Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Гистоны. Гетерогенность гистонового пула - значение для процессов клеточной дифференцировки и развития организмов 7
Гистоны дрозофилы 15
Роль гистонов в организации и структурно-функциональных переходах хроматина 16
Синтез гистонов и включение в хроматин 24
Постановка проблемы и конкретных задач исследования... 28
Материалы и методі
Объекты исследования 31
Получение ядер 32
Разделение хроматина на транскрипционно-активную и неактивную фракции 33
Экстракция гистонов и приготовление гистоновых препаратов 33
Электрофоретические методы исследования гистонов 34
Определение количества гистоновых фракций 34
Авторадиографическое исследование меченных
гистоновых фракций 35
Окисление гистоновых фракций 35
Результаты и обсуждение
Идентификация субфракций гистоновых белков дрозофилы
1 Электрофоретические свойства 36
2 Формы окисления 49
3 Ацетилированные формы 51
3.1.4 Фосфорилированные формы 54
3.2 Гистоны дрозофилы при онтогенезе
3.2.1 Различия в составе гистонового пула на разных стадиях развития дрозофилы 58
3.2.2 Изменения гистонов дрозофилы в ходе ранного эмбриогенеза 67
3.3 Функциональное состояние клетки и состав гистонового набора
3.3.1 Гистоновые белки клеток культуры 67J25D при росте между двумя последовательными пассажами 75
3.3.2 Влияние экдистерона и ингибиторов клеточного метаболизма на состояние гистонов 84
3.3.3 Свойства гистонов во фракциях хроматина, различающихся по транскрипционной активности 93
3.3.4 Изменение гистоновых белков дрозофилы при тепловом шоке 94
Выводы 97
Список литературы
- Гистоны. Гетерогенность гистонового пула - значение для процессов клеточной дифференцировки и развития организмов
- Роль гистонов в организации и структурно-функциональных переходах хроматина
- Разделение хроматина на транскрипционно-активную и неактивную фракции
- Идентификация субфракций гистоновых белков дрозофилы
Введение к работе
Изучение связи между структурной организацией хроматина и его функциональной активностью является важнейшей проблемой молекулярной генетики. В этой проблеме один из нерешенных вопросов -участие гистонов в организации и поддержании специфических структур, различающихся по своей функциональной активности.
Возможным подходом при решении данного вопроса является исследование состава гистонов в связи с процессами клеточной диф-ференцировки и онтогенеза. Количественные и качественные изменения набора гистоновых субфракций выявлены в разных тканях позвоночных, установлено, что состав гистонов может изменяться в зависимости от стадии развития и в зависимости от функциональной активности ядер.
Дрозофила, являющаяся одним из излюбленных и наиболее изученных объектов генетики и имеющая при этом сложный цикл морфогенеза, весьма интересна для такого рода исследований. Однако, неизвестно, создается ли гетерогенность гистонов этого организма за счет структурных вариантов или за счет химически модифицированных форм. Существующие предположения о природе гистоновых субфракций дрозофилы сделаны по аналогии с другими объектами.
Исследование вопросов, какие именно гистоновые субфракции ..претерпевают изменения во время онтогенеза дрозофилы и с какими процессами клеточного метаболизма коррелируют эти изменения, поможет понять молекулярные механизмы дифференцировки эукариотичес-ких организмов и участие гистонов в этих механизмах. Поэтому, целью данного исследования было выявить гетерогенность гистоно-вого пула дрозофилы,-і выяснить чем вызвана эта гетерогенность и
- 5 -зависит ли она от стадий развития организма. Было интересно также выяснить, меняется ли состав гистонового пула в условиях культивирования клеток дрозофилы in vitro , и с какими процессами клеточного метаболизма связаны возможные изменения гистонов.
Проведенное нами исследование гистонов дрозофилы в различных электрофоретических системах во время всего эмбриогенеза, а также на онтогенетических стадиях личинки, куколки и имаго, не обнаружило существование у этого организма аналогов тех вариантов гистонов, которые найдены у других исследованных объектов. Н2а, Н4, HI и ДС дрозофилы имеют фосфорилированные формы, а БЗ, Н4, Н2в и Д2 - ацетилированные формы. Кроме того, Н2а, НЗ, Н2в и Д2 подвергаются окислению.
Таким образом оказалось, что выявляемая гетерогенность гистонового пула дрозофилы обусловлена разного типа модифицированием гистоновых молекул. Тем не менее, мы наблюдали изменения количества НІ и минорного гистоноподобного белка Д2 в ходе онтогенеза, и поэтому нельзя категорически утверждать, что гистоны дрозофилы не влияют на процессы клеточной дифференцировки.
Интерес вызывают также неожиданно резкие перемены уровня фосфорилирования гистонового класса 2а. На некоторых эмбриональных стадиях, а также у имаго, фосфорилированная форма Н2а составляет 50% от всех Н2а молекул, а в молодых клеточных пассажах пересеваемых клеток дрозофилы - даже 80%. В позднем эмбриогенезе и у клеточных пассажей, вышедших из логарифмической фазы роста, Н2а фосфорилированы всего на 15-20%. Такое сильное фосфорилирова-ние Н2а и такие резкие перемены уровня этой модификации не отмечены ни у одного из изученных до сих пор организмов. У млекопитающих, например, Н2а фосфорилированы всего на 15% и этот уровень
не так сильно меняется в клетках с различными функциями. Может быть, у насекомых процессы фосфорилирования и дефосфорилирования Н2а имеют большее значение для контроля состояния клетки, чем у других филогенетических групп. Интересно, что во фракциях хроматина эмбрионов дрозофилы, обогащенных транскрипционно неактивными зонами, содержание фосфорилированной формы Н2а сильно занижено по сравнению с контролем.
Возможность индуцировать новую субфракцию Н2в в условиях блокирования синтеза ДЖ и РНК, а также выявление белков ДЗ и Д4 при культивировании клеток дрозофилы in vitro указывает на то, что у дрозофилы может быть тоже существует возможновть для синтеза другого типа Н2в молекул и других минорных гистоноподоб-ных белков, которая возможно .. осуществляется только в специаль ных условиях жизни клетки.
Гистоны. Гетерогенность гистонового пула - значение для процессов клеточной дифференцировки и развития организмов
Принято под термином " гистоны " подразумевать все небольшие основные белки, которые прочно связаны с ДНК в хроматине эукариот. Это определение, однако, будет расширяться в связи с тем, что у прокариот в последнее время тоже стали обнаруживать белки с подобными свойствами. При фракционировании гистонов на основе их молекулярного веса, заряда, молекулы, гидрофильных свойств у всех эукариот ( за исключением дрожжей, у которых пока не обнаружен HI ) наблюдается пять [162] основных гистоновых фракций: одна лизин-богатая фракция ( НІ ), две умеренно лизин-богатые ( Н2а и Н2в ) и две аргинин-богатые ( НЗ и Н4 ). В ядерных эритроцитах птиц [129], пресмыкающихся и амфибий [163] найдена умеренно лизин-богатая фракция - Н5, которая частично замещает НІ. Считается, что Н5 участвует в генетической инактивации этих высокоспециализированных клеток.
Сейчас: известно, что Н2а, Н2в, НЗ и Н4 являются компонентами нуклеосомного ядра, а НІ и Н5 занимают межнуклеосомные участки хроматина.
В настоящее время аминокислотная последовательность основных гистоновых фракций определена у многих эукариот ( см. обзор[81]). Интересной закономерностью в устройстве гистоновой молекулы является ассиметрическое распределение основных аминокислот по длине полипептидной цепи белка. Ими обагащены ы - и СООН-конце-вые районы молекулы. Это свойство особенно хорошо выражено у НІ [29]. По всей вероятности, центральное гидрофобное ядро НІ участвует в сложных взаимодействиях с гистонами нуклеосомного ядра,-а положительно заряженные, вытянутые гидрофобные хвосты - с отрицательными зарядами ДНК. Относительно нуклеосомных гистонов к настоящему времени утвердилось представление, что изс СООН-полови-на занята в межбелковых взаимодействиях, а ин -хвосты, взаимодействуя с ДНК, поддерживают структуру хроматина. Некоторые результаты, однако, противоречат этой модели. Было показано, что гистоны, потерявшие свои аминоконцевые районы при гидролизе трипсином, сохранили не только способность для корректных гистон-гис-тоновых взаимодействий, но и способность укладывать ДНК в нуклео-протеиновые комплексы, близкие к "core " нуклеосомы [167]. Тогда ( ПО МНеНИЮ ЭТИХ аВТОрОВ ), биОЛОГИЧеСКИЙ СМЫСЛ NHg-KOBHeBHX хвостов не заключается в связывании ДНК. Они могли бы представлять собой места узнавания специфическими молекулами. В таком случае, их доступность к трипсину могла бы просто отражать их общую доступность для ферментов, модифицирующих гистоны: ацетилаз, мети-лаз, киназ и др.
Хотя гистоны самые консервативные белки живого мира [51,42], но все-таки их первичная структура тоже может варьировать. Для лизин-богатого класса давно известно существование субфракций ( гистоновых вариантов )[84]. После развития техники электрофореза гистонов в полиакриламидных гелях (ІШГ), содержащих неион-ше детергенты типа Тритона ХЮО ( ТХЮО ) и ДБ-16 174 , стало ясно, что гистоны Н2а, Н2в и НЗ тоже могут быть разделены на субфракции. Благодаря этому методу, были обнаружены также и минорные гистоноподобные белки хроматина [55,161,11].
В настоящее время обнаружены варианты нуклеосомных гистонов у различных филлогенетических групп: многих видов морского ежа [18], птиц [161] , млекопитающих [55], растений [135] и тетрахи-мены [12]. Данных о вариабильности нуклеосомных гистонов насеко - 9 -мых в литературе нет.
Состав и количество вариантов могут меняться в зависимости от ткани [141,161] или стадии развития организма [18,38,113], На морском еже, который оказался самым плодотворным объектом для такого рода исследований, даже показано, что не только отдельные варианты, а целые гистоновые наборы ( ранние и поздние ) замещают друг друга при развитии организма [18]. Замещения в составе гистонового пула тесно сопутствуются изменениями чувствительности к нуклеазам и длины повторяющейся структурной единицы хроматина { там же J, Поэтому авторы предполагают, что замещения гистоновых вариантов могут приводить к изменениям структуры хроматина и, таким образом, играть роль общего контролирующего процесса при развитии организмов.
Из хроматина эритроцитов цыпленка вместе с гистонами экстрагируются три минорных белка ( Щ, М2 и МЗ ), которые по-видимому присутствуют у всех поввоночных 161 . У млекопитающих обнаружено четыре таких белка [55]. По электрофоретическим свойствам, а часто и по распределению основных аминокислот по длине полипептидной цепи, минорные гистоноподобные белки похожи на гистоны. Однако, по аминокислотной последовательности и составу иногда трудно отнести их к определенному гистоновому классу [там же]
У дрозофилы два минорных белка ( ДІ и Д2 ) были обнаружены в гистоновых экстрактах [II]". Позже показано, что Д2 напоминает по аминокислотному составу Н2а и Н2в, а ДІ по этому признаку не похож ни на гистоны, ни на НМ6-белки хроматина [120] /і Многоклеточные организмы состоят из большого числа специализированных клеток.
Роль гистонов в организации и структурно-функциональных переходах хроматина
Дрозофила является одним из наиболее изученных объектов генетики, с хорошо описанным жизненным циклом. Поэтому, при исследовании гистонов дрозофилы кажется заманчивой возможность сравнивать их особенности с результатами генетических и цитологических анализов, для которых этот организм очень удобен. По мере усовершенствования методов изучения гистонов и увеличения разрешающей способности этих методов, интерес к гистонам дрозофилы постоянно возрастает.
При первых попытках электрофоретического исследования гистоны дрозофилы были экстрагированы из ДНП взрослых особей [37]. В этох гистоновых препаратах не содержался лизин-богатый гистон ( HI ) На этом основание авторы заключили, что такой гистон вообще отсутствует у дрозофилы. Позже у дрозофилы все-таки была обнаружена лизин-богатая фракция в гистоновых экстрактах из: личиночных клеток [37]. Эта фракция была растворима в Ъ% HCID4, что является характерным свойством для HI. Ее подвижность, однако, была гораздо меньше подвижности HI из тимуса теленка ( гистоны тимуса теленка хорошо охарактеризованы и часто используются в качестве эталона ). Этими же авторами были отмечены также различия электрофоретичес-ких подвижностей Н2а, Н2в и НЗ дрозофилы и тимуса теленка. Однако, впоследствии выяснилось, что эти три гистоновые фракции дрозофилы, так же как и четвертый нуклеосомный гистон - Н4, близки к соответствующим гистоновым фракциям тимуса теленка по своему аминокислотному содержанию [117].
Особенностью гистоновых препаратов из личинок дрозофилы было присутствие в них дополнительной фракции ( Lp ) с подвижностью в кислых гелях чуть выше подвижности HI. Оливер и Чекли [118], наблюдавшие эту фракцию в личинках двух видов дрозофилы - D.mela-nogaster D.virilis , решили, что она является специфическим для личинки вариантом HI, поскольку мало отличалась от НІ по подвижности и не присутствовала в имаго. По мнению других авторов, которые позже изучали гистоны трех видов дрозофилы, 1р существует только у личинок D« bydei и отсутствует yD.melanogaster и . D. virilis [79J.
У эукариот молекулы ДНК находятся в комплексе с гистоновыми и негистоновыми белками, и при этом образуется дезоксирибонуклео-протеид ( ДНП ). Из всех гистонов наибольшим сродством к ДНК обладает Н4. У остальных гистонов оно падает в следующем порядке: Н4, НЗ, Н2а, Н2в, НІ [1237. Сродство к ДНК определяется не только положительным электростатическим зарядом NHg-концевого участка гистоновой молекулы, но, возможно, даже в большей степени, кон-формацией молекулы. Так например, НІ имеет более высокий заряд, чем НЗ и Н4, но обладает меньшим сродством к ДНК [134,154].
Взаимодействие гистонов с ДНК неспецифично в отношении первичной структуры ДНК, и гистоны с одинаковой скоростью извлекаются из раствора как ДНК, так и полифоофатами [123]. Некоторые новые эксперименты показали, что HI, Н5, Н2а и Н2в предпочитают А-Т пары, а НЗ и Н4 - Г-Ц пары при связывании с ДНК. Однако, впоследствии оказалось, что если гистонам предоставляется возможность взаимодействовать между собой или с негистоновыми белками во время связывания с ДНК, то селективное предпочитание к участкам ДНК сильно уменьшается ( см. обзор этих данных в [90] ).
Несмотря на интенсивное изучение с применением широкого круга методов и подходов, пока мало известно о пространственой организации ДНП-нити. В интерфазном ядре, под электронным микроскопом 0 0 0 можно наблюдать три типа нитей: 30-40 A, IOO-IIO А и 200-300 А. Эти нити вероятно соответствуют разным уровням организации ДНП. о Принято считать, что тонкая ( 30-40 А ) нить соответствует пер о вичной нити ДНП - двойной спирали ДНК, связанной с 10-20 А слоем о белка ( элементарная ДНП-нить, нуклеофиламент ). 100-110 А нить о о считают суперспирализованной формой 30-40JA нити, а 200-300 А нить соответствует структурам более высокого порядка [7]. Кроме того, сейчас4 известно, что хроматиновая нить состоит из дискретных участков - повторяющихся структурных единиц ( порядка 200 н.п. ).
Под электронным микроскопом по длине элементарной нити ДНП наблюдаются линейно расположенные гранулы -"ню" тельца [115] или нуклеосомы [119]. Часть нуклеосомы более чувствительна к действию нуклеаз, она названа ядром или сердцевиной ( "core" ). Ядро нуклеосомы содержит 140 н.п. суперспирализованной ДНК [150,153] и по два каждого из четырех нуклеосомных гистонов [85].
Разделение хроматина на транскрипционно-активную и неактивную фракции
Гидролиз проводили ДНК-азой I ("SIGMA" ) по методу Сайга и Киношита [І44]. Приблизительные условия гидролиза были выбраны по предварительным экспериментам так, чтобы доля ДНК в растворимой фракции хроматина составляла примерно 5% ( Бакаев В.В., личное сообщение ).
Ядра, полученные из 10 г двенадцатичасовых эмбрионов суспендировали в 10 мл гидролизного буфера, содержащего 10 мМ TRIS-НС1 , рн 7,4, 3,3 мМ Mg0l2 и 0,1 мМ PMSP [144] в присутствии 5 мкг/мл ДНК-азы I и инкубировали пять минут при 38С. Реакцию останавливали, добавляя ЭДТА до 30 мМ и холодом. Растворимый хроматин и осадочную фра,кцию;- разделяли центрифугированием при 5000g в течении 20 минут и из супернатанта и осадка экстрагировали гистоны.
В каждом конкретном эксперименте брали пробу на процент перевара: 1/10 часть ядерной суспенсии и 1/10 часть растворимой фракции хроматина подвергали горячему гидролизу в присутствии 5% ТХУ. В обеих пробах определяли количество ДНК по Бартону, а потом - процент ДНК в растворимом хроматине.
Из ядер и хроматиновых фракций гистоны экстрагировали 0,4 N HoSO/t в течение ночи при -20С. Поскольку в этих условиях экстра -тировались практически все гистоны, необходимости в дополнительной экстракции не было. Экстракты центрифугировали 20 минут при 6000S для удаления ДНК и кислых ядерных белков, после чего супер-натант фильтровали через стекляный фильтр G4. I истоны осаждали ацетоном в течении нескольких часов при -20С, промывали еще два раза ацетоном, а потом высушивали в эксикаторе.
Перед работой гистоны растворяли в концентрации 10 мг/мл в бидистиллированной воде, содержащей 8 М мочевины и 10% МЭ и инкубировали даа часа при 37С. Для электрофореза при низких рН в гистоновую пробу добавляли СНдОООН до 5%, а для электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия ( ДЦС ), смешивали две части гистоновой пробы с одной частью концентрированного буфера растворения.
Одномерный электрофорез гистонов проводили либо по методу Паним и Чекли [122] в присутствии 7 М мочевины для всех стадий развития дрозофилы и 5,5 М мочевины при исследования гистонов, получаемых из культивируемых клеток, либо по Цвайдлеру [173], в присутствии 7,5 М мочевины, либо по Леммли \87].
При двумерном электрофорезе использовали следующие комбинации этих методов: первого со вторым, первого с третьим, или второго с третьим.
Количество гистоновых фракций определяли по площадям соответствующих пиков на денситограммах, снятых с одномерных элек-трофореграмм, выполненных либо по Цвайдлеру [173], либо по Леммли [87], либо при электрофорезе в длинных гелях при низком рН [117]. Для определения количества Д2 в некоторых случаях был при -менен двуступенчатый электрофорез fl4l]. При этом гистоновый материал подвергали электрофорезу в пластине полиакриламидного геля по Паним и Чекли [І22І, из слегка подкрашенного гелн вырезали фракцию НЗ и переносили на пластину геля для электрофореза по Цвайдлеру [173], где полоса Д2 очищалась от сопутствующих НЗ и Н2а фракций.
Определяемое количество гистоновых фракций относили к количеству Н4, Н2а или тотальному количеству нуклеосомных гистонов ( которые в отдельных случаях эксперимента служили в качестве ко-эфициента, уравнивающего наносимое на гель количество материала ).
Полученные результаты обрабатывали статистически. После электрофореза меченных гистонов двумерные гели высуши вали спиртом и с них снимали авторадиографические отпечатки на рентгеновской пленке ( "0RW 0" )
Идентификация субфракций гистоновых белков дрозофилы
Пересеваемые культуры дрозофилы дают возможность для изучения в более чистом виде причин, вызывающих изменения гистонового набора. С другой стороны, наше знание относительно поведения клеток в культуре далеко не полное. Поэтому, исследования, проводимые на пересеваемых in vitro клетках интересны и для изучения данной культуры.
Пересеваемая клеточная линия 67а 25D [З] ведет свое начало из клеток двенадцатичасовых эмбрионов D. melanogaster . Первоначальная клеточная линия 67 25 после того, как разделилась на две сублинии ( 67а 25А и 67а 25D ) была потеряна. Обе сублинии имеют женский кариотип. Генерационное время сублиний около 24 часа при 25С, однако, как показала практика нашей лаборатории, это время иногда может варьировать между отдельными пассажами. Для проведения исследований, нами была выбрана линия 67 2 , поскольку клетки этой линии на 80-909 диплоидные [147].
Переходя в культуру, клетки эмбрионов сохраняют многие из своих свойств. Так например, было показано, что в культуре сохраняется не только способность синтеза некоторых ферментов, но и последовательность их возникновения [44]. Вместе с этим, пересеваемые in vitro клетки имеют и некоторые особенности. Их S-фаза клеточного цикла ( 10 часов ), например, во много раз длиннее s-фазы эмбриональных клеток [46], хотя скорость движения репликативной вилки при репликации ДНК у эмбрионов и культураль-ных клеток одинакова [24]. Кроме того, в клетках культуры, в отличие от эмбрионов, обнаружена гетерохроматиновая ДНК J 147].
Ядра пересеваемой линии 67 25D содержат все пять гистоно-вых классов в стандартных соотношениях, а так же и ДІ и Д2, как видно на рисунке 24. На этом рисунке представлена картина, получаемая при электрофорезе гистонов, изолированных из клеток на восьмой день после посева. Соотношение между Н2а субфракциями и уровень Д2 соответствуют этим параметрам 5-12-часовых эмбрионов. Когда, однако, мы стали брать клетки для исследования в различные моменты роста между двумя последовательными пассажами, стало ясно, что так же как в онтогенезе, в клетках культуры наблюдается изменение гистоновых субфракций. Соотношение между Н2а субфракциями и уровень Д2 такие же, как на рис. 24, если клетки брать для исследования с б-70Г0 по 12й день после посева. На рис. 13, например, представлен гель двумерного электрофореза гистонов, изолированных на 12 день роста клеточного пассажа. На более ранних моментах после пересева ( 4й день ) соотношение между Н2а субфракциями равняется 1:1, а на еще более ранних ( 3й день ), это соотношение равняется 4:1 ( рис. 25 и рис. 26А ), т.е с ростом клеток пассажа в них, в целом, уменьшается доля фосфорилированной Н2а формы. Такой высокий уровень фосфорилиро-вания Н2а ( 80% ), какой наблюдается на ранних сроках пассажа
Момент перехода клеток к состоянию, при котором доминирует немодифицированная форма Н2а незафиксирован четко и, видимо, зависит от активности роста культуры. В более активно растущих клеточных пассажах этот переход может происходить на один-два дня позже, по сравнению с менее интенсивно растущими пассажами.
С какими свойствами культуральных клеток связано это огромное изменение в соотношении между Н2а субфракциями трудно судить. Интересно, однако, отметить, что именно на 3-4 день роста кле ток этой же линии, резко падает включение радиоактивного уридина в них [2]. При сопоставлении этого наблюдения с нашими результатами, кажется вероятным, что падение тотального синтеза РНК клетками пассажа в целом связано с переходом от одной степени фосфо-рилирования Н2а к другой.
Количество Д2 тоже меняется слабо с ростом клеток после пересева ( рис. 27 ). Правда, при измерении количества Д2 в культуре, мы не всегда получали хорошую повторяемость результатов, что наверное можно объяснить разнородностью культуры.
С ростом клеток 67325D наблюдаются и другие изменения гистонов. У молодых клеток НЗ ацетилированы в весьма высокой степени, так что моноацетилированная форма и немодифицированная форма НЗ представлены в почти одинаковых количествах ( рис. 25 ). Диацетилированная форма НЗ тоже хорошо видна и даже намечаются следы триацетилированной формы. У этих клеток хорошо видна и одна форма модифицирования Н4. Это наверное ацетилированный Н4, поскольку Н4 дрозофилы очень слабо фосфорилированы ( см. т. 3.1.3) У стареющих клеток ( 12й день после пересева ) только намечаются следы ацетилированных НЗ и Н4 ( рис. 12 А ). Снижение уровня ацетилирования гистонов с выходом из логарифмической Фазы раста, вероятно, является общей закономерностью всех клеточных линий дрозофилы, поскольку было отмечено нами и у клеточной линии 79f4DV3g ( D.virilis ), полученной в лабораторний I ( рис. 28 ).
