Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1 Диагностика остеопороза 19
1.2. Генетические факторы остеопороза 22
1.3. Полногеномные исследования ассоциаций 24
1.4. Генетические факторы риска переломов 39
1.5. Патогенетические пути, вовлеченные в развитие метаболических остеопатии 46
1.5.1. Молекулярно-генетические основы незавершенного остеогенеза
1.5.1.1. Гены, ответственные за развитие доминантных форм незавершенного остеогенеза 53
1.5.1.2. Гены, обуславливающие развитие рецессивных форм незавершенного остеогенеза 1.6. Прогностические модели риска развития переломов 65
1.7. Новые подходы и направления в исследовании остеопороза 76
1.7.1. Роль микроРНК в развитии остеопороза 82
1.7.1.1. Участие микроРНК в регуляции костного метаболизма 84
1.7.1.2. Полиморфизм сайтов связывания микроРНК и остеопороз 95
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 101
2.1 .Материалы исследований 101
2.2. Методы исследований 105
2.2.1 Выделение геномной ДНК 105
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК (ПЦР) 106
2.2.3. ПЦР «в реальном времени с использованием технологии TagMan 107
2.2.4. Рестрикционный анализ (ПДРФ-анализ) 110
2.2.5. Метод электрофореза 111
2.2.6. Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК 112
2.2.7. Секвенирование
2.3. Статистическая обработка полученных результатов 113
2.4. Дизайн исследования 117
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 123
3.1. Молекулярно-генетическое изучение незавершенного остеогенеза 123
3.1.1. Поиск структурных изменений в генах COL1A1, COL1A2, LEPREl, PPIBl, CRTAP, SERPINHl у больных незавершенным остеогенезом 124
3.1.2. Анализ гено-фенотипических корреляций идентифицированных мутаций с формой заболевания и типом наследования у больных незавершенным остеогенезом. 137
3.1.3. Анализ ассоциаций выявленных полиморфных вариантов генов COL1A1, COL1A2, LEPREl, PPIBl, CRTAP, SERPINHl с риском развития переломов у больных незавершенным остеогенезом . 146
3.1.4. Разработка подходов к ДНК-диагностике незавершенного остеогенеза. 159
3.2. Анализ генетической структуры выборки женщин постмено паузального возраста из Волго-Уральского региона 163
3.3. Анализ полиморфных вариантов кандидатных генов остеопороза у женщин русской и татарской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона 168
3.3.1.Исследование полиморфных вариантов генов компонентов костного матрикса 169
3.3.1.1. Изучение полиморфных вариантов генов альфа 1 цепи коллагена 1 типа (COL1A1) и альфа 1 цепи коллагена 11 типа (COL11A1) 170
3.3.2. Исследование полиморфных вариантов генов Wnt сигнального пути 188
3.3.2.1. Изучение полиморфных вариантов гена белка 5, связающегося с рецептором липопротеина низкой плотности (LRP5) 189
3.3.2.2. Изучение полиморфных вариантов генов WNT4, WNT16 и трансмембранного белка Wntless (GPR177, WLS) 203
3.3.3. Исследование полиморфных вариантов генов, участвующих в 9+
регуляции гомеостаза Са 215
3.3.3.1. Изучение полиморфных вариантов гена паратиреоидного гормона (РТН) 216
3.3.3.2. Изучение полиморфных вариантов генов кальцитонина (CALCA) и его рецептора (CALCR) 230
3.3.3.3. Изучение (ТААА)пполиморфизма гена витамин Д-связывающего белка (DBP) 244
3.3.3.4. Исследование полиморфизма c.2956G T (p.Ala996Ser)
рецептора чувствительности к кальцию (CaSR) 249
3.3.4. Исследование полиморфных вариантов генов ядерных рецепторов 254
3.3.4.1. Изучение полиморфных вариантов генов рецептора витамина Д (VDR), 255
3.3.4.2. Исследование полиморфных вариантов рецептора эстрогенов альфа (ESR1) 273
3.3.6. Исследование полиморфных вариантов генов цитокинов 285
3.3.6.1. Изучение полиморфных вариантов генов остеопротегерина (TNFRSF11), рецептора фактора некроза опухоли 11 A (TNFRSF11A) 285
3.3.7. Исследование полиморфных вариантов генов ферментов 312
3.3.7.1. Изучение полиморфных вариантов гена лактазы (LCT)) 312
3.3.7.2. Исследование полиморфных вариантогв гена ароматазы (CYP19) 325
3.3.8. Исследование полиморфизма сайтов связывания микроРНК 345
3.4. Репликация данных полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) 360
3.4.1. Поиск ассоциаций GWAS-локусов с переломами у женщин из Волго-Уральского региона России 360
3.4.2. Поиск ассоциаций GWAS-локусов с уровнем МПКТ у женщин из Волго-Уральского региона России 367
3.4.3. Оценка вариабельности уровня МПКТ шейки бедра и поясничных позвонков в зависимости от генотипов GWAS-локусов 377
3.5. Поиск ассоциаций изученных локусов с переломами различных отделов скелета 381
3.6. Мета-анализ результатов исследования 386
3.7. Поиск прогностических моделей развития переломов 391 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 396 ВЫВОДЫ 412
Список литературы 415
- Патогенетические пути, вовлеченные в развитие метаболических остеопатии
- Новые подходы и направления в исследовании остеопороза
- ПЦР «в реальном времени с использованием технологии TagMan
- Анализ ассоциаций выявленных полиморфных вариантов генов COL1A1, COL1A2, LEPREl, PPIBl, CRTAP, SERPINHl с риском развития переломов у больных незавершенным остеогенезом
Патогенетические пути, вовлеченные в развитие метаболических остеопатии
Прочность костей определяется двумя факторами - уровнем минеральной плотности костной ткани (МПКТ) и качеством кости [Bono et al., 2003]. Уровень МПКТ измеряется двуэнергетической рентгеновской абсорбциометрией (DEXA) и обычно выполняется в поясничном отделе позвоночника и шейке бедра. Качество кости можно оценить с помощью трехмерных методов визуализации, таких как периферическая компьютерная томография и магнитно-резонансная томография с высоким разрешением [Bouxsein and Seeman, 2009], но они в настоящее время используются, в основном, в научных исследованиях и не доступны для клинического применения.
Оценка риска переломов, используя только измерение уровня МПКТ, имеет ограничения. У женщин в постменопаузе и мужчин в возрасте старше 50 лет, диагноз остеопороза может быть поставлен либо при возникновении перелома (после падения с высоты своего роста, при отсутствии новообразований) или с помощью Т-критерия, определяемого при остеоденситометрии (DEXA). Всемирная организация здравоохранения опубликовала рекомендации по классификации Т-критерия: -1,0 - норма, от -1,0 до -2,5 в отсутствии перелома как "низкая костная масса" (или остеопения) [World Health Organization, 1994]. При остеопорозе Т-критерий (в поясничном отделе позвоночника, бедра в целом, или шейки бедренной кости) соответствует уровню МПКТ, который на 2,5 стандартных отклонений (SD) (или более) ниже, чем МПКТ в "среднем" у молодых взрослых людей. Определение остеопороза у женщин в пременопаузе и у мужчин моложе 50 лет является спорным. Согласно принципам национального фонда остеопороза США, у пациента должен быть перелом и уровень МПКТ 2 стандартных отклонений (SD) от среднего уровня МПКТ у людей того же возраста и пола (т.е. Z-критерий -2,0) [National Osteoporosis Foundation, 2008; Martinez-Morillo et al., 2012].
Из-за высокой распространенности остеопороза и доказанной пользе фармакологического лечения для снижения риска переломов [Compston et al., 2009], целесообразно выявлять индивидуумов с повышенным риском переломов до их возникновения. В большом мета-анализе более чем 2000 случаев переломов за 90-летний период наблюдений было подсчитано, что каждое снижение стандартного отклонения (SD) уровня МПКТ от среднего, с поправкой на возраст, было связано с 2,3-кратным увеличением переломов позвонков и 2,6-кратным увеличением переломов бедра [Marshall et al., 1996; King and Fiorentino, 2011; O Malley et al., 2011; Tanner et al., 2011]. Возможность прогнозирования была примерно одинаковой, как для одного увеличения стандартного отклонения (SD) артериального давления для прогнозирования инсульта и лучше, чем одно увеличение стандартного отклонения (SD) концентрации сывороточного холестерина для прогнозирования сердечно-сосудистых заболеваний [Marshall et al., 1996]. В более позднем мета-анализе Johnell с соавторами сообщили, что каждое снижение SD уровня МПКТ примерно соответствовало 2,9 кратному увеличению риска перелома бедра [Johnell et al., 2005]. Несмотря на то, что эти результаты иллюстрируют полезность остеоденситометрии с помощью DEXA как инструмента скрининга остеопороза, этот метод не имеет высокой чувствительности для предсказания перелома на индивидуальном уровне [Jones et al., 1994; Smith et al., 1999]. В то время как пожизненный риск переломов у женщин и мужчин в возрасте старше 50 лет составляет, по оценкам, 50% и 30%, соответственно [Nguyen et al., 2007], более 50% женщин и 70% мужчин, у которых был перелом, уровень МПКТ не соответствовал остеопорозу по критериям ВОЗ [Nguyen et al., 2007]. Инструменты, которые оценивают качество костной ткани, а не только его количество (например, периферическая компьютерная томография с высоким разрешением) улучшают предсказание риска перелома, но не доступны для практического применения [Nishiyama et al., 2013]. Всемирная организация здравоохранения в 2008 году для улучшения прогнозирования переломов разработала метод «FRAXtool» (http://www.shef.ac.uk/FRAX/) в качестве онлайн калькулятора, который интегрирует информацию об уровне МПКТ и клинических факторах риска для расчета 10-летний вероятности перелома бедра или каких-либо серьезных остеопоретических переломов (позвоночника, предплечья, бедра или плеча). Клинические факторы риска, включенные в прогнозирование переломов FRAXtool, включают возраст, пол, рост, вес, наличие перелома, наследственную отягощенность по перелому бедра (наличие перелома у родителей), использование глюкокортикоидов, курение, избыточный прием алкоголя, ревматоидный артрит и вторичные причины остеопороза. Отдельные алгоритмы предсказания были разработаны для различных географических регионов и этнических групп. Национальный фонд остеопороза США рекомендует фармакологическое лечение людей с низкой костной массой, которые имеют 10-летний риск не менее 20% для любого перелома или 3% для перелома бедра, рассчитанной FRAXtool [National Osteoporosis Foundation, 2008]. Приблизительно 30% женщин и 19% мужчин в возрасте старше 50 лет в США отвечают критериям фармакологического лечения [Dawson-Hughes et al., 2012].
Из-за широкой доступности двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA), высокой точности и соотношения уровня МПКТ с риском переломов, большая часть исследований остеопоретических переломов была сосредоточена на выявлении факторов риска, связанных с вариабельностью уровня МПКТ [Samelson and Hannan, 2006; Lane et al., 2006; Kiel et al., 2009].
Обнаружено, что уровень МПКТ ниже и частота переломов шейки бедра выше у женщин по сравнению с мужчинами, а также в популяциях европейского происхождения по сравнению с неевропейскими народами. Высокая масса тела также ассоциирована с более высоким уровнем МПКТ и снижением риска переломов бедра. Корреляции могут объясняться несколькими факторами, в том числе высокой механической нагрузкой на кости скелета, что может способствовать минерализации и прочности костей, секрецией адипокина (adipokine) из жировой ткани и амортизацией, которая может защитить кости от травмы при падении. Большинство «непозвоночных» переломов связано с падениями, и эта зависимость от падений усложняет способность точного предсказания переломов [Marini and Brandi, 2009; 2012].
Новые подходы и направления в исследовании остеопороза
Выборка женщин была разделена на группы сравнения в зависимости от этнической принадлежности, наличия и отсутствия переломов, уровня МПКТ, показателям Т-критерия (согласно рекомендациям ВОЗ), выше -1 стандартного отклонения (SD) от показателя пика костной массы молодых женщин в возрасте 30-35 лет относятся к нормальным значениям МПКТ, значения от -1SD до -2,5SD классифицируются как остеопения, отклонение ниже -2,5 SD - остеопороз. Оценка МПКТ шейки бедра и поясничного отдела позвоночника проводилась методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA) на аппарате QDR 4500A («Hologic», США). В группу с переломами вошли женщины с наличием низкотравматичных переломов (возникающих при падении с высоты собственного тела, при незначительной нагрузке или без видимых причин), произошедших в постменопаузе. Все переломы были подтверждены рентгенологически.
Группа женщин с переломами состояла из 365 человек, контрольная группа -517 человек, средний возраст составил 62, 9 и 61,6, соответственно. В группе с переломами 254 женщины русской этнической принадлежности, 98 - татарской этнической принадлежности, в качестве контрольной группы использованы 330 женщин русского происхождения и 183 женщин татарского происхождения. Средний возраст женщин был сопоставимым в группах сравнения. Характеристика групп сравнения представлена в таблице. 3.
У 471 женщин проведено исследование МПКТ, среди них показатели МПКТ шейки бедра исследованы у 383 женщин, МПКТ поясничного отдела позвоночника - у 384 женщин. Согласно результатам денситометрического обследования, диагноз остеопороз был поставлен 187 женщинам (39,7%), остеопения - 178 (37,8%), а у 106 обследованных (22,5%) были нормальные показатели МПКТ (группа здоровые) (табл. 4).
При остеопорозе проведено изучение 155 локусов, расположенных на всех хромосомах человека, кроме Y хромосомы (генотипирование 99 локусов осуществлялось в рамках исследований международного консорциума «GEFOS») с применением методов ПЦР «в реальном времени» с использованием технологии TagMan, аллель специфической ПЦР (The Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system (KASP)) и ПЦР-ПДРФ анализа.
При незавершенном остеогенезе проводился поиск структурных изменений кандидатных генов с применением методов SSCP-анализа (анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) и секвенирования. Работа частично выполнена на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК». ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]. Кровь набирали в пробирки с консервантом К3ЭДТА.
Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера (320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MDBP12, ЮмМ трис-НС1, рН 7,6) и центрифугировали при 4 С и 4000 об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 минут. К полученному осадку добавляли 800 мкл буфера Soline ЭДТА ( 25 мМ ЭДТА, рН 8,0, 75 мМ NaCl). Затем ресуспензировали полученный раствор и переносили его в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки, добавляли 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали при 37 С в течение 16 часов. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: раствором забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, рН 7,8), смесью фенола - хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин., центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объёмом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, подсушивали на воздухе, растворяли в деионизированной воде и хранили при -20 С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Для всех локусов амлификация была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей следующие обязательные компоненты: 25 мМ Tris-HCl, рН 8.4, 50 мМ КС1, 1,5 мМ MDBP12, 0.2 мМ каждого dNTP, по 5 пМ каждого из праймеров, 10-20 нг тотальной ДНК и 0,5 единицы Taq ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва). В случае необходимости для некоторых локусов с целью оптимизации в состав смеси для ПЦР вводился вспомогательный реагент - диметилсульфоксид.
Оптимальный температурный режим амплификации для конкретных участков генов подбирался экспериментально и варьировал в промежутке 65-69С, с учетом разного G-C контента использованных пар праймеров и первичной последовательности матрицы, а также специфичности самой полимеразной цепной реакции.
Полимеразную цепную реакцию синтеза ДНК «в реальном времени» с использованием TaqMan системы, контролирующей кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с помощью резонансного тушения флуоресценции, проводили на ДНК-амплификаторе «CFX96 Touch Deep Well Realtime PCR Detection System» (Bio-Rad), обладающей возможностью детекции и анализа флуоресценции по конечной точке с помощью встроенных средств программного обеспечения. Для детекции использовались разработанные праймеры и зонды, несущие флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Во время процесса амплификации за счет 5-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата. Техническая характеристика праймеров и зондов, использованных для анализа ряда локусов, а также условия ПЦР в режиме «реального времени» представлены в таблице 5.
ПЦР «в реальном времени с использованием технологии TagMan
Нами также обнаружены 15 полиморфных локусов, ранее описанных в литературе, три из которых расположены в промоторном регионе (rsl800012, rsll07946, rs2412298), одиннадцать - в интронных областях (rs2256835, rs67207840, rs 17639446, rs2734281, rs2141279, rs 1007086, rs 1800695, rs2696247, rs2857396, rs2075559, rs2586488), один - в 45-ом экзоне (rsl800215) гена COL1A1 (Рис. 1- 15 приложения). Два полиморфных варианта: с.544-24Т С и c.957+10insA, расположенные в 5 и 14 интронах гена COL1A1, обнаружены нами впервые только у одного больного НО русской этнической принадлежности, оценка их влияния на вероятность возникновения альтернативных сайтов сплайсинга, проведенная с помощью программы математического моделирования (http://www.umd.be/HSF/), не выявила значимость этих локусов в сплайсинге гена COL1A1. Идентифицирована мутация c.4005+lG T в гене COL1A1 в гетерозиготном состоянии в семье русской этнической принадлежности (рис. 9).
Таким образом, у больных незавершенным остеогенезом из РБ в гене COL1A1 выявлено 8 мутаций и 17 полиморфных вариантов. Все мутации обнаружены в гетерозиготном состоянии, у больных разного этнического происхождения, являются уникальными для каждой семьи, кроме мутации c.579delT (p.Glyl94ValfsX71), и в большинстве случаев приводят, в конечном счете, к преждевременной остановке синтеза белка.
Несмотря на большое количество зарегистрированных в литературе мутаций в гене COL1A1, для каждой популяции характерен свой спектр, состоящий из небольшого числа мутаций, варьирущей от 6 у больных НО из Бразилии до 14 у израильтян [Benusiene et al., 2003; Расе et al., 2002; Lee et al., 2006; Pollitt et al., 2006]. У больных из Литвы обнаружено 11 типов мутаций, американцев - 10, японцев - 9, китайцев - 8 [Benusienfi et al., 2003; Liu et al., 2007; Kataoka et al., 2007; Roschger et al., 2008] . При этом каждый исследователь находит ранее неописанные в литературе мутации, наряду с известными. Большинство мутаций, ведущих к НО являются уникальными, что свидетельствует о высокой изменчивости гена COL1A1. Однако есть некоторые участки гена, предположительно являющихся мутационными горячими точками, а не случайным явлением. Одной из таких точек является ко дон 79 гена COL1A1, расположенный в CpG динуклеотиде. Мутация в ко доне 579 гена COL1A1, где происходит однонуклеотидная деления тимина, обнаружена шестью группами исследователей у неродственных индивидов из различных популяций, что также может свидетельствовать о нестабильности этого кодона.
Ген COL1A2, кодирующий альфа 2 цепь коллагена I типа, локализован на 7q22 хромосоме и состоит из 52 экзонов [Witecka et al., 2008; Swinnen et al., 2009]. В настоящее время известно более 400 изменений нуклеотидной последовательности гена COL1A2, приводящие к развитию НО [https://oi.gene.le. ac.uk/home.php?select_db=COLlA2].
Нами проведено исследование 52 экзонов и прилегающих к ним интронных областей гена альфа 2 цепи коллагена 1 типа (СОЫА2), в результате которого идентифицированы 7 однонуклеотидных полиморфных вариантов, ранее описанных в литературе, пять из которых располагались в интронных участках гена (rs42518, rs28754326, rs2521206, rs421587, rs2301643), два - в экзонах (rs412777, rs42524). Все полиморфные варианты обнаружены как у больных, так и в контрольной группе здоровых индивидов. Мутаций в гене COL1A2 у больных НО из РБ не обнаружено.
Пролил-3 гидроксилаза 1 (LEPRE1), хрящ ассоциированный белок (CRTАР) и пептидил-пролил цис-транс изомераза В (PPIB) образуют пролил-3 -гидроксилирующий комплекс, который участвует в посттрансляционной модификации коллагена I типа, а также обладает шаперонной функцией, отсутствие компонентов комплекса вызывает задержку фолдинга спирали коллагена. [Vranka et al., 2004]. Каждый компонент комплекса также является многофункциональным белком с независимой функцией [Ishikawa et al., 2009].
Нами проведен анализ 14 экзонов гена LEPRE1, локализованного на хромосоме 1р34.1, кодирующего белок лепрекан (leprecan) или пролил 3 гидроксилазу-1 (РЗН1), участвующий в формировании правильного фолдинга, стабильности и секреции проколлагена [van Dijk et al., 2010; Zhang et al., 2011; Shaheen et al., 2012; Caparros-Martin.et al., 2013].
В литературе описана мутация сайта сплайсинга C.1720+5G A у больного 3-х месячного возраста афроамериканского происхождения [Pepin et al., 2013]. Справа от экзона 11 располагаются три нуклеотида G подряд в позициях от +3 до +5. Обнаруженная нами мутация, отличающаяся на одну позицию от ранее описанного изменения, также приводит к смещению сайта сплайсинга. Мы классифицировали обнаруженное нами изменение c.l720+4G A как новую, ранее неописанную мутацию сайта сплайсинга. Нами также выявлен один полиморфный вариант в экзоне (rs3738497, с.1930С А, p.Gln644Lys.) и два - в интронах (rs3738498, rs3738499) гена LEPRE1, встречающиеся как у больных, так и в контрольной группе. Интронные полиморфные варианты rs3738498 и rs3738499 встречаются во всех популяциях мира с довольно высокой частотой (около 50%), полиморфизм rs3738497 в экзоне 14 гена LEPRE1, приводящий к замене аминокислоты глицина на лизин в 644 положении белка, является редким событием, встречается с частотой 1,8% у европейцев, в популяциях азиатского происхождения его частота достигает 4,8% и не встречается в популяциях Африки [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/].
Анализ ассоциаций выявленных полиморфных вариантов генов COL1A1, COL1A2, LEPREl, PPIBl, CRTAP, SERPINHl с риском развития переломов у больных незавершенным остеогенезом
Ген COL1A1 является наиболее привлекательным кандидатным геном остеопороза, т.к коллаген 1 типа является основным белком костного матрикса. В первом интроне гена COL1A1 существует сайт узнавания для транскрипционного фактора Spl, в котором выявлен полиморфизм + 1546G T (rsl800012) [Grant et al., 1996] и два полиморфизма в промоторе -1997G T (rsl 107946) и -1663indelT (rs2412298), которые могут оказывать влияние на транскрипцию гена. Предполагают, что регуляторные сайты в промоторной области гена COL1A1 и интроне 1 могут напрямую воздействовать на скручивание ДНК. Показано, что аллель -1663delT имеет высокую аффинность к связыванию Osteorix/Nmp4/Actin белкового комплекса [Garcia-Giralt et al., 2005].
Проведено исследование трех полиморфных вариантов —1997G T (g.3011T G, rsll07946), -1663IndelT (g.3344J345delTT, rs2412298) и +1245G T (C.104-441G T (rsl800012) гена СОЫА1 у женщин из ВУР и поиск ассоциаций изученных локусов и их гаплотипов с развитием остеопоретических переломов и с уровнем МПКТ.
В целом, не обнаружено ассоциаций аллелей и генотипов изученных локусов с развитием остеопоретических переломов у женщин из ВУР, а также при рассмотрении общей выборки в зависимости от этнической принадлежности женщин (табл. 15).
Частота аллеля Г полиморфизма rsl 80012 гена СОЫА1, транскрибирующегося более активно, чем вариант G и приводящего к изменению соотношения al и а2 цепей коллагена I типа и нарушению структуры кости, была выше в группе женщин с переломами (0,152) по сравнению с группой контроля (0,132), однако, различия не достигают статистической значимости. Схожая тенденция характерна как для женщин русской этнической принадлежности, так и татарской. Сравнительный анализ распределения частот генотипов исследуемого локуса также не выявил статистически значимых различий как в общей выборке женщин, так и в зависимости от их этнического происхождения, однако наблюдается тенденция накопления гомозиготного генотипа Г Г у женщин с переломами по сравнению с контролем.
В многочисленных исследованиях обнаружена роль Spl полиморфизма гена СОЫА1 в формировании остеопоретических переломов [Grant et al., 1996; Landahl et al., 1998; Uitterlinden et al., 1998; Keen et al., 1999; McGuigan et al., 2000; Efsathiadou et al., 2001; Mann et al., 2003].
В некоторых исследованиях Spl (rs 180012) полиморфизм гена СОЫА1 был ассоциирован с переломами или уровнем МПКТ позвонков [Garcia-Giralt et al., 2002; Nguen et al, 2005; Ralston et al., 2006; Tran et al., 2009; Jin et al., 2009], но в других исследованиях таких ассоциаций не обнаружено [Lambrinoudakl et al., 2001; Lei et al., 2003].
Мы провели анализ ассоциаций полиморфизма rsl80012 с переломами различных отделов позвоночника и также не выявили значимость изученного локуса в развитии переломов у женщин из ВУР (х =0,391; р=0,532).
Частота аллеля G полиморфизма rs 1107946 гена СОЫА1 была выше по сравнению с аллелем Г как у женщин с переломами (0,817), так и без переломов (0,779), преобладая в группе с переломами во всех группах сравнения, включая женщин русской и татарской этнической принадлежности (табл. 16).
Сравнительный анализ распределения частот генотипов выявил статистически значимые различия по частоте генотипов r G (х =4,441; р=0,035) и G G (х =4,598; р=0,032) между женщинами общей группы с переломами и без переломов. Генотип r G оказался маркером пониженного риска переломов в общей выборке (OR=0,73; 95%ДИ 0,54-0,98), а генотип G G повышенного риска (OR=l,37; 95%ДИ 1,03-1,83). У женщин русской и татарской этнической принадлежности также сохраняются выявленные закономерности, однако различия не достигают статистической значимости из-за меньшей численности выборок. При рассмотрении группы переломов в зависимости от их локализации выявлена ассоциация аллеля G с развитием переломов лучевой кости у женщин из ВУР (Х2=9,958; р=0,002).
При изучении полиморфного варианта rs2412298 гена СОЫА1, известного также как -1663in/delT, обнаружено, что частота минорного варианта D выше у женщин с переломами (23,5%) по сравнению с группой контроля (21,2%), различия статистически не значимы. Схожая тенденция наблюдается у женщин татарской и русской этнической принадлежности (табл 17). Анализ частот генотипов не выявил статистически значимых различий между группами сравнения.
Полиморфные варианты -1997G/T (rsl 107946), и -ІббЗіп/delT (rs2412298), расположенные в регуляторной области гена COL1A1, впервые описаны Gareia-Giralt с соавт. (2002); авторы предположили, что полиморфизм -1997G/T оказывает значительное влияние на уровень МПКТ у испанских женщин в постменопаузе. Jin с соавт. (2011) установили, что -1997G/T, -ІббЗіп/delT, и +1245G/T полиморфные варианты гена COL1A1 влияют на уровень МПКТ путем связывания регуляторных факторов Nmp4 и Osterix, регулирующих транскрипцию гена СОЫА1.
При разделении выборки женщин в зависимости от Т-критерия на группы с остеопорозом, остеопенией и нормальными показателями обнаружена ассоциация аллеля Т полиморфизма rsl80012 гена СОЫА1 с остеопорозом в общей выборке (Х2=5,554; р=0,018; OR=l,69; 95% ДИ 1,09-2,62), и у женщин русской этнической принадлежности (х =4,685; р=0,030; OR=l,71; 95% ДИ 1,05-2,78), у татар схожая тенденция, но различия не достигают статистической значимости (табл.18). Генотип Г Г локуса rsl80012 гена СОЫА1 является маркером повышенного риска развития остеопороза у женщин из ВУР (х =4,307; р=0,038; OR=4,45; 95%ДИ 1,01-20,65).
