Введение к работе
Актуальность проблемы. Перспективы в изучении природы широко распространенных заболеваний связаны с познанием генома человека, с выявлением его особенностей, создающих предпосылки для формирования патологического фенотипа (Пузырев, 2009; Баранов, 2009). В развитии предрасположенности человека к многофакторной патологии важную роль играют как генетическая конституция индивидуума, так и действие факторов внешней среды. При этом соотношение средовых и генетических факторов сильно варьирует при различных заболеваниях (Пузырев, 2009; Баранов, 2009). В структуре общей заболеваемости населения России болезни органов дыхания традиционно занимают лидирующую позицию - на их долю приходится до 27,8% всей зарегистрированной и 42,7% выявленной впервые в жизни патологии (Щепин, 2001). Среди хронических респираторных заболеваний у взрослых значительная часть приходится на хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), у детей и подростков - на хронические бронхолегочные заболевания (ХБЛЗ) (Чучалин, 2009). Профессиональный бронхит формируется у 4,5-24,6% лиц, работающих во вредных и неблагоприятных производственных условиях (Лещенко с соавт., 2004). К факторам, которые способствуют развитию заболеваний органов дыхания, относят курение табака, профессиональную вредность (воздействие аэроирритантов, пыль, химических веществ), атмосферные поллютанты (диоксид серы, азота и углерода, свинец, угарный газ, кремний, асбест, уголь), частые инфекции респираторного тракта, а также социально-экономический статус пациента (GOLD, 2010). Наследственная предрасположенность является важным внутренним фактором риска развития хронических заболеваний органов дыхания, с которыми тесно связаны особенности иммунологической реактивности, роста и развития легких (GOLD, 2010). Многие аспекты развития хронических заболеваний органов дыхания до сих пор не ясны, но известны ключевые звенья, патогенеза. Это, прежде всего, хроническое воспаление, запускающее весь каскад патогенетических реакций, приводящих к нарушению баланса протеолитических ферментов и их ингибиторов, и развитию окислительного стресса. Генетические механизмы формирования ХОБЛ в последние годы стали объектом широкомасштабных исследований во всем мире. В результате проведенного полногеномного анализа сцепления при ХОБЛ, показана высокая степень сцепления локусов на хромосоме 19q - TFGB1 (transforming growth factor, beta 1, трансформирующий фактор роста бетаї) и хромосоме 2q - SERPINE2 (serpin peptidase inhibitor, clade E, серпиновый
ингибитор пептидаз, тип Е) (Silverman, 2002; Palmer, 2003). Из опубликованных к настоящему моменту данных полногеномных исследований генетических ассоциаций (GWAS), выявлено несколько локусов, связанных с развитием ХОБЛ, на 4-й и 15-й хромосомах в области 15q25.1 - CHRNA3, CHRNA5, (cholinergic receptor nicotinic alpha 3, холинергические никотиновые рецепторы альфа 3 и 5), IREB2 firon-responsive element binding protein 2, белок железо-связывающего элемента 2), PSMA4 (proteasome subunit alpha type 4, субъединица альфа 4-го типа протеосомного комплекса), 4q31.21 - HHIP (hedgehog interacting protein, взаимодействующий протеин hedgehog сигнального пути), 4q22.1 - FAMI З А (family with sequence similarity 13 member А, член А семейства со схожей последовательностью 13) и новый маркер rs7937 на хромосоме 19ql3 (Pillai, 2009; Wilk, 2009; Repapi, 2009; Cho, 2010; Wan, 2010; Kong, 2010, 2011; Siedlinski, 2011; Cho, 2011). До «Эры GWAS» генетическая составляющая ХОБЛ достаточно активно изучалась с использованием анализа генов-кандидатов (Wang et al., 2009; Sadeghnejad et al., 2009; Haq et. al., 2010; Silverman et al., 2011). Данный метод до сих пор наиболее широко используется при проведении исследований по генетике ХОБЛ, поскольку позволяет сосредоточиться на одном или нескольких функционально значимых аллельных вариантах гена, кодирующих соответственно варианты белка, различающиеся по структуре и функциям, некоторые из которых могут быть вовлечены в развитие патогенетических изменений. Несмотря на значительное число исследований, выполненных с использованием разных подходов, молекулярно-генетические основы ХОБЛ до сих пор остаются во многом не ясными. На сегодняшний день перспективным является изучение не только генетических и молекулярных, но и эпигенетических факторов (метилирования ключевых генов, анализ активности гистонов, роли микро-РНК) (Silverman et al., 2011). Работа в различных направлениях позволит приблизиться к пониманию сложных процессов, приводящих к развитию болезни. Выбранные для настоящего исследования хронические заболевания органов дыхания хроническая обструктивная болезнь лёгких, хронические бронхолегочные заболевания у детей, хронический профессиональный бронхит - занимают лидирующие позиции по распространенности, тяжести течения, серьезности осложнений и являются основными причинами высоких темпов роста заболеваемости, инвалидизации и смертности населения, как в Российской Федерации, так и во многих других странах, что свидетельствует об актуальности изучения генетических основ данных заболеваний и выяснения основных причин их возникновения.
Цель работы: на основе комплексного анализа полиморфных локусов генов-кандидатов и факторов окружающей среды охарактеризовать особенности формирования наследственной предрасположенности к развитию хронической обструктивной болезни легких, хроническим бронхолегочным заболеваниям у детей и профессиональному хроническому бронхиту
Задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ полиморфных вариантов генов ферментов
биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов
воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза в трех
этнических группах жителей Республики Башкортостан (русские, татары,
башкиры).
2. Изучить ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с
предрасположенностью к хронической обструктивной болезни легких,
хроническим бронхолегочным заболеваниям у детей и профессиональному
хроническому бронхиту.
3. Выявить генетические локусы, ассоциированные с развитием хронических
заболеваний органов дыхания, с учетом этнической принадлежности и полового
диморфизма.
4. Исследовать взаимосвязь полиморфных вариантов генов-кандидатов с
клиническими формами, тяжестью течения и возрастом манифестации
хронической обструктивной болезни легких с учетом влияния факторов
окружающей среды и тендерных различий.
5. Проанализировать характер взаимодействий между генами-кандидатами и средовыми факторами (статус и интенсивность курения, стаж работы во вредных производствах), определить их роль в этиопатогенезе хронических заболеваний органов дыхания.
6. На основе изучения моделей взаимодействия генов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза оценить значимость ключевых генов в формировании наследственной предрасположенности к хроническим заболеваниям органов дыхания.
Научная новизна: Впервые проведен комплексный анализ формирования наследственной предрасположенности к развитию хронических заболеваний органов дыхания, спровоцированных курением, профессиональной деятельностью
и респираторными инфекциями, на основе анализа функционально значимых полиморфных локусов генов-кандидатов, изучения взаимодействия генетических и средовых факторов, выявления этнической гетерогенности полученных ассоциаций. Впервые получены данные о частотах аллелей и генотипов полиморфных локусов генов CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2S1, NQ01, ЕРНХ1, UGT2B7, GPX1, ММР1, 2, 3, 9, 12; TIMP2, 3; SERPINA1, SERPINA3, VDBP в этнических группах русских, татар и башкир, проживающих в Республике Башкортостан. Впервые установлена ассоциация полиморфных вариантов генов NQ01, ММРЗ, CYP2S1, CYP2F1, TIMP3, UGT2B7, ММР9 с развитием хронических заболеваний органов дыхания. Определены значимые ген-средовые взаимодействия с курением для локусов ADAM33 (12418A>G), TIMP3 (-1296Т>С), VDBP (1296T>G), CYP1A1 (2454A>G), CYP2F1 (c.l4_15insC), GPX1 (5990T), SOD3 (6910G), UGT2B7 (21460), EPHX1 (415A>G) и со стажем работы для локусов IL1RN (VNTR), VDBP (1307OA) и CYP1A1 (3798T>C) при формировании хронических заболеваний органов дыхания. Выявлена ассоциация полиморфных локусов UGT2B7 (2146С>Т), NAT2 (590G>A), CYP1A1 (2454A>G) с возрастом манифестации, LTA (252A>G), IL6 (-174G>C), CYP2E1 (-1053ОТ), ММР9 (-15620Т) с тяжестью течения, UGT2B7 (21460Т), ADAM33 (13491 OG), IL1RN (VNTR), VDBP (1296T>G) с клиническими вариантами хронической обструктивной болезни легких.
Научно-практическая значимость работы: Полученные результаты вносят вклад в понимание структуры наследственной предрасположенности к развитию хронических заболеваний органов дыхания и являются базой для познания механизмов их патогенеза, профилактики, диагностики и лечения. Результаты исследования широкого спектра генов-кандидатов с хроническими заболеваниями органов дыхания, анализ их взаимодействия с факторами среды, особенности ассоциации генетических маркеров в дифференцированных по полу и этнической принадлежности группах могут быть использованы в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска. Данные диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза в этнических группах (русских, татар, башкир), проживающих в Республике Башкортостан, характеризуется широким аллельным
разнообразием. Межэтнические различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов CYP1A1 (3798Т>С), CYP1A1 (2454A>G), CYP1A2 (-2467delT), CYP2A6 (del), CYP2E1 (-1053ОТ), SOD1 (c.239+34A>C), ILIRN(VNTR), IL10 (-6270A), VDBP (1296T>G).
2. С развитием хронической обструктивной болезни легких ассоциированы
полиморфные варианты генов NQOl (4650Т), CYP2A6 (del), CYP1A2 (-1630А),
CYP2S1 (13255A>G), ЕРНХ1 (337Т>С), GSTP1 (313A>G), SOD3 (6910G), CAT (-
2620T), IL6 (-174G>C), VDBP (1296T>G и 1307OA), MMP3 (-11715A>6A),
ADAM33 (12418A>G). Развитие хронических бронхолегочных заболеваний у детей
ассоциировано с полиморфными вариантами генов CYP2F1 (c.l4_15insC), CYP1A1
(2454A>G, 3798>С), NQOl (4650T), GSTT1 (del), GSTP1 (313A>G), CAT (-
262C>T), IL6 (-174G>C), IL1RN (VNTR), VDBP (1296T>G и 1307OA), MMP1 (-
1607 G>GG), MMP12 (-82A>G), MMP3 (-11715A>6A), MMP9 (2660A>G).
Ассоциация с профессиональным хроническим бронхитом полиморфных
вариантов генов VDBP (1296T>G и 1307ОА), UGT2B7 (21460Т), CYP1A2 (-
2467delT), GSTP1 (313A>G), NQOl (4650T), CAT (-2620T), IL8 (-251T>A),
ADAM33 (134910G), MMP9 (2660A>G), MMP1 (-519A>G). Спектр выявленных
маркеров наследственной предрасположенности при каждой патологии
существенно варьирует в зависимости от этнической принадлежности и полового
диморфизма.
3. Полиморфизм генов UGT2B7 (21460Т), NAT2 (857G>A), GSTM1 (del), CYP1A1
(2454A>G) вносит вклад в вариабельность возраста манифестации хронической
обструктивной болезни легких; ассоциированы с тяжестью течения заболевания
полиморфные варианты генов LTA (252A>G), IL6 (-174G>C), CYP2E1 (-1053ОТ)
ММР9 (-1562С>Т); развитие эмфиземы легких ассоциировано с локусами UGT2B7
(2146С>Т), ADAM33 (134910G), ILIRN(VNTR), VDBP (1296T>G).
4. Структура наследственной предрасположенности при формировании
хронических заболеваний органов дыхания различается у индивидов
подверженных курению и некурящих. При хронической обструктивной болезни
легких и профессиональном хроническом бронхите наблюдаются значимые
взаимодействия средовых факторов (статуса и интенсивности курения, стажа
работы во вредных производствах) с полиморфными вариантами генов ADAM33
(12418A>G), TIMP3 (-1296Т>С), VDBP (1296T>G), CYP1A1 (2454A>G), CYP2F1
(c.l4_15insC), GPX1 (599C>T), SOD3 (691C>G), UGT2B7 (2146C>T), EPHX1
(415A>G), IL1RN (VNTR).
5. Характер межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза варьирует в зависимости от конкретного заболевания, этнической принадлежности, полового диморфизма и статуса курения.
Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 14 - 21 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания, (Москва, 2003, 2005, 2009, 2010; Санкт-Петербург, 2004, 2006; Казань, 2007; Екатеринбург, 2008; Уфа, 2011); на ежегодных международных конгрессах Европейского респираторного общества (Вена, 2003, 2009; Глазго, 2004; Копенгаген, 2005; Мюнхен, 2006; Стокгольм, 2007; Берлин, 2008; Барселона, 2010; Амстердам, 2011); на конференциях Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004, 2009); на V и VI и Съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; Ростов-на-Дону, 2010); на IX и X Всероссийских Форумах с международным участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005, 2006); на XIX международном конгрессе аллергологов и клинических иммунологов (Мюнхен, 2005); на ежегодных конференциях Европейского общества по генетике человека (Копенгаген, 2005; Амстердам, 2006, 2011; Ницца, 2007; Барселона, 2008; Вена, 2009; Гётенбург, 2010); на международном конгрессе «Геном человека» Human Genome Meeting (Киото, 2005); на Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», (Новосибирск, 2005); на II Санкт-Петербургском международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); на 3-м конгрессе Европейского общества педиатров «Europaediatrics» (Стамбул, 2008).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 78 работ, из них 32 статьи в журналах из Перечня ВАК, в том числе, 15 в журналах из международной базы цитирования (PubMed), 1 статья в зарубежной печати. В виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций опубликовано 45 работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 411 страницах машинописного текста. Данные проиллюстрированы таблицами (85), рисунками (51) и приложениями (2). Список литературы включает 577 источников. Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь в проведении совместных исследований и обсуждении результатов работы, директору ИБГ УНЦ РАН, д.б.н., проф. Вахитову В.А., зав. Отделом геномики ИБГ
УНЦ РАН д.б.н., проф. Хуснутдиновой Э.К., главному пульмонологу РБ, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней БГМУ д.м.н., проф. Загидуллину Ш.З. (БГМУ), зав. пульмонологическим отделением ГКБ №21 д.м.н, проф. Фархутдинову У.Р., к.м.н. Байнак О.В. (БГМУ), директору Уфимского научно-исследовательский института медицины труда и экологии человека, г. Уфы д.м.н., проф. Бакирову А.Б. и врачу-профпатологу отделения профессиональной аллергологии и иммунореабилитации к.м.н., Мингазовой СР., зав. кафедрой детских болезней БГМУ д.м.н., проф. Эткиной Э.И., к.м.н. Бабенковой Л.И. (БГМУ), врачу-педиатру пульмонологического отделения РДКБ Нуриахметовой А.Ж.; аспиранту Department of Genetic Epidemiology, George-August University of Goettingen (Германия) Викторовой E.B. Сотрудникам и коллегам лаборатории экологической генетики человека ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Ахмадишиной Л.З., к.б.н. Кочетовой О.В., к.б.н. Янбаевой Д.Г., к.б.н. Данилко К.В., к.б.н. Целоусовой О.С, сотрудникам лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Хусаиновой Р.И., к.м.н. Карунас А. С. и всем коллегам лаборатории физиологической генетики и молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН.
