,001мМ MgCl, 0,001мМ трис-НСі; рН=7,5. Ядра лейкоцитов осаждали центрифугированием при- 2600 об/мин: в течение 20 минут. К осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К, 10 мкл 20% додецилсульфата Na и 10 мкл протеиназььК до конечной концентрации 20 мг/мл, затем инкубировали 16-20 часов. Дальнейшую протеинизацию проводили последовательной фенольной экстракцией равными- объемами фенола, фенол-хлороформа. (1:1) и хлороформа. Разделение фаз проводили центрифугированием и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали добавлением охлажденного 96% этанола.и дважды промывали в 70% этаноле. На» заключительном этапе ДНК высушивали при комнатной температуре и«раство-ряли в буфере ТЕ. Выделенную ДНК хранили при -20С.
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК. Анализ нормального полиморфизма CTG повторов в популяциях и в семьях, отягощенных МД проводили методом полимеразной цепной реакции (ПНР) на амплификаторе GenAmpPCR.9600 фирмы «Perkin ELMER» в режиме: 1. Holdl-94C 4 мин. 2. Сус1-94С 40 сек. 30 циклов 62С 40 сек. 72С 1 мин. 20 сек. 3. Hold-72C 10 мин. 4. Hold-12C 10 мин. Для амплификации были использованы праймеры [Brook et al., 1992]: МД 101: CTG ССС AGG ССТ GCA GTTT МД 102: GGC TCG AAG GGT CCT TGTA
Реакция была выполнена в 10 мкл объеме с образцом ДНК, содержащей реакционный буфер х 10, смесь 1,5 мМ dNTR (G+C), 25 мМ MgCb.
Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле. Продукты амплификации анализировали при помощи электрофореза в 8% полиакриламидном геле (соотношение акрил амид :бисакрил амид - 29:1,3) в течение 2-3 часов. Полосы ДНК в геле окрашивали флюоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем - бромистым этидием. Результаты разделения рассматривали в ультрафиолетовом свете. В качестве маркеров использовали пробы ДНК индивидов с известным числом повторов.
Расчеты выполняли с использованием авторских программ, а также ряда прикладных программ: «Биостат", "Excel-2000". При проверке статистических гипотез в качестве граничного значения уровня значимости принималась величина Р=0,05. Для представления результатов использовали среднее арифметическое и стандартное отклонение распределений. Статистические совокупности сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента, для сравнения частот аллелей, использовали критерий %2 с поправкой Йетса на непрерывность при числе степеней свободы, равном единице [Гланц, 1998].
В Республике Саха (Якутия) миотоническая дистрофия распределена неравномерно с накоплением в отдельных улусах. Заболевание зарегистрировано в 19 из 35 административно-территориальных единиц: в 17 улусах и в городах Якутске и Нерюнгри с подчиненными территориями (рис.1). Диапазон распространенности МД по улусам крайне широк и составляет от 2,2 до 122,2 на 100 тысяч населения. Наибольшие частоты МД встречаются в Ам-гинском, Горном, Оленекском, Среднеколымском, Сунтарском улусах (рис.1). Факт накопления МД в вышеперечисленных улусах может быть объяснен с одной стороны тем, что коренное население составляет большинство, а с другой - малочисленностью населения отдельных улусов.
Сравнение распространения МД по принципу административно-территориальной подразделенности республики не дает возможности выявить какие-либо закономерности. Поэтому 17 улусов, города Якутск и Нерюнгри, в которых зарегистрированы больные МД, распределены на 5 основных территорий, представленные в таблице 8: Центральные, Вилюйские, Юго-Западные, Северные и г. Якутск. В Центральную группу были определены улусы Центральной Якутии, расположенные в основном в Лена-Амгинском междуречье: Амгинский, Горный, Мегино-Кангаласский, Намский, Хангаласский, Усть-Алданский. Вилюйская группа представлена из улусов по бассейну реки Вилюй: Вилюйский, Верхневилюйский, Нюрбинский, Сунтарский, Кобяйский. В Юго-Западную группу включены Ленский, Олекминский улусы и г. Нерюнгри с подчиненными территориями.
Репродуктивные показатели в семьях с миотонической дистрофией
Младшая дочь: Р.Л. ШІ-2У 1984 г.р. Из анамнеза: родилась в срок, психомоторное развитие соответствовало возрасту. Первые симптомы заболевания появились в 10 лет, когда появилась слабость в руках, ногах, изменение речи, затем появились спазмы в руках, в жевательных мышцах, боли в области сердца - КЮ форма. Наблюдается в МПС с 12 лет. Заболевание в динамике прогрессирует.
Объективное исследование. Неврологический статус: Гипотрофия лицевой и жевательной мускулатуры, западение височных ямок, слабо надувает щеки. Выраженные миотонические явления при разжатии пальцев кистей, феномен I пальца. Речь дизартрична, гнусавый оттенок голоса, поперхива-ния. Выражена атрофия грудино-ключично-сосцевидных мышц, мышц конечностей, особенно дистальных отделов рук и мышц голеней. Мышечная сила значительно снижена, с постели встает с помощью миопатических приемов, голову от подушки не отрывает. Сухожильные рефлексы с рук не вызываются, с ног - снижены.
Данные лабораторных и функциональных исследований. Биохимический анализ крови без патологии. Глазное дно: без особенностей. ЭНМГ: миотонические разряды, полифазные ПДДЕ, уменьшение амплитуды М-ответов по срединным нервам, снижение скорости проведения импульсов по болынеберцовым, малоберцовым нервам. ЭКГ: синусовая аритмия. ЭЭГ: легкие диффузные изменения. УЗИ: гиперплазия щитовидной железы, гипоэхо-генные надпочечники, уплотнение стенки желчного пузыря. Заключение эндокринолога: латентная полиэндокринопатия (нарушение толерантности к глюкозе, гипотиреоз, хроническая надпочечниковая недостаточность).
Сибс Р.Ю. (ЇЇ-6), I960 г.р. Миотонические спазмы появились с 16 лет. С возрастом прогрессирует мышечная слабость, изменился голос. Образование высшее - учителем по физическому воспитанию.
Фенотип: удлиненное лицо, в теменной области участки облысения, западение височных ямок, оттопыренные ушные раковины, высокое узкое твердое небо. Неврологический статус: Зрачки и глазные щели D=S. Гипотрофия жевательной мускулатуры, слабость мимической мускулатуры (слабо жмурит глаза, плохо образует складки на лбу и надувает щеки). Голос гнусавый. Гипотрофия мышц шеи, лежа с трудом поднимает голову. Легкая гипотрофия мышц плеча, гипотрофия дистальных групп мышц - предплечий и кистей, голеней. С трудом ходит на носках, пятках. Сухожильные рефлексы с рук низкие, коленные снижены, ахилловы не вызываются. Гипестезия по по-линевритическому типу. Миотонический спазм при разжатии пальцев кистей, феномен I пальца, симптом «валика». Динамометрия кистевая слева и справа 10 кг. По данным дополнительных обследований выявлены начальная катаракта (окулист); нарушение проведения по периферическим нервам и миото-нические разряды (ЭНМГ); синусовая брадикардия, замедление атриовен-трикулярной проводимости, синдром ранней реполяризации желудочков (ЭКГ). У больного классифицирована KB форма МД. Осмотрены дети: дочь (Ш-14), 1990 г.р и сын (Ш-15), 1994 г.р. - клинически здоровы.
Сибс Р.А. (П-7), 1971 г.р. Начало заболевания с 20 лет. Клинически -признаки KB формы МД. Дополнительные методы обследования выявляют: ЭНМГ - дистальный уровень аксональной полиневропатии, ЭКГ - замедление атриовентрикулярной проводимости, полная блокада правой ножки пучка Гиса, удлинение интервала Q (0,44 ), нарушение процессов реполяризации в передне-перегородочной области, эхокардиография - без особенностей, УЗИ щитовидной железы - увеличение 3 степени. Эндокринолог: гипотиреоз. Лабораторные исследования: тиреотропный гормон - 14,4 мкЕд/мл (норма 0,3-0,8), тироксин свободный - 8,62 нмоль/л (норма 9,8-16,8), лактатдегидро-геназа - 228 U/L, креатинкиназа - 242 U/L.
Осмотрены дети Р.А.: Старший сын Р. Р. (Ш-16), 1996 г.р. В раннем возрасте развитие по возрасту. На момент обследования (в возрасте 8 лет) родители отмечают быструю утомляемость, медлительность, низкую успеваемость в учебе. С 6 лет миотонические спазмы, постоянно полуоткрытый рот. Клинически и по данным функциональных обследований, выявлены проявления РД формы МД. Младший сын (III-17). 2002 г.р., на момент обследования клинически здоров.
Сибс: P.M. (П-4), 1977 г.р. Направлена из улусной больницы в связи с беременностью, осложненной гестозом, многоводием, на сроке 35 недель. При осмотре выявлены признаки МД. Диагноз МД был выставлен впервые. У консультируемой отягощенный акушерско-гинекологический анамнез: при I беременности многоводие, гестоз, роды произошли на сроке 37 недель, ин-транатальная гибель плода; II беременность - самопроизвольный выкидыш на раннем сроке (в 5-6 недель). В динамике - родоразрешение оперативным путем в 36-37 недель. Во время операции у больной отмечалось нарушение дыхания. Ребенок (III-12) родился в крайне тяжелом состоянии с признаками тяжелой врожденной МД, умер в месячном возрасте от легочно-сердечной недостаточности.
Мать пробанда Р.Л. (1-2), 1940 г.р. Жалобы на снижение зрения, боли в области сердца. В зимнее время отмечает затруднение при разжатии пальцев, сжатых в кулак, тем не менее, считает себя здоровой. Проведены обследования: ЭНМГ выявляет синдром нарушения проведения по срединным, локтевым нервам легкой степени, по больше берцовым и малоберцовым нервам -умеренной степени по аксональному типу; на ЭКГ - синусовая брадикардия (54 в мин.), замедление атриовентрикулярной проводимости. Заключение окулиста: Гиперметропия I степени, начальная катаракта. Фенотип: западе-ние височных впадин, легкая гнусавость голоса, высокое узкое небо, легкое оживление рефлексов с рук и ног, намечен миотонический феномен I пальца. Учитывая легкие признаки (катаракта, миотонический феномен, ЭКГ-признаки нарушения проводимости), наличие семейного анамнеза, у консультируемой установлена минимальная форма МД..
Молекулярной основой антиципации является значительное увеличение числа CTG триплетов в гене МД при прохождении через гаметогенез нестабильных аллелей [Buxton et al., 1992; Harley et al., 1992]. Антиципация проявляется сильнее, когда ген унаследован от матери [Ashizawa et al., 1994b; Harley et al., 1993; Lavedan et al., 1993; Magee et al., 2002]. В небольшом проценте случаев может происходить уменьшение размера мутации при передаче потомству, при этом может наблюдаться клиническая антиципация у детей [Ashizawa et al., 1994; Harley et al., 1993].
Таким образом, в наших исследованиях подтверждена значительная клиническая вариабельность МД: мультисистемность поражений, внутри- и межсемейный полиморфизм, антиципация при передаче заболевания из поколения в поколение. МД может проявляться не только как классическая юношеская и взрослая формы, так и в виде ранней детской и врожденной форм, которые в PC (Я) диагностированы впервые. Данное обстоятельство необходимо учитывать в клинической диагностике.
