Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 13
2. Обзор литературы 17
2.1. Патогенез В-клеточных. лимфатических опухолей 17
2.1.1. Общая характеристика генетических повреждений при лимфомах 18
2.2. Ремоделирование генов Ig: перестройка генов иммуноглобулинов, соматическая гипермутация и сдвиг изотипа в норме 22
2.2.1. Перестройка генов иммуноглобулинов 22
2.2.2. Соматическая гипермутация и события в терминальном центре 26
2.2.3. Сдвиг изотипа 29
2.3. Хромосомные транслокации с участием локусов иммуноглобулинов 31
2.3.1. Хромосомные транслокации, возникающие в процессе V(D)J рекомбинации 33
2.3.2. Хромосомные транслокации, возникающие во время сдвига изотипа 36
2.3.3. Значение соматической гипермутации в лимфомагенезе: хромосомные транслокации и мутации генов вне локусов Ig 39
2.4. Оценка степени зрелости клеток-предшественниц В-клеточных лимфом путем анализа ремоделирования генов иммуноглобулинов 43
2.5. Роль антигенной селекции при В-клеточных лимфомах, Антигенная стимуляция и селекция 49
2.6. Патогенез отдельных видов лимфом 52
2.6.1. Лимфома из клеток мантийной зоны (ЛМЗ) 53
2.6.2. Хронический лимфолейкоз 56
2.6.3. Лимфомы из клеток центра фолликула 68
2.6.3.1 .Центрофолликулярная лимфома 68
2.6.3.2. Лимфома Беркитта 73
2.6.3.3. В-крупноклеточная лимфома (В-ККЛ) 78
2.б.4.Лимфоплазмацитоидная лимфома 83
2.6.5. Зрелоклеточные лимфомы, возникающие из клеток памяти 84
3 Материалы и методы 89
3.1. Экспериментальные методики 89
3.1.1. Рекомбинантные космидные клонотеки 89
3.1.1.1. Фонотека ICRF С108 DH5L4/FS13 89
3.1.1.2. IGiOHOTCKaLANLBNCOl 90
3.1.2. КлонотекаРАС и ее гибридизационый скрининг 90
3.1.3. Создание субклонотеки из отдельных фрагментов отобранных клонов РАС 91
3.1.4. Рестрикционный анализ ДНК иСаузерн -блоттинг 92
3.1.5. Приготовление радиоактивно меченых ДНК-зондов 92
3.1.6. Гибридизация панелей космидных клонов и РАС-клонов 93
3.1.7. Нозерн-блоттинг 94
3.1.8. Радиоавтография 94
3.1.9. ПЦР-анализ 94
3.1.10. Выделение космидной, плазмидной ДНК, а также ДНК РАС-клонов из клеток Е. coli и выделение ДНК из клеток дрожжей 96
3.1.11. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 96
3.1.12. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 96
3.1.13. Клонирование фрагментов ДНК 97
3.1.14. Трансформация клеток Е.соІІ и дрожжей 97
3.1.15. Определение нуклеотидных последовательностей
плазмид и ПЦР-продуктов 98
3.1.16. Экспрессионная кДНК библиотека для дрожжевой
двугибридной системы 98
3.2. Реагенты и оборудование 99
3.2.1. Среды, условия хранения и культивирования бактерий 99
3.2.2. Ферментные препараты 99
3.2.3. Другие реактивы и расходные материалы 100
3.3. Программы для компьютерного анализа 100
4. Результаты 105
4 Л. Пояснения к выбору стратегий поиска генов, принимающих участие в процессе образования опухолей у человека 105
4.2. Поиск гена-супрессора опухолевого роста, расположенного в районе 13ql4.3 107
4.2.1. Поиск минимального участка хромосомы 13, утрачиваемого у пациентовс В-ХЛЛ 107
4.2.2. Первичная характеристика генов DLEUI и DLEU2, расположенных в составе минимального утрачиваемого участка хромосомы 13 108
4.2.3. Построение космидного контига между 8Т8-маркерамиШЗЭ1168 HD13S25 хромосомы 13 человека 111
4.2.4. Составление транскрипционной карты участка между STS-маркерами D13S1168 HD13S25 хромосомы 13 человека 115
4.2.5. Картирование повторяющихся последовательностей и анализ их распределения в составе референтной нуклеотидной последовательности 117
4.2.6. Получение клонов, содержащих участки геномной ДНК мыши, соответствующие участку, утрачиваемому у больных В-ХЛЛ 122
4.2.7. Сравнительный геномный анализ нуклеотидных последовательностей гомологичных участков ДНК мыши и человека.. 126
4.2.8. Анализ генов RFP2, KCNRG, C130RF1 и FAM10A4 - потенциальных онкосупрессоров, обнаруженных в результате построения транскрипционной карты участка генома, утрачиваемого у больных В-ХЛЛ 132
4.2.8.1. Ген RFP2 133
4.2.8.2. Ген KCNRG 136
4.2.8.3. Ген С130RF1 140
4.2.8.4. Ген FAM10A 142
4.3. Структура гена-онкосупрессора ING1 и описание его ближайших гомологов 144
4.4. Структура гена-онкосупрессора СКАР2 151
4.5. In silico скрининг последовательностей нуклеотидов генома человека, специфически экспресснрующихся в опухолях 153
4.5.1. Пилотный эксперимент 155
4.5.2. Результаты полномасштабного сопоставления спектров экспрессии нормальных и опухолевых клеток 161
5. Выводы 175
Благодарности 178
6. Список литературы 179
- Хромосомные транслокации, возникающие в процессе V(D)J рекомбинации
- Зрелоклеточные лимфомы, возникающие из клеток памяти
- Выделение космидной, плазмидной ДНК, а также ДНК РАС-клонов из клеток Е. coli и выделение ДНК из клеток дрожжей
- Картирование повторяющихся последовательностей и анализ их распределения в составе референтной нуклеотидной последовательности
Введение к работе
Актуальность исследования
В настоящее время онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности в развитых странах. Эти заболевания представляют собой большую проблему как медицинского, так и социального характера. Поэтому исследования в области онкологии представляют собой громадный пласт медико-биологических исследований. Получение новой информации о нарушениях структур и функций при опухолеобразовании одновременно развивает наши представления о фундаментальной биологической проблеме границ нормы - нормы структуры и функции на молекулярно-генетическом, клеточном, тканевом и организменном уровне.
Первопричиной опухолеобразования является изменение структуры или регуляции генома соматических клеток и последующее изменение функционирования их генома. Структурно-функциональные исследования генома человека в последние годы перешли на качественно более высокий уровень в результате реализации программы «Геном человека». Созданы принципиально новые технологии- исследования геномов, которые, в сочетании с современными концепциями генетики, позволяют значительно углубить наше понимание молекулярно-генетических основ опухолеобразования, понять роль областей генома и генов человека критически важных для предотвращения образования опухолей. В результате таких фундаментальных исследований могут быть разработаны новые методы обнаружения онкопатологий, что особенно важно на начальных стадиях развития опухоли, когда еще возможно лечение без серьезного ущерба для организма. Поэтому исследования особенностей структуры и функционирования областей генома, часто повреждаемых при возникновении и развитии опухолей, высоко актуальны.
Цели исследования
Гены, контролирующие поддержание нормальной структуры и функции генома, клеточное деление и межклеточные взаимодействия необходимы, в частности, и для подавления развития опухолей. Поэтому такие гены были названы генами супрессорами опухолевого роста. Перестройки участков генома соматических человека могут приводить к утрате или к дефектам генов супрессоров опухолевого роста и возникновению соответсвующей патологии. Участок 13ql4 генома человека часто оказывается поврежденным при различных онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других.
Основной целью диссертационной работы было структурно-функциональное исследование области 13ql4 генома человека и выявление связи этих особенностей с опухолеобразованием. Главный акцент был сделан на поиске и характеристике потенциальных генов супрессоров опухолей в этой области генома человека. Кроме того, исследовали также тонкую структуру и полиморфизм двух ранее известных генов хромосомы 13, вовлеченных в развитие опухолей.
Другим феноменом, сопряженным с опухолеобразованием, является изменение пормалыюго уровня экспрессии генов, структура которых может оставаться при этом неизменой. Целью диссертационной работы в данном направлении являлось выявление генов человека, маркирующих процесс опухолеобразования изменением уровня своей экспрессии.
Задачи исследования.
-
Выявление у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ) перестроек хромосомы 13. в области 13ql4; физическое картирование границ выявленных перестроек хромосомы; выявление минимального общего района, повреждаемого у пациентов В-ХЛЛ
-
Установление последовательности нуклеотидов между маркерами D13S810 - D13S1469 области 13ql4; биоинформатический анализ данной последовательности нуклеотидов; выявление и исследование распределения в этой области повторов всех известных для человека типов; предсказание и эксперименталная проверка наличия в этой области транскрибируемых участков (генов), интрон-экзогаюй структуры этих транскриптов (в том числе альтернативно сплайсируемых форм), характеристика регуляторных участков и белок-кодирующих областей выявленных генов.
3) Предсказание возможных функций продуктов выявленных генов путем биоинформатического поиска генов паралогов с ранее установленной функцией, а также паралогов для отдельных предсказанных доменов в белках, кодируемых выявленными генами.
4) Экспериментальное и биоинформатическое иследование областей
генома мыши, синтенных области 13ql4 генома человека.
Установление тонкой структуры и сравнительный анализ генов
ортологов в исследуемых областях генома.
-
Установление интрон-экзонной структуры и характеристика полиморфизма двух генов хромосомы 13 человека (СКАР2 и ING1), вовлеченных в развитие опухолей.
-
Биоинформатический поиск генов человека, маркирующих существование опухоли изменением уровня своей экспрессии. Анализ структуры этих генов и их возможной функции, в нормальпых и опухолевых тканях.
Научная новизна.
Построен космидный контиг размером 620 т.п.н., перекрывающий
участок 13ql4.3 генома, человека. Выявлен минимальный общий
участок, утрачиваемый в составе указанной хромосомы у больных В-
ХЛЛ. Впервые собрана референтная нуклеотидная последовательность
между STS маркерами D13S810 и D13S1469 общей длиной около 2
млн.н.п., перекрывающая исследуемую область нестабильности
хромосомы 13 у больных В-ХЛЛ. Впервые выявлены
биоинформатически и подтверждены экспериментально
транскрибирующиеся участки в составе исследованного 2 млн.п.н. участка хромосомы 13. В составе этого участка выявлен сегмент, в котором повышенна плотность Alu-повторов, особено наиболее молодого из известных подсемейств повторов этого типа, AluY. Впервые выдвинуто- предположение, что данная структурная особенность области 13ql4 (высокая концетрация Alu повторов, особенно повторов AluY) может являться причиной повышенной нестабильности данного района, возникающей в результате неравпого кроссинговера и приводящей к перестройкам при ряде опухолевых заболеваний человека.
Впервые методами компьютерного анализа проведена характеристика структуры и функции генов, картированных в составе фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами D13S810 и D13S1469. Проведено, сравнительное исследование участков генома мыши, синтенных району 13ql4 генома человека, и выявлены наиболее вероятные кандидаты на роль генов супрессоров опухолеобразования. Впервые экспериментально описаны изоформы мРНК генов человека DLEU1, DLEU2, RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1 и установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Функциональная характеристика этих генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в. развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка RFP2 выявлены десять потенциальных партнеров по взаимодействию. Впервые описана экзон-интронная структура и изоформы мРНК генов ING1 и СКАР2 вовлеченных в процесс опухолеобразования. Создана программа HSAnalyst, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов и выявить гены человека, маркирующие своей повышенной экспрессией опухолевые ткани.
Практическая значимость работы. В области 13ql4 картированы рекомбинантные космиды, которые используются в клинической цитогенетике на ДНК пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек в этой области генома человека. Полученные данные о тонкой структуре генов RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1, ING1 и СКАР2 позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с перестройками хромосомы 13. Найден ряд генов человека, повышенная экспрессия которых маркирует процесс образования и/или прогрессии опухоли. В результате создана панель новых потенциальных маркеров опухолей человека, тестрование которых доступно на основе единого, чувствительного, быстрого и дешевого метода ПЦР, что имеет большое значение, как для научных исследований, так и для диагностики опухолей в клинике.
Основные положения выносимые на защиту:
-
Выявлен минимальный общий участок, утрачиваемый в составе хромосомы 13 у больных В-ХЛЛ, и построен космидный контиг размером 620 т.п.н., перекрывающий участок указанный участок.
-
Впервые собрана референтная нуклеотидная последовательность между STS маркерами D13S810 и D13S1469 общей длиной около 2 млн.н.п., перекрывающая исследуемую область 13 у больных В-ХЛЛ.
-
Впервые выявлены биоинформатически и подтверждены экспериментально транскрибирующиеся участки в составе исследованного 2 млн.п.н. участка хромосомы 13.
-
Повышенная плотность Alu-повторов может являться причиной нестабильности района 13ql4.3, приводящей к перестройкам при ряде опухолевых заболеваний человека.
-
Впервые методами компьютерного анализа и сравнительной геномики построена транскрипционная карта фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами D13S810 и D13SH69.
-
Впервые экспериментально описаны изоформы мРНК и проведена первичная функциональная характеристика генов человека DLEU1, DLEU2, RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1 и установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов.
-
Впервые описана экзои-интронная структура и изоформы мРНК генов ING1 и СКАР2 вовлеченных в процесс опухолеобразования.
-
Создана программа HSAnalyst, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов и выявить гены человека, маркирующие своей повышенной экспрессией опухолевые ткани.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были апробированы на межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен РАН им. Н.И.Вавилова (2001 и 2004 гг.), а также в виде 5 устных докладов и более 80 стендовых сообщений, представленных на 13 конференциях (5 всероссийских, 8 международных). В том числе: на годовых итоговых конференциях ФЦНТП «Геном человека» 1998, 1999 и 2000 гг.; II (IV) российском съезде медицинских генетиков, Курск, 17-19 мая, 2000 г.; на 2-м Съезде Московского Общества Генетиков «Современные Проблемы Генетики», 14-19 февраля 2003 года; на ежегодных съездах Human Genome Organization (HUGO) в 1999, 2000, 2001, 2002 и 2003 гг.; на Летней Исследовательской Конференции FASEB "Hematological malignancies- 2003" (Вермонт, США), на съезде RECOMB2002, 18-21 (Rockwill, Maryland, USA), на 52-ом ежегодном съезде Американского Общества Генетиков Человека (American Society of Human Genetics) в Балтиморе, США.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, методические разработки вошли в учебник «Методы вирусологии», издательство МГУ, 2002.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов с обсуждениями, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.
Хромосомные транслокации, возникающие в процессе V(D)J рекомбинации
К У(Ц).Г-зависимым транслокациям относятся t(ll;14) при лимфоме из клеток мантии, t(14;18) при центрофолликулярной лимфоме [Tsujimoto Y, et al., 1988], t(l;14) с участием гена bcl-9 при лимфобластной лимфоме [Willis TG et al., 1998], t(l;14) с участием гена bcl-10 при MALT-лимфомах [Willis TG et al., 1999; Zhang Q et al., 1999], а также несколько транслокаций, типичных для Т-клеточных лимфом.
Указанные транслокации возникают в процессе V(D)J-рекомбинации, о чем свидетельствуют несколько признаков. Во-первых, разрывы в локусе иммуноглобулинов, как правило, располагаются в непосредственной близости от RSS на 5 -конце объединенного D-JH сегмента (когда фрагмент между D и JH-генами уже удален) или на 5 -конце JH-сегмента (если рекомбинация так и не произошла) (Рис. 5). Значительно реже фрагмент хромосомы 18 оказывается присоединен к фрагменту хромосомы 14 перед полностью перестроенным VH-D-JH регионом. Таким образом, транслокация t(14;18) чаще всего происходит после того как RAG 1/2 разрезали RSS сигналы в двух местах и образовались два тупых конца со шпильками. Фрагмент хромосомы 18 может присоединиться к фрагменту хромосомы 14 в области JH сегмента во время неполной перестройки или в области D сегмента во время полной перестройки. Исходную последовательность этих участков 14 и 18 хромосом для сравнения легко получить из нелимфоидных клеток пациента (соскоб из слизистой рта). При сравнении исходных последовательностей с местами слияния 14 и 18 хромосом обращают на себя внимание утрата части концевых нуклеотидов и появление новых нуклеотидов, которых исходно нет ни на 14, ни на 18 хромосоме (N-нуклеотиды, добавляемые ферментом TdT, см выше). Отщепление части нуклеотидов и добавление N-нуклеотидов типично для V(D)J-рекомбинации. Таким образом, причиной возникновения разрывов в локусах иммуноглобулинов являются ошибки У(Е))т-рекомбиназного комплекса [Marculescu R et al., 2002]. Транслокации во время V(D)J-рекомбинации нельзя считать сбалансированными, поскольку в ходе этих трансклокаций часто происходит утрата фрагмента ДНК, лежащего между соединяемыми D и JH или VH и D-JH сегментами.
Гораздо меньше ясности в том, почему при транслокациях возникают разрывы партнерских хромосом не содержащих генов иммуноглобулинов, например хромосомы 18. Ни RSS, ни последовательностей, хотя бы отдаленно их напоминающих, поблизости от онкогенов, участвующих в транслокациях, в партнерских хромосомах, как правило, не находят. В коллекциях транслокаций t(14;18) можно найти немало случаев, когда на конце партнерской хромосомы выявляется дупликации нуклеотидов, что совершенно не похоже на У(Е )Д-рекомбинацию. В соответствии с гипотезой Wyatt [Wyatt RT et al., 1992], в областях частых разрывов транслокаций t(14;18) и t(ll;14), имеются chi-подобные последовательности. Исходно, сЫ-подобные последовательности были описаны как горячие точки рекомбинации у Е. coll. В незрелых лимфоцитах человека идентифицирован некий белок с молекулярным весом 45 кДа, который может связываться с этими последовательностями [Jaeger U et al., 1994; Jaeger U et al., 1993] и способствовать возникновению разрывов ДНК. Кроме того, было показано, что ферменты RAG1 и RAG2 могут работать как транспозазы [Agrawal A. et al., 1998; Hiom К et al., 1998]. Транспозазы вырезают фрагмент ДНК, расположенный между двумя распознаваемыми ими специфическими последовательностями и вставляют его в другое место, также между некими специфическими последовательностями. Транспозазная активность RAG в основном проявлеттся по отношению к GC-богатым участкам ДНК и шпилькам [Tsai C.L. et al., 2003]. Анализ разрывов и характера соединения хромосом показывает, что оба механизма — и chi-подобный и транспозазный, вполне объясняют возникновение транслокаций.
До сих речь шла о V(D) J-зависимых транслокациях, возникающих на ранних этапах созревания лимфоцитов в костном мозге, поскольку V(D)J рекомбинация имеет место именно в этом тканевом компартменте. Тем не менее, целый ряд данных указывает на то, что транслокации типа BCL2/JgH могут проходить и в лимфоцитах терминального центра. Так, de Jong и соавторы исследовали группу фолликулярных лимфом, не экспрессирующих поверхностный В-клеточный рецептор [de Jong D. et al., 1994]. Они обнаружили несколько случаев лимфом с транслокациями, затрагивающими одну из копий IgH и отсутствием каких либо V(D)J перестроек в составе второй копии. Поскольку выживаемость В-клеток критически зависит от наличия работоспособного BCR, это означает, что V(D)J рекомбинация успешно прошла лишь в одной копии, не затронув вторую, В-клетка созрела, покинула костный мозг и контактировала с антигеном, а транслокация произошла в ГЦ в том же локусе, который был перестроен. Jager и соавторы обратили внимание на то, что в некоторых случаях транслокации BCL2/D-JH в D-сегменте содержатся мутации, наличие которых указывает на соматическую гипермутацию [Jager U. et al., 2000]. Наконец, сама по себе возможность повторной V(D)J-nepecTpoUKH в герминальных центрах уже доказана [Papavasiliou F et al., 1997; Meffre E et al., 1998; Han S. et al., 1997]: при неблагоприятном стечении обстоятельств, приводящем к повреждению В-клеточного рецептора и утрате аффинности к антигену, В-клетки ГЦ могут повторно проделывать УфУ-рекомбинацию, чтобы избежать уничтожения (этот процесс называется ревизией рецептора).
Зрелоклеточные лимфомы, возникающие из клеток памяти
К этой категории опухолей отностится обширная группа лимфом из клеток маргинальной зоны, а также волосатоклеточный лейкоз. ДНК, выделенная из этих опухолей содержит мутации вариабельного региона генов иммуноглобулинов. Лимфомам этой группы свойственны три особенности: выраженный тканевой тропизм, указания на зависимость от антигенной стимуляции и сравнительно благоприятный прогноз. Первый феномен объясним: клетки памяти «запоминают» не только антиген, но и место встречи с ним. Экстранодальные лимфомы маргинальной зоны длительно персистируют in situ, то есть остаются в пределах органа первой презентации. Так, например, поражение костного мозга при экстранодальных лимфомах маргинальной зоны выявляется достаточно редко [Zucca Е. et al., 2003]. Указания на зависимость от антигенной стимуляцией особенно четки для мальтом (MALT-опухолей) желудка, развивающихся на фоне персистирующей инфекции Helicobacter pylori, мальтом щитовидной железы на фоне тиреоидита Хашимото и мальтом слюнной железы на фоне болезни/синдрома Шегрена [Isaacson PG., 1999; Hashimoto Т. et al., 2001]. Наконец, относительно благоприятный (по сравнению с другими лимфатическими опухолями) прогноз может быть связан со значительной продолжительностью жизни клеток памяти, являющихся клетками-предшественниками опухолей данного типа, и их медленным обновлением.
В качестве примера зрелоклеточньгх лимфом из клеток памяти в рамках этого обзора будут подробно описаны только лимфомы из лимфоцитов слизистых оболочек (мальтомы, от слова MALT, mucosaassociated lymphoma tissue). Они представляют собой экстранодальные лимфомы маргинальной зоны - отдельная нозологическая группа, возникающая из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми (MALT), Эти лимфомы характеризуются специфическими патогенетическими, гистологическими и клиническими признаками [Thieblemont С. et al., 2003; Isaacson PC, 1999]. Мальтомы могут возникать практически в любом органе, однако чаще они развиваются в желудке, слюнных железах и щитовидной железе, то есть в органах, в которых лимфоидная ткань появляется только в результате хронического персистирующего воспаления. Лимфомагенное воспаление может развиться в ответ на инфекцию (геликобактерный гастрит) или как следствие персистирующего аутоиммунного процесса (миоэпителиальный сиалоаденит или тиреоидит Хашимото). Аномальный клон лимфоцитов возникает на фоне персистирующей реактивной пролиферации; со временем этот клон замещает нормальную В-клеточную популяцию органа и образует мальтому. Показано, что мальтомы желудка могут регрессировать после антибактериальной терапии по поводу Н. pylori. [Fischbach W. et al., 2004; Nakamura T. et al., 2003].
В 30-50% случаев зрелоклеточных MALT-лимфом выявляется транслокация t(n;18)(q21;q21) [Maes В. et al., 2000; Baens M. et al., 2000]. Эта транслокация весьма специфична, поскольу она не выявляется ни при каких других вариантах лимфом, в том числе она отсутсвует в первичных В-крупноклеточных лимфомах желудка и в случаях MALT-лимфом с полями крупных клеток. Эта транслокация приводит к образованию и экспрессии химерного продукта слияния генов API2 и MLT. Ген API2 располагается на хромосоме 11 и кодирует белок, принадлежащий к семейству ингибиторов апоптоза IAP [Maes В. et al., 2000]. Взаимодействуя с TNF-ассоциированными факторами (TRAF) белки семейства IAP ингибируют активацию каспаз [Rothe М., et al., 1995], и, тем самым, оказывают противоапоптозное действие. Разрывы группируются в двух участках гена API2, чаще в интроне между экзонами 7 и 8. В химерном продукте транслокации три домена BIR, необходимые для подавления апоптоза всегда сохранены, домен CARD может быть утрачен, a RING домен практически всегда отсутствует. Ген MLT расположен на хромосоме 18. Функция этого гена пока не известна. Белок MLT содержит два иммуноглобулино-подобных домена С2-типа, участок, очень похожий на фрагмент ламинина 5 3 & и, наконец, домен, похожий на последовательность цепи иммуноглобулина VDJ4 у мыши [Dierlamm J. et al., 1999]. Экспрессия гена MLT хорошо выражена в мононуклеарах периферической крови, слабее в костном мозге, тимусе и лимфоузлах. Кроме того, этот ген сильно экспрессируется в Т-клетках и миелоидных клеточных линиях. Места разрывов гена MLT не имеют четкой группировки, поэтому длины фрагментов гена MLT, сохраняющихся в результате транслокации, весьма варьируют [Baens М. et al., 2000].
Описанная выше транслокация t(ll;18) чаще встречается в опухолях с более агрессивным течением. Так, в случаях, когда опухолевая инфильтрация ограничена только стенкой желудка, она выявляется только в 10% случаев. Напротив, в метастазах, расположенных вне желудка, она обнаруживается в 78% случаев [11]. По данным ряда авторов, после уничтожения Н. pylori с помощью антибиотиков при наличии этой транслокации ремиссия не возможна [12]. Таким образом, транслокация t(ll;18) - ценный маркер, помогающий правильно выбрать терапию у больных мальтомами.
Другой, нечастой, но специфичной для MALT-лимфом транслокацией является t(l;14)(p22;q32), затрагивающая ген BCL10, также описанный под названиями hE10, CLAP и CIPER [Zhang Q.et al., 1999; Willis TG et al., 1999]. Ген BCLIO кодирует, в частности, домен CARD, давший название одноименному семейству белков. Кроме домена CARD, белок В CL10 также содержит пролин-обогащенный домен. Оба домена принимают участие в активации прокаспазы-9. Последствия транслокации t(l;14)(p22;q32) и роль белка BCL10 в процессе развития мальтом изучены недостаточно. В норме ВCL10 вызывает активацию транскрипционного фактора NF-кВ, С одной стороны обладающего противоапоптозным действием и содействующего пролиферации клеток, но, с другой стороны, в определенных ситуациях способного активировать каспазу-9 [Willis TGetal., 1999].
Выделение космидной, плазмидной ДНК, а также ДНК РАС-клонов из клеток Е. coli и выделение ДНК из клеток дрожжей
Выделение космидной и плазмидной ДНК из Е. coli проводили щелочным методом [Sambrook et al., 1989]. В отдельных случаях выделение плазмидной и космидной ДНК и ДНК дрожжей производилось при помощи соответствующих наборов фирмы "QIAGEN" и «Promega" (США) в соответствии с инструкциями производителей. Электрофорез рестрикционных фрагментов ДНК проводили в горизонтальном 0.5 - 1% агарозном геле, который помещали в кювету стандартной конструкции. В качестве электрофорезного буфера использовался 1х трис-ацетатный (ТАЕ) буфер. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 20 - 150 В. Фракционирование проводили до момента достижения маркерным красителем конца пластины геля. Фотографировали гель в УФ-свете через красный светофильтр на контрастную пленку «Микрат-300» или «Мнкрат-Изопан». Элюцию фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили в соответствии с методикой [Weislander, 1979]. В отдельных случаях выделение фрагментов ДНК для последующего клонирования проводили с помощью набора QIUAEX II (QUAGEN, США), в условиях, рекомендованных изготовителем. Выделенные и очищенные фрагменты ДНК лигировали с дефосфорилированной ДНК векторов pUC18, pGBT9, pGFP, pBlueScnpt в условиях, рекомендованных изготовителем ферментного препарата. Использование при клонировании дефосфорилированной ДНК вектора свело к минимуму фон нерекомбинантных молекул среди полученных трансформантов. Вектор pGEM использовали в сочетании с Easy Vector System (Promega, USA), вектор pCR.2.1 использовали в сочетании с набором для клонирования ТОРА-ТА (Invitrogen, Carlsbad, С А) по протоколам производителя.
Для получения компетентных клеток использовали штамм E.coli DHSaMCR и модификацию метода Ханаана, описанную Александером [Alexander, D.C. et ah, 1984]. Приготовленные компетентные клетки обеспечивали эффективность трансформации порядка 5x107 - 1x108 на 1 мкг плазмиды pBR322. Для проведения трансформации к 200 мкл компетентных клеток добавляли плазмидную ДНК, смесь выдерживали во льду в течение 30 минут. Затем добавляли 4 мл среды 2xYT, клетки подращивали в течение 70-90 мин при 37оС. Затем подросшие клетки осторожно осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, ресуспендировали в 50-100 мкл среды 2xYT и распределяли по поверхности бактериологических чашек со средой LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. В отдельных случаях использовали готовые компетентные клетки ТОРЮ (Invitrogen, Carlsbad, СА) и протокол производителя. Дрожжевые компетентные клетки готовилия непосредственно перед трансформацией, используяли метод, представленный в описании набора MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 ("Clontech", USA).
Двунаправленное секвенирование всех плазмид и ПЦР клонов с векторных или ген-специфических праймеров было осуществлено с помощью метода флуроресцентных терминаторов (Big Dye Terminator, Perkin-Elmer-ABI) с последующим фракционированием на автоматическом ДНК секвенаторе Applied Biosystems 310 (РЕ Biosystems). С целью обнаружить кДНК, кодирующую белковый продукт, способный к взаимодействию с белком RFP2, мы использовали экспрессионную кДНК клонотеку фирмы "Clontech", созданную на основе мРНК из клеточной линии эритробластоидного лейкоза человека К562 (Ншпап Erythroleukemia MATCHMAKER cDNA К-562 cell Line; ATCC #CCL243; каталожный номер HL4032AH). Данная библиотека создана на базе вектора рАСТ2 и содержит 3.0 106 независимых клонов. Средняя длина вставки 1.3 т.п.н. кДНК была синтезирована с использованием олиго-dT праймера.
При работе с клетками Е. coli были использованы среды LB (Luria-Bertani) [Maniatis et al, 1982] и 2xYT [Sambrook et al., 1989]. Клетки E. coli выращивали при температуре 37oC в течение ночи. Штаммы Е. coli с рекомбинантными космидами и плазмидами сохраняли при -70оС в жидкой среде 2xYT с криопротектором (30% глицерин) и канамицином (30 мкг/л) [Maniatis et al, 1982]. Для выращивания дрожжей были использованы среды YPD и SD. Штамм дрожжей Y153 сохраняли при -700С в жидкой среде SD, YPD с криопротектором (30% глицерин). Штаммы дрожжей выращивали при температуре ЗООС в течение 2-3 дней. В работе использовали рестрикционные эндонуклеазы, ДНК лигазу Т4, протеиназу К, полинуклеотидкиназу фага Т4, фрагмент Кленова ДНК полимеразы I, термостабильную Taq-полимеразу, обратную транскриптазу MMLV-RT полученную от фирм «Бион-М», Москва; Promega, США; "Boehringer Mannheim Biochemicals", Германия, в условиях, рекомендованных изготовителем.
Картирование повторяющихся последовательностей и анализ их распределения в составе референтной нуклеотидной последовательности
Правый конец исследуемой референтной последовательности нуклеотидов (интервал GCT16C05 - D13S25, соответствует ВАС-клону АС005948) экстремально-беден как Alu-повторами, так и транскрибирующимися участками. Только 4,1% общей длины последнего интервала соответствуют повторам Alu. Одновременно с этим обращает на себя внимание тот факт, что повторы типа LINE (L1 и L2) представлены и в Alu-бедных, так и в Alu-богатых интервалах примерно с одинаковой частотой.
С этой точки зрения весьма интересно, что исследуемый нами хромосомный район, расположенный между маркерами D13S1168 -D13S25 и характеризующийся резким переходом содержания Alu-повторов от высокой плотности к низкой, расположен на границе цитогенетически различимых полос 13ql4.3 и 13q21.1. Примерно в том же хромосомном районе проходит граница перехода синтении хромосомы 13 человека с хромосомами 14 и 8 мыши (Sturm, Baker et al. 1994). Возможно, изменение плотности Alu-повторов связано с важными структурно-функциональными особенностями указанного хромосомного района, и маркирует его перестройку в эволюционной линии человека.
Выявленный феномен повышенной плотности Alu-повторов может быть связан с высокой частотой делеций данного хромосомного участка, которая выявляется у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом и у пациентов с рядом солидных опухолей. Так, в составе AIu-богатых интервалов обращает на себя внимание аномально высокое содержание повторов наиболее молодого подсемейства Alu Y. Например, интервал D13S1I68 -D13S319 содержит 24 повтора подсемейства Alu Y, то есть 5,08% от всей длины этой области, что значительно выше чем в среднем по геному. Повторы подсемейства Alu Y в наименьшей степени отличаются друг от друга по нуклеотиднои последовательности и поэтому являются наиболее эффективными мишенями для неравного кроссинговера, в том числе в соматических клетках. Возможно, это одна из причин нестабильности района из области 13ql4.3, приводящая к его перестройкам в ряде опухолевых заболеваний человека.
Поскольку анализ генов и генных фргментов, расположенных в составе минимальной области, утрачиваемой у больных В-ХЛЛ не позволил однозначно выбрать кандидатный ген - онкосупрессор, пригодный для дальнейшего функционального анализа, мы предприняли сравнительный анализ исследуемого участка хромосомы 13 у человека и мыши. Поиск клонов геномной ДНК мыши, соответствующих участку, утрачиваемому у больных В-ХЛЛ, был проведен на материале геномной клонотеки мыши RPCI21, состоящей из 128000 клонов, представленных на семи фильтрах высокой плотности размером 22.5 х 22.5 см каждый. Было проведено четыре последовательных эксперимента по гибридизации указанных фильтров с четырьмя радиоактивно-мечеными пробами, соответсвующим генам человека DLEU1, DLEU2, RFP2 и 9Е4.3. Первые три из указанных генов были описаны выше. Ген 9Е4.3, расположенный недалеко от гена RFP2 со стороны теломеры, впервые описан партнерской лабораторией в Королевском Госпитале в Борнмуте, Великобритания (Corcoran et al.s 1998). Типичный радиоавтограф, содержащий результаты гибридизации с пробой, соответствующей гену DLEU2 мыши, приведен на Рис. 11.
В результате трех гибридизационных скринингов с пробами, соответствеющими генам DLEU2, RFP2 и 9Е4.3 были выявлены 22 РАС-клона, три из которых были отобраны для дальнейшего анализа (номера 454-С18, 602-N13, и 588-К23). Эти клоны были получены из Британского Центра по Изучению Генома Человека (UK HGMP) в виде живых трансформированых клеток E.coli. Данные Саузерн-гибидизации ДНК этих клонов, переваренной с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, BamHI и Hindlll свидетельствовали о том, что все три РАС-клона соответствуют нативной структуре исследуемого участка геномной ДНК мыши, поскольку все информативные пробы идентифицировали идентичные рестрикционные фрагменты.
Гибридизация тех же фильтров высокой плотности с радиактивно-меченой пробой DLEU1 не привела к обнаружению позитивных гибридизационных сигналов, даже при значительном снижении температуры гибридизационного раствора. Несмотря на то, что ген DLEU1 у человека расположен между геном RFP2 и фрагментом, соответствующим гену 9Е4.3, DLEU1-позитивные сигналы не были обнаружены и при Саузерн-гибридизации продуктов расщепления РАС-клонов 454-С18, 602-N13, 588-К23 и геномной ДНК мыши, которые содержали обе фланкирующие последовательности.
Таким образом, негативные результаты были получены и при полногеномном гибридизационном поиске фрагмента генома мыши, соответствующего гену DLEU1, и при его поиске в составе конкретных РАС-клонов, перекрывающих участок его наиболее вероятной локализации. Это позволило предположить, что в геноме мыши либо отсутствует ортолог гена DLEU1, либо эта ортологичная последовательность так сильно изменилась в процессе эволюции, что не может быть более выявлена путем гибридизации нуклеиновых кислот. Данный вывод подтвержают эксперименты по Норзерн-гибридизации пробы, соответствующей гену DLEU1 человека с мРНК из различных тканей мыши, которые также не привели к выявлению ортологичных экспрессирующихся последовательностей. Указанные эксперименты были проведены вместе с к.б.н. Макеевой Н.В. (ИОГен РАН). Данная работа была начата и завершена до выхода в свет полных последовательностей генома человека и мыши.
С помощью FISH-гибридизации флуоресцентно-меченой пробы, соответствующей РАС-клону 602-N13, с препаратом клеток мыши, находящихся на стадии метафазы данный клон был приписан к участку Dl-З в хромосоме 14 мыши, синтенному участку 13ql4 генома человека, (эксперимент был проведен в Госпитале г.Худдинг, Швеция, автор эксперимента M.Heyman).
