Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1. Молекулярные механизмы старения 10
1 1 Роль соматических мутаций 11
1.2 Митохондриальная теория старения и роль окислительного стресса 11
1.3 Накопление измененных белков 16
1.4. Нарушения метаболизма Сахаров 20
1.5 Метилирование ДНК и старение 21
1.6 Репарация ДНК и старение 23
1.1 Утрата теломер и старение 25
1.8 Апоптоз и продолжительность жизни 27
2. Изменение основных характеристик рибосомных генов млекопитающих при старении 30
2.1 Структурно-функциональная организация рибосомных генов 30
2.2 Основные характеристики комплекса рибосомных генов и их варьирование в различных возрастных группах млекопитающих 33
2.2.1 Число копий рибосомных повторов в геноме человека 34
2.2.2 Изменение числа копий рДНК при старении 35
2.3 Активные копии рибосомных генов в геноме человека 36
2.3.1 Селективная окраска ядрышкообразующих районов метафазных хромосом 36
2.3.2 Изменение активности рибосомных генов при старении 39
Материалы и методы 42
1. Анализируемая выборка 42
2. Выделение ДНК из периферической крови, клеточной массы и среды культивирования фибробластов 42
3. Определение концентрации ДНК 42
4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома человека в яДНК и в вкДНК 43
5. Определение относительного количества активных РГ (АкРГ) 44
6. Исследование репликативного старения и действия хромата калия на культивируемые фибробласты 45
7. Количественная оценка гена 18S рРНК методом real-time ПЦР 47
9. Статистическая обработка результатов 49
Результаты и обсуждение 50
1. Свойства комплекса РГ людей среднего и старшего возраста 50
1.1 Число копий РГ в геноме 50
1.2 Анализ содержания трех контрольных повторяющихся последовательностей генома человека в группе СВ и ГС 52
1.2.1 Теломерный повтор 52
1.2.2 Гистоновые гены 54
1.2.3 Сателлит 3 (lql2) 55
1.3 Относительные количества активных копий РГ 57
1.4 Изменение количества метилированных копий РГ при старении 59
2. Влияние свойств комплекса РГ на решшкативное старение 60
2.1 Основные характеристики штаммов фибробластов кожи человека 60
2.1.1 Свойства комплекса РГ 62
2.1.2 Маркеры репликативного старения 63
2.1.3 Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения 67
3. Изменения свойств комплекса РГ при репликативном старении 67
3.1 Изменение содержания контрольных повторов (ТП и СатШ) 68
3.2 Изменение содержания РП и уровня метилирования РП 69
3.3 Повреждение ДНК рибосомных генов при репликативном старении 71
4. Влияние свойств комплекса РГ на функционирование культивируемых фибробластов кожи в условиях окислительного стресса, вызываемого хроматом калия 74
4.1 «Ранний» ответ фибробластов на действие «малых» доз К2Сг04 75
4.1.1 Изменение количества клеточной РНК 75
4.1.2 Изменение активности ядрышка 77
4.1.3 Изменения уровня апоптоза 79
4.2 «Поздний» ответ фибробластов на действие хромата калия 81
5. Влияние количества АкРГ в геноме на нуклеазную активность клеток 86
5.1 Уровень нуклеазной активности в штаммах фибробластов при стандартных условиях культивирования 87
5.2 Изменения НА клеток при действии малых доз хромата калия 89
5.3 Изменение НА в процессе апоптоза клеток («поздний» ответ на действие К2СЮ4) 90
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 93
ВЫВОДЫ 101
Список литературы 102
4
- Митохондриальная теория старения и роль окислительного стресса
- Основные характеристики комплекса рибосомных генов и их варьирование в различных возрастных группах млекопитающих
- Определение относительного количества активных РГ (АкРГ)
- Изменение количества клеточной РНК
Введение к работе
уровнем окислительного стресса, который рассматривают в качестве основной причины старения, и свойствами комплекса РГ.
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась (1) в
оценке возможного влияния свойств комплекса РГ человека на
продолжительность жизни и (2) в анализе изменения свойств комплекса РГ при
старении организма (естественное старение) и культивируемых клеток человека
(репликативное .старение). Были сформулированы следующие
экспериментальные задачи:
сравнить свойства комплекса РГ (число копий, количество АкРГ и уровень метилирования) в выборке людей 80 лет и старше и в выборке лиц молодого и среднего возраста;
исследовать изменение свойств комплекса РГ при репликативном старении 5 штаммов фибробластов кожи доноров различного возраста, геномы которых значительно различаются по свойствам комплекса РГ;
исследовать взаимосвязь свойств комплекса РГ и маркеров старения для 5 штаммов фибробластов кожи человека;
изучить влияние свойств комплекса РГ культивируемых фибробластов на устойчивость клеток к апоптозу, индуцируемому окислительным стрессом.
Научная новизна. Впервые показано, что количество АкРГ у людей, достигших 80-летнего возраста, варьирует в пределах достаточно узкой «адаптивной» нормы. Впервые найдено объяснение противоречивым результатам относительно снижения числа копий и изменения уровня метилирования РГ при старении: обнаружено, что при старении происходит потеря высокометилированных кластеров неактивных РГ, если таковые присутствовали в геноме. Впервые показано, что свойства комплекса РГ не влияют на нормальное репликативное старение культивируемых фибробластов, но влияют на устойчивость клеток к апоптозу, который индуцируется дополнительным окислительным стрессом. Впервые обнаружено, что клетки с
большим количеством АкРГ характеризуются значительно более высоким уровнем эндонуклеазной активности.
Научно-практическая значимость работы. Данные о распределении количества АкРГ в геномах старых людей могут помочь при составлении прогнозов длительности жизни и риска развития патологии, индуцируемой окислительным стрессом, у различных групп населения. Данные о влиянии количества АкРГ в геноме клетки на изменения уровня апоптоза при действии повреждающих факторов внешней среды могут оказаться полезными при разработке схем клеточной терапии. Описана схема анализа ряда маркеров, которые позволяют прогнозировать различия в длительности пролиферативного периода и в уровне спонтанного апоптоза нескольких культур клеток уже на ранних пассажах, что также может иметь значение для клеточных технологий .
Положения, выносимые на защиту.
В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ. Комплекс РГ старых людей практически не содержит высокометилированных кластеров «молчащих» рибосомных копий.
При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека геном теряет высокометилированные кластеры копий РГ. При репликативном старении происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении данных real-time ПЦР.
Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения (содержание теломерного повтора и уровень спонтанного апоптоза) не зависят от свойств комплекса РГ и от возраста доноров кожи.
При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме.
(5) Уровень эндонуклеазной активности в лизатах (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях индуцированного окислительного стресса положительно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клеток.
Митохондриальная теория старения и роль окислительного стресса
В настоящее время эта теория является одной из наиболее плодотворных и быстро развивающихся. Впервые она была практически одновременно выдвинута в 1956 г. Харманом [Harman D., 1994] и в 1958 г. Н.М. Эмануэлем (Эмануэль, 1975; Emanuel, 1985) [Анисимов В.Н., 2003]. За прошедшие с того времени годы было выяснено, что дефекты в митохондриях являются причиной большого числа дегенеративных болезней, старения и рака [Wallace D.C., 1999]. Исследования пациентов с этими болезнями показали, что в генетике митохондрий существует большое количество сложностей, которые возникают из-за взаимодействий между мутациями в митохондриальных и ядерных геномах. Однако патофизиология митохондриальных болезней все еще не ясна. В последние годы для объяснения митохондриальной патологии предложено множество новых механизмов, которые основываются на существенной роли митохондриального окислительного фосфорилирования при накоплении энергии в клетке, производстве активных форм кислорода и инициирования апоптоза.
Кислород, необходимый для жизни организмов, может косвенно быть ответственным за отрицательные эффекты, которые возникают из-за производства свободных радикалов. К свободным радикалам, которые являются ядовитыми для клеток, относятся супероксидные анионы, гидроксильные радикалы, пероксильные радикалы, перекись водорода, гидропероксиды и пероксинитритные анионы [Bonnefoy М. et al., 2002]. Свободные радикалы ответственны за повреждение клеток, в первую очередь -клеточных мембран, которые особенно богаты ненасыщенными жирными кислотами, чувствительными к реакциям окисления. ДНК также является целью атаки со стороны свободных радикалов кислорода.
Известно, что митохондриальная ДНК (mtDNA), не защищенная в отличие от ядерной ДНК гистонами или другими ДНК-специфичными белками, непрерывно подвергается воздействию АФК и других свободных радикалов, присутствующих в матриксе митохондрий [Wei Y.H., 1998]. Таким образом, окислительные модификации и мутации в mtDNA происходят чаще, чем в ядерной ДНК, и степень таких изменений в mtDNA возрастает с возрастом по экспоненте. Параллельно в митохондриях происходит перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков, что продуцирует еще большее количество АФК и далее увеличивает количество мутаций и окислительного повреждения mtDNA в процессе старения. Дыхательные ферменты, содержащие дефектную субъединицу белка, которая кодируется в mtDNA, нарушают электронную транспортную функцию и таким образом увеличивают утечку электронов и производство АФК, что в свою очередь повышает окислительный стресс и окислительное повреждение митохондрий. Этот так называемый «порочный цикл» работает в клетках различных тканей с различной скоростью и приводит к разной скорости накопления окислительно модифицированных и мутантных mtDNAs. Этим может быть объяснен тот факт, что в различных органах и тканях в процессе старения человека функциональные и структурные изменения происходят с различной скоростью.
Митохондриальная теория старения постулирует, что старение вызывается реакциями свободных радикалов, которые индуцируются окружающей средой [Harman D., 1992]. В круг вопросов, затрагиваемых этой теорией, входят: 1) исследование происхождения жизни и развития организма, 2) исследование воздействия радиации на живые существа, 3) исследование эндогенных реакций свободных радикалов, 4) возможность объяснения процесса старения, и 5) исследования (число которых в настоящее время интенсивно увеличивается), рассматривающие свободные радикальные реакции при патогенезе определенных заболеваний.
Выяснено, что митохондриальная продукция свободных радикалов в постмитотических тканях отрицательно коррелирует с продолжительностью жизни у животных [Barja G., 2002]. Это подтверждается тем фактом, что у животных с большей продолжительностью жизни уровень окислительных повреждений в митохондриальной ДНК (mtDNA) меньше, чем у животных с меньшей продолжительностью жизни, тогда как такое соотношение не наблюдается в случае с ядерной ДНК. Ограничение калорийности питания, которое уменьшает скорость старения, также уменьшает производство в митохондриях свободных радикалов и уровень окислительных повреждений митохондриальной ДНК.
В настоящее время исследователи различают несколько основных механизмов запрограммированной смерти митохондриона (митоптоз), клетки (апоптоз) и организма (феноптоз) [Skulachev V.P., 1999]. Предполагается, что митоптоз участвует в некоторых типах апоптоза, тогда как апоптоз может быть частью каскадного феноптоза.
Были проведены исследования по определению уровня повреждения ДНК в естественных условиях. Показано, что в печени крысы повреждения составляют 1/130000 оснований в ядерной ДНК и 1/8000 оснований в митохондриальной ДНК [Ames B.N., 1989]. При этом, несомненно, огромное значение имеет система защиты от свободных радикалов и ферменты, обеспечивающие ее.
Основные характеристики комплекса рибосомных генов и их варьирование в различных возрастных группах млекопитающих
Во всех организмах реализация генетической информации, заключенной в ДНК, в конкретные белковые структуры происходит на клеточных органеллах -рибосомах. Рибосомы катализируют трансляцию молекул мРНК в белки. Тип синтезируемого рибосомой белка в каждом синтетическом цикле диктуется мРНК, с которой рибосома оказалась связанной. Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле, состоят из малых (40S) и больших (60S) субчастиц. Малые субчастицы содержат 1 молекулу РНК (18S) размером 1900 нуклеотидов и 30-35 белков; большие - 3 цепи РНК длиной 120 (5S), 160 (5,8S) и -5000 (28S) нуклеотидов и 45-50 белков. Число рибосом в клетке колеблется от 20 000 до 50 000 в зависимости от активности синтеза белка данной клеткой. Такие количества рибосом могут образоваться лишь в том случае, если клетка содержит множественные копии генов, кодирующих рибосомную РНК (гены рРНК).
В геномах большинства эукариотических организмов (в том числе и у человека) кластеры генов 5S рРНК и трех других рРНК располагаются в разных, не связанных между собой участках генома. 18S, 28S и 5,8S молекулы рРНК человека транскрибируются в виде единой молекулы предшественника -45S рРНК в результате работы фермента РНК-полимеразы I. Гены трех рибосомных РНК (18S, 28S и 5,8S) организованы у большинства организмов в виде тандемных рибосомных повторов (РП), при этом транскрибируемые области чередуются с нетранскрибируемыми участками (спейсерами). В клетках человека содержится около 400 копий РП на диплоидный геном, причем эти копии распределяются кластерами в пяти парах акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21 и 22). Районы акроцентрических хромосом, содержащие РП, называют ядрышкообразующими районами (ЛОР).
Одна копия рибосомного повтора человека (РП) содержит 42998 пар оснований. Первичная последовательность РП человека полностью определена в 1995 году [Kuo В.А. et al., 1996]. В структуре РП выделяют транскрибируемую область (длина 13369 пар оснований) и нетранскрибируемый межгенный спейсер (NTS). Кодирующие области генов 18S, 5,8S и 28S рРНК эукариот сгруппированы в указанном порядке в одну транскрипционную единицу. Все три РШС образуются из длинного транскрипта — предшественника в результате процессинга, включающего расщепление РНК эндонуклеазами и метилирование. Транскрибируемая область (полная транскрипционная единица) содержит два некодирующих спейсера (называемых внутренними транскрибируемыми спейсерами, ITS), которые разделяют три кодирующие области, а также имеет некодирующие участки перед первым геном 18S рРНК и за последним геном 28S рРНК (эти участки называются внешними транскрибируемыми спейсерами, ETS) (см. схему на рис. 1). При созревании (процессинге) молекул рибосомной РНК транскрибируемые спейсеры удаляются [Long Е.О., Dawid LB., 1980].
В клетке рибосомные гены локализованы в особом структурном домене ядра, который называют ядрышком. По данным электронной микроскопии в ядрышке выделяют три структурные составляющие: фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент и гранулярный компонент. Современная модель ядрышка предполагает, что фибриллярный центр образован ЯОР акроцентрических хромосом [Goessens G. et al. 1979; Goessens G., 1984] и окружен плотным фибриллярным компонентом, через который в некоторых местах проходят полости, содержащие конденсированный хроматин, контактирующий с фибриллярным центром [Goessens G., 1979; Thiry М. et al., 1986]. Фибриллярный центр варьируют в числе и размерах в зависимости от активности клетки. Ядрышки нестимулированных лимфоцитов человека содержат один большой фибриллярный центр сферической формы [Hozak P. et al., 1989; Wachtler F. et al., 1980]. При стимуляции клетки к делению наблюдается увеличение количества фибриллярного центра и увеличение их суммарной площади. Синтез новых молекул 45S рРНК происходит в плотном фибриллярном компоненте, процессинг и частичная сборка рибосом - в гранулярном компоненте ядрышка [Fakan S., 1986; Hozak P. et al., 1994; Mosgoeller W. et al., 1998; Schofer С et al., 1993; Wachtler F. et al., 1992]. Далее рибосомы транспортируются в цитоплазму для осуществления процесса трансляции.
В геномах эукариот не все копии РП активны в отношении синтеза рРНК. Как правило, число реально транскрибируемых копий РП в соматической клетке не превышает 30-50% от общего числа копий РП [De Bernardin W. et al., 1986; Evans H.J.et al., 1974].
Определение относительного количества активных РГ (АкРГ)
Общее содержание РГ в геноме человека определяют в опытах по дот-гибридизации геномной ДНК с меченными зондами на рДНК, при этом фиксируют количества зонда, необходимые для «насыщения» иммобилизованной на мембране ДНК, либо исследуют кинетику гибридизации [Birnstiel M.L. et al., 1972]. Впервые данные о числе рибосомных повторов (560 копий, культивируемые клетки Неіа) в диплоидном геноме человека получены в 1970 г [Attardi G. et al., 1970]. Бросс и Крон [Brass К., Krone W., 1972; Bross К., Krone W., 1973; Bross К. et al., 1973; Dittes H. et al., 1975], используя pPHK-зонды, меченные изотопом трития, впервые обнаружили, что число копий рДНК в геномах нескольких здоровых индивидов варьирует от 390 до 460. Похожие данные (296-508 копий) получены в опытах по гибридизации ДНК с рРНК, модифицированной диметилсульфатом, который включал атом трития или изотоп углерода-14 [Gaubatz J.W. et al., 1975; Gaubatz J.W. et al., 1976]. В тоже время другие авторы, используя РНК-зонды, меченные изотопом иод-125 [Cote B.D. et al., 1980], обнаружили значительно меньшее содержание рДНК в геноме - 68-80 копий (плацента человека). Столь же низкое содержание (120-144 копии) тестировали позднее в опытах по гибридизации рДНК-зондов, меченных в реакции ДНК-полимеразы на рРНК матрице в присутствии меченных изотопом фосфор-32 трифосфатов [Young B.D. et al., 1976]. Такие существенные различия в содержании геномной рДНК вызваны, по-видимому, различиями в методиках выделения ДНК из биологических объектов. Позднее было установлено, что в комплексе с рДНК присутствуют прочносвязанные белки, которые снижают выход рДНК в водную фазу при стандартной процедуре экстракции ДНК органическими растворителями [Вейко Н.Н. и соавтр., 1998]. Учет этого обстоятельства и развитие методов гибридизации и клонирования позволило провести более точное определение числа копий рДНК для больших выборок индивидов. В 2003 г был предложен вариант метода насыщающей гибридизации [Вейко Н.Н. и соавтр., 2003] с использованием нерадиоактивно меченных рДНК-зондов. В плазмиду, содержащую фрагменты рДНК, вводили с помощью фотоактивированных арилазидов в качестве маркерной молекулы биотин. Молекула биотина обладает повышенным сродством к белкам авидину или стрептавидину. После гибридизации биотинилированный зонд выявляли с помощью конъюгата стрепавидин-щєлочная фосфатаза и последующей ферментативной реакции. В геномах 33 здоровых доноров число копий РГ, определенное с помощью этого метода варьировало от 250 до 607.
Изменение числа копий рДНК при старении Данные об изменении общего числа копий рибосомных повторов при старении организма и культивируемых клеток достаточно противоречивы. В цикле работ Стрехлера и соавт. [Strehler B.L., 1978; Strehler B.L. et al., 1979a; Strehler B.L. et al., 1979b] приводятся результаты определения содержания рДНК в различных клетках мозга и сердечной мышцы в образцах ткани, полученных от людей разного возраста. Авторы обнаружили существенное снижение числа копий рДНК в старшей возрастной группе индивидов. Изменение количества рибосомных повторов в группе долгожителей наблюдали также в клетках печени и мозга человека и мыши другие авторы [Gaubatz J.W. et al., 1976]. Было также показано, что содержание рДНК в мозге молодых мышей было на 36% выше, чем в печени. С возрастом количество РГ в клетках мозга мышей не изменялось, а в клетках печени увеличивалось. Содержание рДНК в тканях человека имело тенденцию к увеличению в старшей возрастной группе. Выводы об изменении числа копий РГ в геноме человека с возрастом были сделаны на основании анализа групп индивидов разных возрастов (второй подход, см. выше). Т.к. группы были немногочисленны, то нельзя исключить, что полученный результат - следствие высокой индивидуальной вариабельности количества РГ в геноме.Кроме того, разница в определении содержания рДНК может быть вызвана различной степенью экстракции рДНК из старых и молодых тканей (см.выше). Позднее на двух более гомогенных моделях: инбредная линия мышей и культивируемые фибробласты кожи человека было показано, что содержание рДНК при старении мышей и при увеличении числа пассажей культуры фибробластов (репликативное старение) остается практически неизменным [Peterson C.R. et al., 1984]. Количество копий рДНК не изменялось при репликативном старении культивируемых эмбриональных фибробластов крысы [Goodpasture С. et al., 1975], фибробластов кожи здоровых доноров и доноров с синдромом преждевременного старения (синдром Вернера) [Long Е.О. et al., 1980].
Недавно появились интересные данные, объясняющие старение клеток дрожжей накоплением внехромосомных кольцевых молекул рДНК [Schofer С. et al., 1993]. Сразу же были предприняты усилия по обнаружению аналогичного явления для клеток человека [Machwe A. et al., 2000]. Анализ изменений длин фрагментов рДНК при репликативном старении клеток, однако, не дал положительного результата. Очевидно, при старении клеток высших эукариот действуют иные механизмы регуляции активности рибосомных генов.
В одной из последних работ [Zafiropoulos A. et al, 2005] авторы количественно определили число копий 5.8S, 28S и 18S рДНК в клетках жировой ткани 120 индивидов разных возрастных групп (от 9 до 94 лет), используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в количественном варианте. Была обнаружена достоверная отрицательная корреляция числа копий 5.8S и 28S рДНК и возраста доноров. При этом содержание 18S рДНК, несмотря на индивидуальную вариабельность, не коррелировало с возрастом индивида. Авторы объясняют полученный результат процессами рекомбинации, которые при старении организма неодинаково протекают в случае отдельных генов рРНК. Однако эти данные можно объяснить и тем, что при старении происходит повреждение 28S рДНК, которое приводит к снижению выхода в реакции ПЦР. Большее повреждение этого фрагмента рДНК, чем 18S рДНК, может быть вызвано гораздо более высоким содержанием гуаниновых оснований, которые легко модифицируются активными формами кислорода.
Изменение количества клеточной РНК
Эксперимент проводили сотрудники лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН. Препараты метафазных хромосом окрашивали азотнокислым серебром (Ag-окраска) по методу [Ляпунова Н.А. и соавтр., 2001]. Размер каждого AgЯOP оценивали визуально в условных единицах от 0 до 4. Общее количество активных копий рДНК в ядре (АкРГ) выражали как суммарный размер десяти AgHOP. 6. Исследование репликативного старения и действия хромата калия на культивируемые фибробласты
Культивируемые линии фибробластов были получены из образцов кожи доноров сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН Т.Д. Смирновой и Л.А. Каменевой. Клетки культивировали в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37С в условиях насыщающей влажности в атмосфере 3-5% ССЬ. Клетки (1/3 от общего количества) пересевали примерно 1 раз в три дня, далее культивировали до субконфлуентного состояния и вновь пересевали.
Схема эксперимента по исследованию действия хромата калия. В
лунки 24-луночного планшета («Nunc») вносили 30-50 тыс. клеток, культивировали 3 суток до образования монослоя (100-200 тыс. клеток). Добавляли в среду 4 или б мкМ КоСг04 и инкубировали 4 часа (клетки снимали, ранний ответ на стресс) и 24 часа. Заменяли среду и культивировали клетки в течение 72 часов. Для каждой концентрации К2СЮ4 и в контрольных вариантах через определенные интервалы времени анализировали клетки с трех-шести лунок планшета.
Анализ конформации ядрышка. Селективная окраска фиксированных ядер лимфоцитов азотнокислым серебром проводилась сотрудником лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН Н.А. Еголиной. Для анализа использовали микроскоп Axioplan и цифровую камеру RETIGA 2000R («IMAGING», Канада). Изображения анализировали с использованием компьютерной программы анализа изображений («ИнтерЭВМ», Москва). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь не менее чем в 150 интерфазных ядрах.
Определение концентрации РНК. Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически на люминесцентном спектрометре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), Явозб=487 нм, сфлу=524 нм. К 2 мл раствора красителя (в разведении 1:2000, буфер ТЕ (0, 01 М Tris НС1, рН 7,5; 0,001 М ЭДТА)) добавляли 5 мкл раствора ДНК и измеряли флуоресценцию в течение 1 минуты. Стандартная относительная ошибка определения составляет 5%.
Определение ферментативной активности каспазы 3. Активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах клеток. К клеткам добавляли лизирующий буферный раствор (20 ммоль/л Hepes, рН 7,5, 10 ммоль/л КС1, 1,5 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л дитиотрейтол, 1 ммоль/л PMSF) и пять раз замораживали при -70С с последующим быстрым размораживанием при 37С. Смесь центрифугировали при 2700 g и супернатант отбирали. К 20 мкл лизата добавляли 100 мкл буферного раствора, содержащего 50 гаМ Hepes, рН 7,5; 10% сахарозы; 1 тМ дитиотрейтола; 0,1% CHAPS и 25 мкл флуоресцирующего красителя QAc-DEVD-AFC (7-amino-4rifluoromethylcoumarin, N-CBZ-L-aspartil-L-glutamyl-L-valyl-L-aspartic acid amide), Х,возб=400 нм, флу=490 нм. Реакцию проводили при ЗЗоС в течение 1 часа. Активность каспазы 3 выражали в расчете на единицу ДНК.
Определение нуклеазной активности. Количественный анализ эндонуклеазной активности в белковых лизатах клеток проводился методом, разработанным в лаборатории Молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН, с использованием модельного субстрата - комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5 -конце флуоресцентную группу, а на 3 -конце тушитель флуоресценции. К клеткам добавляли лизирующий буферный раствор (20 ммоль/л Hepes, рН 7,5, 10 ммоль/л КС1, 1,5 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л дитиотрейтол, 1 ммоль/л PMSF) и пять раз замораживали при -70С с последующим быстрым размораживанием при 37С. Смесь центрифугировали при 2700 g и супернатант удаляли. К 20 мкл лизата добавляли 100 мкл буферного раствора, содержащего 10 ммоль/л Hepes, рН 7,5, 20 ммоль/л MgCl2, 5 ммоль/л СаС12, 3 пикомоль/мкл ДНК фага М13 и 2,5 пикомоль/мкл комплементарного ей олигонуклеотида R6G АСС ССС AGC GAT TAT CCA AGC GCG BHQ1, включающего флуоресцирующее основание (R6G, 5(6)-карбоксиродамин) и молекулу тушителя (BHQ1, «Синтол», Москва). Реакцию проводили 1 час при 37С. При гидролизе эндонуклеазами целостность молекулы олигонуклеотида нарушается, что приводит к разгоранию флуоресценции R6G. Основным ферментом, детектируемым в используемых условиях, является ДНКаза 1. Спектры флуоресценции анализировали с помощью люминесцентного спектрометра LS 55 («PerkinElmer», Англия), А,возб=524 нм, флу=558 нм. Для калибровки реакции использовали стандартный раствор ДНКазы 1.
