Введение к работе
Актуальность проблемы. Автономные генетические элементы выделяют по признаку наличия собственной ДНК, репликация которой частично независима от репликации клеточного генома. Сравнительно небольшие размеры и высокий уровень изменчивости геномов автономных генетических элементов делают их чувствительным маркёром микроэволюционных процессов. Все эукариотические клетки содержат митохондрии и репликационно компетентные семейства транспозонов, а многие виды ещё и внутриклеточные бактерии. Изменчивость ядерного генома, вызываемая автономными генетическими элементами, связана с процессами рекомбинации, ретротранспозиции и горизонтального переноса ДНК. Эти события ведут к увеличению размеров и сложности эукариотических геномов. Другой, не менее важной особенностью изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами, является её направленность. Как было впервые показано СМ. Гершензоном, наличие ДНК в цитоплазме является мутагенным фактором, вызывающим определённый спектр мутаций, обычно нестабильных и часто ревертирующих к норме. Мутации, вносимые транспозонами, так же носят направленный характер определяемый специфичностью ферментов интеграции. Так как разные виды имеют разные наборы функционально активных транспозонов, а мутации, вносимые ими, многократно и независимо повторяются, то вероятность фиксации этих мутаций в популяциях возрастает. Из этих фактов следует, что автономные генетические элементы имеют существенное значение в определении сценария эволюционного преобразования вида.
Изучение структурной и функциональной изменчивости, вносимой в геном ретротранспозонами, остается актуальной проблемой современной генетики.
Выделение функционально-активного семейства ретротранспозонов из генома любого вида организмов существенно расширяет возможности дальнейшего изучения генетики этого вида и его возможного биотехнологического применения. Задача эта, однако, не проста, так как большинство копий ретротранспозонов в геноме дефектны и либо вовсе не способны к перемещению, либо могут перемещаться только в присутствии ретротранспозона-помощника. В данной работе представлено выделение, клонирование и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов Tvl из генома Drosophila.virilis. Применённый метод может быть использован для выделения и характеристики функционально-активных семейств ретротранспозонов из других видов животных.
В работе представлена молекулярно-генетическая характеристика экспрессии Tvl и применение гипервариабельных последовательностей Tvl в качестве селективно нейтральных маркёров для характеристики популяционной структуры природных популяций дрозофил группы virilis и в качестве маркёров сайтов инсерций митохондриальных псевдогенов.
Определена нуклеотидная последовательность митохондриального генома Drosophila.littoralis и на этой основе проведено изучение межвидовой,
внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости митохондриального генома природных популяций дрозофил группы virilis. Группа virilis состоит из одиннадцати широко распространённых видов дрозофил, обитающих в Евразии и Северной Америке. Предполагаемое время дивергенции предковых форм D.virilis и D.melanogaster оценивается в 40 миллионов лет.
Начиная с классических исследований (Patterson & Stone, 1952), данная группа активно изучается как модельный объект микроэволюции и видообразования. Изучение дрозофил группы virilis в России имеет давнюю историю. Первые исследования систематики и экологии D.lummei и D.littoralis проведены Н.Н. Соколовым. (Соколов, 1948). Интерес к исследованию популяционно-генетических и микроэволюционных процессов в группе virilis сохраняется и в настоящее время. Одно из перспективных направлений в этой области - связь микроэволюционных процессов с активностью ретротранспозонов. Дрозофилы группы virilis - удобный модельный объект для сравнительного исследования популяционной структуры природных и синантропных видов.
В настоящее время все больше видов вовлекается во взаимодействие с человеком, возникают синантропные расы, изменяется генетическая структура популяций. Изучение закономерностей в ответе на эти изменения со стороны наиболее лабильной части генома, представленной ретротранспозонами и другими автономными генетическими элементами, представляет несомненный интерес.
Цель работы. Изучить структуру и популяционную динамику изменчивости, связанную с полуавтономными генетическими элементами дрозофил.
Задачи исследования
Разработать метод выделения функционально-активных семейств ретротранспозонов и выделить функционально-активные семейства ретротранспозонов D.virilis.
Определить нуклеотидную последовательность митохондриального генома одного из видов группы virilis (D.littoralis).
Охарактеризовать межвидовую изменчивость митохондриальной ДНК у дрозофил группы virilis по трем признакам: Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) тотальной мтДНК, изменчивость фрагмента гена 16S рРНК, изменчивость фрагмента гена coxl .
Изучить особенности внутривидового полиморфизма мтДНК в группе virilis у четырех видов дрозофил: D.littoralis, D.americana, D.virilis, и D.montana.
5. Исследовать внутрипопуляционную структуру и динамику
митохондриальной изменчивости в локальной, чётко ограниченной, природной
популяции D.littoralis (пос. Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении
нескольких лет. Для этого провести анализ сопряженности митохондриальных
гаплотипов с полиморфным ядерным ДНК-маркером для выявления расовой
структуры популяции.
6. Получить новую пересеваемую клеточную линию дрозофилы, инфицированную внутриклеточными бактериями Wolbachia для изучения горизонтального переноса ДНК между клеткой дрозофилы и бактерией.
Научная новизна работы Разработан метод выделения функционально-активных ретротранспозонов и этим методом впервые выделено и охарактеризовано функционально-активное семейство ретротранспозонов D.virilis - Tvl.
Предложен простой метод электронно-микроскопической идентификации вирусоподобных частиц ретротранспозонов.
Впервые показана трансактивация синтеза вирусоподобных частиц Tvl в клеточной культуре.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома D.littoralis.
Впервые проведен многолетний анализ динамики митохондриальных маркеров в локальной природной популяции D.littoralis. Обнаружено устойчивое соотношение мт-гаплотипов. Анализ сопряженности несцепленных ядерных и митохондриальных маркеров в выборке из природной популяции D.littoralis позволил выявить скрытую расовую структуру, способствующую поддержанию генетической гетерогенности и стабильности популяционного генофонда.
На основе анализа изменчивости митохондриальной ДНК в группе virilis получен ряд новых данных, позволивших уточнить филогенетическую структуру группы virilis. В частности, показано единство митохондриального генофонда двух подвидов D.americana; а также получено подтверждение разделения вида D.littoralis на два подвида: D.littoralis littoralis и D.littoralis imeretensis.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанный метод выделения функционально-активных
ретротранспозонов может быть применён для оценки геномной стабильности клеточных культур животных по наличию/отсутствию и количеству вирусоподобных частиц эндогенных ретротранспозонов.
Описание и анализ полного митохондриального генома D.littoralis даёт новые данные для изучения эволюции митохондриального генома дрозофилы.
Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике популяций, разрабатываемые на дрозофиле как модельном объекте, и закладывают основы для дальнейшего изучения динамики митохондриальных генофондов насекомых. Полученные результаты важны для исследований в области охраны и мониторинга популяций редких и исчезающих видов, а также рационального использования эксплуатируемых популяций. Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАН и РАСХН, таких как Институт общей генетики РАН, Институт молекулярной биологии РАН, Институт биологии развития РАН, Институт биологии гена РАН, Институт комплексного освоения природных ресурсов РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и
разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства РАСХН. Положения выносимые на защиту
Клетки дрозофил содержат вирусоподобные частицы одного или нескольких семейств эндогенных ретровирусов и/или ретротранспозонов. Клонирование нуклеиновых кислот из клеточной фракции вирусоподобных частиц позволяет клонировать функционально-активные семейства ретротранспозонов данного вида.
Суперинфекция вирусоподобными частицами клеток пересеваемой культуры может приводить к временной индукции синтеза вирусоподобных частиц ретротранспозонов клетки.
3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность
митохондриального генома D.littoralis и выявлены области, изменчивость
которых специфична для группы virilis.
4. В условиях клеточной пересеваемой культуры ускоряется перенос
митохондриальной ДНК в ядро с образованием новых митохондриальных
псевдогенов.
Структура митохондриальной изменчивости природных и синантропных видов насекомых существенно различается. Локальные популяции синантропных видов мономорфны, тогда как у видов, образующих природные популяции, митохондриальная изменчивость образована совокупностью нескольких митохондриальных гаплотипов, находящихся в равновесии.
Анализ сопряжённости несцепленных митохондриальных и ядерных ДНК маркёров в локальных, частично изолированных популяциях позволяет выявить криптические расы, обитающие симпатрически.
В пересеваемых клеточных линиях дрозофилы возможна персистенция внутриклеточных бактерий Wolbachia pipientis.
Апробация результатов диссертации
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
International Conference «Molecular Phylogenetics" (MolPhy-2) Moscow, May 18-21, 2010;
51th Annual Drosophila Research Conference. Washington, DC.April 7-11. 2010;
IV съезда ВОГиС. Москва 21-22 июня. 2009;
Международная научно-практическая конференция
Актуальные проблемы биоэкологи. 21-24 октября 2008;
XX International Congress of Genetics Berlin, Germany, 2008;
48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 2007;
47th Annual Drosophila Research Conference, Houston, Texas, 2006;
19th European Drosophila Research Conference, Eger, Hungary, 2005;
46th Annual Drosophila Research Conference, San Diego, USA, 2005;
III съезда ВОГиС, 2004;
45th Annual Drosophila Research Conference, Washington, USA, 2004. Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 статей в российских и международных рецензируемых журналах,
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 515 ссылок. Работа проиллюстрирована 14 таблицами и 67 рисунками.
