Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Фенотипическая классификация дрожжей kluyveromyces 8
ГЛАВА 2. Молекулярная классификация дрожжей kluyveromyces 17
2.1. Молекулярные методы, используемые в систематике дрожжей 17
2.1.1. Определение мол. % ГЦ и ДНК-ДНК-реассоциация 17
2.1.2. Установление филогенетического родства дрожжей с помощью анализа последовательностей рДНК , 18
2.1.3. Использование ПЦР-анализа для классификации дрожжей 23
2.1.4. Полиморфизм митохондриальной ДНК и пульс-электрофорез нативных хромосомных ДНК 25
2.2. Генетико-таксономическое изучение дрожжей Kluyveromyces с помощью молекулярных методов и современная классификация рода 28
Экспериментальная часть и обсуждение 36
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 36
3.1. Объекты исследования и методы культивирования штаммов 36
3.2. ГЩР-анализ 42
3.3. Секвенирование 45
3.4. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК 46
3.5. Филогенетический анализ 47
ГЛАВА 4. Разработка молекулярных методов для дифференциации видов рода kluyveromyces
4.1. Физиологические особенности дрожжей рода Kluyveromyces 49
4.2. Выбор участков рДНК для секвенирования и ПДРФ-анализа 51
4.2.1. Сравнение нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК типовых культур рода Kluyveromyces 51
4.2.2. Сравнение нуклеотидных последовательностей и ПДРФ-анализ 5.8S-ITS-pafioHa рДНК типовых культур рода Kluyveromyces 54
4.2.3. ПДРФ-анализ амплифицированных Ю82-фрагментов рДНК 58
4.3.Анализ гена АСТ1 61
4.4. Молекулярное кариотипирование 63
4.4. Обсуждение 66
ГЛАВА 5. Внутривидовой полиморфизм дрожжей К. Lactis 68
5.1. Сравнительный анализ геномов молочных дрожжей К. lactis van lactis и их ближайших диких родственников - европейской популяции "krassilnikovii" 68
5.1.1. ПДРФ-анализ амплифицированных Ю82-фрагментов рДНК 69
5.1.2. Молекулярное кариотипирование 71
5.1.3. ПЦР-анализ с микросателлитными праймерами (GTG)5 и (ATG)5 71
5.2. Молекулярная дифференциация природных штаммов К. lactis 77
5.2.1. ПДРФ-анализ 5.8S-ITS-pafioHa рДНК 77
5.2.2. ПДРФ-анализ Ю82-района рДНК 79
5.2.3. Молекулярное кариотипирование 81
5.2.4. Секвенирование 5.88-1Т8-фрагментов рДНК 83
5.3. Обсуждение 87
ГЛАВА 6. Внутривидовой полиморфизм дрожжей К. MarxianuS 90
6.1. Определение видовой принадлежности изученных штаммов 90
6.2. Анализ нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS 1 и ITS2 рДНК 93
6.3. Анализ нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров IGS1 иКЖрДНК 96
6.4. Анализ нуклеотидных последовательностей ядерного гена АСТ1 99
6.5. ПЦР-анализ с неспецифичными праймерами 101
6.6. Молекулярное кариотипирование 108
6.7. Обсуждение ПО
ГЛАВА 7. Генетические особенности дрожжей к. dobzhanskii и к. wickerhamii 111
7.1. Молекулярный анализ штаммов К. wickerhamii 111
7.2. Изучение географических популяций дрожжей К. dobzhanskii 113
7.2.1 ПДРФ-анализ ГС82-фрагментов рДНК 114
7.2.2. Молекулярное кариотипирование 115
7.2.3. Анализ нуклеотидных последовательностей 5.88-1Т8-фрагмента рДНК 119
7.2.4. Анализ нуклеотидных последовательностей митохондриального гена СОХ2 119
7.2.5. ПЦР-анализ с микросаттелитным праймером (GTG)5 123
7.3. Обсуждение 126
Заключение 128
Выводы 132
Список литературы
- Установление филогенетического родства дрожжей с помощью анализа последовательностей рДНК
- Пульс-электрофорез хромосомных ДНК
- Сравнение нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК типовых культур рода Kluyveromyces
- ПДРФ-анализ амплифицированных Ю82-фрагментов рДНК
Введение к работе
Генофонд дрожжей, используемых в фундаментальных и прикладных исследованиях, постоянно расширяется. Большое внимание уделяется нетрадиционным несахаромицетным дрожжам с уникальными свойствами (Голубев, 1992а, Наумова, 2006). Молочные дрожжи Kluyveromyces lactis являются важным эукариотическим объектом молекулярной генетики и биотехнологии. Полноценное использование этих дрожжей невозможно без знания их физиолого-генетических особенностей и научно обоснованной классификации и идентификации.
Систематическое положение дрожжей рода Kluyveromyces подвергалось многочисленным ревизиям: пересматривался Их родовой и видовой статус. Первоначально описанные в роде Saccharomyces (Lodder и Kreger-van-Rij, 1952), эти дрожжи включали в состав различных родов: Zygosaccharomyces, Fabospora, Zygofabospora и др. После того как van. der Walt изменил первоначальный диагноз полиспорового рода Kluyveromyces, в него были включены немногоспоровые дрожжи Saccharomyces marxianus и родственные виды (van der Walt, 1965). Генетический анализ и секвенирование рибосомальных генов выявили полифишпо рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt (Наумов, 1986, 19876; Cai et al., 1996; Kurtzman, Robnett, 1998). Внутри этого гетерогенного рода была выделена группа, включающая гибридизируемые виды (К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii) и таксономически близкие дрожжи К. aestuarii и К. nonfermentas. На основании мультигенного филогенетического анализа была проведена ревизия клада Saccharomyces и консервация рода Kluyveromyces, в котором были оставлены только шесть указанных видов (Kurtzman, 2003). В этом составе Kluyveromyces фактически является переименованием рода Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov 2002.
Традиционная систематика дрожжей базируется на использовании морфологических и физиологических признаков, которые обладают
значительной изменчивостью. Поэтому использование только стандартных физиологических тестов зачастую приводит к неправильной идентификации штаммов. Для создания научной классификации дрожжевых организмов и получения достоверных сведений об их эволюции необходимо, помимо фенотипических признаков, изучать молекулярные особенности генов и геномов. Последние являются предметом изучения геносистематики или макромолекулярной систематики (Антонов, 1974, 1980, 2005; Белозерский, 1969; Наумов 1987а). Актуальным является использование молекулярных методов, позволяющих быстро и достоверно идентифицировать большое количество штаммов. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР-амплификация различных участков рибосомальной ДНК (рДНК) и последующий анализ полиморфизма длин рестриктазных_фрагментов (ПДРФ) успешно используются в настоящее время в таксономии дрожжей. Недавно проведенное секвенирование генома дрожжей К. lactis (Bussereau et al., 2006) заложило хорошую основу для изучения других видов этого рода. Однако молекулярные исследования проводятся на ограниченном количестве штаммов Kluyveromyces, в основном на типовых культурах и генетических линиях одного происхождения. Таким образом, изучается только ограниченная часть генофонда этих дрожжей, а их природное разнообразие остается не исследованным. Практически ничего не известно о популяционно-генетических особенностях важных для науки и практики культивируемых дрожжей рода Kluyveromyces и их диких родственников. В последние десятилетия молочные дрожжи К. lactis и К. marxianus привлекают большое внимание биотехнологов как продуценты разнообразных веществ (Bonekamp, Oosterom, 1994). Тем не менее, среди обоих видов встречаются медицинские изоляты. Остается неясным происходят ли они от культурных или диких дрожжей Kluyveromyces.
Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции культурных и диких дрожжей рода
Klvyveromyces на материале штаммов различного экологического и географического происхождения.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ
KLVYVEROMYCES
В настоящее время род Kluyveromyces включает группу из четырех гибридизируемых видов К. lactis, К marxianus, К. dobzhanskii, К. wickerhamii и филогенетически близкие виды К. aestuarii и К. nonfermentas (Kurtzman, 2003). Гибридизируемые виды обладают общей системой типов спаривания, позволяющей им скрещиваться между собой. Однако из-за наличия механизмов постзиготической изоляции, образуемые гибриды являются стерильными. Согласно диагнозу рода, для дрожжей Klvyveromyces характерно размножение многосторонним почкованием на узком основании, способность образовывать псевдомицелий, тогда как истинный мицелий отсутствует. Аски формируются после конъюгации гаплоидных клеток, из зигот или диплоидных клеток. Оболочки асков быстро разрушаются с последующим высвобождением аскоспор. Аскоспоры гладкие бобовидные, почковидные или сферические, по 1 - 4 в аске (Бабьева, Голубев, 1979; Бабьева, Чернов, 2004).
Таксономическое положение дрожжей рода Kluyveromyces подвергалось многочисленным ревизиям. Первоначально эти дрожжи были описаны в составе родов Saccharomyces и Zygosaccharomyces. Так, типовой вид рода - К. marxianus впервые был описан как представитель рода Saccharomyces - S. marxianus (Hansen, 1888), а позднее перенесен в род Zygosaccharomyces кж2. marxianus (Guilliermond, Negroni, 1929).
Stelling-Dekker (1931) в своей работе по аскоспоровым дрожжам, разделила род Saccharomyces на два подрода: Saccharomyces и Zygosaccharomyces на основании жизненного цикла диплонтов и гаплонтов. В состав объединенного рода Saccharomyces автор поместила и дрожжи S. fragilis, отличительной особенностью которых было формирование почковидных аскоспор. В определителе дрожжей под редакцией Lodder и Kreger-van-Rij (1952) в род Saccharomyces были включены дрожжи
Zygosaccharomyces, а также некоторые виды родов Debaryomyces и Torulaspora.
Однако, классификация дрожжей, предложенная Lodder и Kreger-van-Rij (1952), была принята не всеми таксономистами. Так, Кудрявцев (1954) провел ревизию рода Saccharomyces и предложил исключить виды-диплонты S. macedoniensis и S. fragilis из состава рода на основании следующих признаков: 1) споры бобовидной формы в противоположность шаровидным у сахаромицетов; 2) оболочки асков легко разрушаются при созревании спор; 3) слабое сбраживание Сахаров и образование не более 4 -4,5% спирта в средах с высоким содержанием сахара. Кудрявцев поместил эти диплоидные дрожжи в новый род Fabospora (F. macedoniensis и F. fragilis), подчеркнув этим названием характерную форму спор в виде боба (fabo - боб). По тем же причинам дрожжи-гаплонты Z. marxianus, а также впервые описанные Кудрявцевым изоляты из слизетечений дуба были отнесены во второй новый род Zygofabospora {Zf. marxiana и Zf krassilnikovii). Название Zygofabospora отражало не только характерную бобовидную форму спор, но, и образование асков после копуляции вегетативных клеток. Формальные латинские диагнозы этих родов были даны автором позднее (Kudriavzev, 1960).
Принимая во внимание различия в жизненном цикле дрожжей, Кудрявцев предложил возобновить род Zygosaccharomyces, как таксон, объединяющий дрожжи-гаплонты с достаточно высокой ферментационной активностью, образующие гладкие шаровидные споры и обитающие в высокоосмотических субстратах. В состав данного рода вошел вид Z. lactis. Эти дрожжи, впервые описанные Dombrowski (1910), ассоциированы с молочнокислыми продуктами и характеризуются способностью сбраживать лактозу.
В том же году Крассильников (1954) на основании различий в форме спор выделил из родов Saccharomyces и Zygosaccharomyces виды с почковидными или бобовидными спорами в новый род Zygorenospora (nomen
nudum). Род включал 3 вида Zr. marxiana, Zr. renospora и Zr. fragilis. К последнему виду примыкали дрожжи Z lactis, сбраживающие лактозу.
Shehata et al. (1955) в составе рода Saccharomyces описали новые дрожжи S. drosophilarum, S. phaseolospora и S. dobzhanskii, отличительной особенностью которых являлось наличие легко разрушающихся асков, содержащих по 1-4 почковидных аскоспоры. Позднее были описаны дрожжи S. wickerhamii (Phaff et al., 1956) и S. vanudenii (van der Walt, Nel, 1963), обладающие сходными морфологическими характеристиками.
В гетерогенном роде Saccharomyces sensu Lodder et Kreger-van Rij 1952 Wicherham (1955) выделил группу дрожжей (неродственных типовому виду S. cerevisiae), которая включала виды S. lactis, S. fragilis, S. marxianus и дрожжи Z. ashbyi и Z dobzhanskii. В отличие от предыдущих авторов, Wicherham в качестве основного критерия для дифференциации дрожжей использовал не различия по форме спор, а способность к скрещиванию. Wicherham и Burton (1956a,b) провели гибридизацию 4 таксонов: S. fragilis х Z dobzhanskii и S. lactis х Z dobzhanskii. Тогда как гибридизация их с остальными сахаромицетами не наблюдалась. Указанная группа дрожжей обладала следующими характерными особенностями: 1) разрушение оболочек асков сразу после созревания спор; 2) способность к утилизации более широкого, по сравнению с сахаромицетами, спектра субстратов; 3) образование у большинства видов значительного количества этилацетата; 4) частое присутствие красного пигмента, близкого к пульхерримину. Все это позволило авторам выделить названные дрожжи в отдельный род Dekkeromyces. Было высказано предположение, что виды этого рода, в свою очередь, разделены на две группы, представляющие собой разные линии эволюционного развития. Первая группа включает гаплоидные виды с круглыми спорами. Вторая группа образована преимущественно диплоидными видами с серповидными спорами. Однако формального описания этого рода не было проведено (nomen nudum).
van der Walt (1956a) описал ранее неизвестные дрожжи, отличительной особенностью которых было формирование многоспоровых асков,
содержащих до 70 и более бобовидных или овальных спор. Автор отнес данные организмы в новый род Kluyveromyces с типовым видом К. polysporus. В том же году был описан еще один вид - К. africanus, выделенный как и К. polysporus из почвы в Африке; он отличался от последнего количеством спор, до 16 в аске (van der Walt, 1956b). Данный вид рассматривался автором как промежуточный между К. polysporus и немногоспоровыми видами, которые Wicherham объединил в неописанный род Dekkeromyces.
Novak и Zsolt (1961) предложили создать семейство Fabosporaceae. Это семейство включало почкующиеся дрожжи с бобовидными спорами, представленные в родах Kluyveromyces (van der Walt, 1956a,b), Dekkeromyces (Wickerham, Barton, 1956a,b), а также мицелиальные дрожжи рода Guilliermondella с серповидными спорами (Nadson, Krassilnikov, 1928). Однако эта классификация не была принята, поскольку в соответствии с международной Ботанической Номенклатурой род Dekkeromyces не имеет формального диагноза.
Boidin et al. (1962) провели сравнительное изучение дрожжей, формирующих почковидные споры. Эти виды, частично представленные в родах Saccharomyces (Lodder et Kreger van Rij, 1952), Fabospora и Zygofabospora (Kudriavzev, 1960) совместно с Endomycopsis selenospora (Stelling-Dekker, 1931) были выделены в отдельную группу. Они характеризуются хрупкими асками, формой спор от почковидной до серповидной и способностью к утилизации широкого спектра углеродных источников. Авторы поместили эти дрожжи в род Guilliermondella, сохранив название, под которым впервые был описан вид G. selenospora (Nadson, Krassilnikov, 1928).
Электронно-микроскопическое изучение спор дрожжей Е. selenospora показало, что на концах серповидных аскоспор этих дрожжей имеются скульптурные образования, в противоположность полностью гладким бобовидным спорам видов S. fragilis и S. delphensis (Kreger-van Rij, van der Walt, 1963). Авторы пришли к выводу, что сходство формы спор указанных
видов дрожжей только поверхностное и не является основанием для включения вида Е. selenospora, образующего истинный мицелий, в род, содержащий почкующиеся дрожжи.
Roberts и van der Walt (1959) изучив жизненный цикл дрожжей К. polysporm пришли к выводу, что многоспоровость у этих дрожжей происходит из-за несинхронного многократного митотического деления гаплоидных ядер. Это отклонение от нормального ядерного цикла иногда наблюдалось и у немногоспоровых дрожжей S. marxianus. На этом основании van der Walt (1965) изменил диагноз полиспорового рода Kluyveromyces и включил в него немногоспоровые дрожжи с серповидной, бобовидной, эллипсоидальной или круглой формой спор. Таким образом, в состав измененного рода Kluyveromyces вошли виды, ранее относившиеся к родам Fabospora, Zygofabospora, Zygorenospora, Dekkeromyces и Guilliermondella. Полный список рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt включал 14 видов: К polysporus, К. marxianus, Kfragilis, К. lactis, К. drosophilarum, К. dobzhanskii, К phaseolosporus, К delphensis, К africanus, К. wickerhamii, К lodderi, К. aestuarii, К. vanudenii, К phaffii.
В определителе дрожжей (Lodder, 1970) в состав рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt было включено уже 18 видов, разделенных по морфологическим и физиологическим признакам на 2 группы. В первую группу вошли гомоталличные виды с серповидными или бобовидными спорами: К. delphensis, К. lodderi, К. phaffii, К. africanus, К. polysporus, К. fragilis, К. marxianus, К. wickerhamii, К. dobzhanskii, К. drosophilarum, К. phaseolosporus. Во вторую группу были отнесены как гомоталличные, так и гетероталличные виды с круглыми или овальными спорами: К. aestuarii, К. bulgaricus, К. cicerisporus, К. vanudenii, К. veronae, К wikenii, К. lactis.
С конца 70-х годов прошлого века была проведена серия работ по генетическому изучению некоторых дрожжей рода Kluyveromyces. Для определения родовой и видовой принадлежности дрожжей изучали скрещиваемость, жизнеспособность полового потомства - аскоспор гибридов и возможность генетического обмена - рекомбинацию контрольных
ауксотрофных маркеров (Наумов, 1979, 1987в; Наумов и др., 1983; Naumov, 1987, 1996). Способность дрожжей к скрещиванию указывает на их принадлежность к одному роду, а жизнеспособность аскоспор и нормальное мейотическое расщепление контрольных ауксотрофных маркеров свидетельствует о принадлежности штаммов к одному биологическому виду. Данные генетического изучения родов Metschnikowia, Kluyveromyces, Saccharomyces и Neurospora позволили сформулировать генетическую концепцию рода как группы скрещивающихся видов, гибриды которых размножаются вегетативно (Наумов, 1978).
Johannsen и van der Walt (1978), Johannsen (1980) изучили гибридизацию дрожжей Kluyveromyces с целью выяснения гетерогенности состава рода. Использовали следующую генетическую технику: комплементарные природные мутации по сахарам и индуцированные ауксотрофные мутации, отбор прототрофных гибридов в селекивных условиях на минимальных средах. В работе (Johannsen, van der Walt, 1978) было показано, что с дрожжами К. marxianus скрещиваются штаммы 9 других видов: К. bulgaricus, К. cicerisporus, К. dobzhanskii, К. drosophilarum, К. fragilis, К. lactis, К. phaseolosporiis, К. vanudenii, К. wikenii. О родстве скрещиваемых штаммов судили по количеству полученных прототрофных гибридов, унаследовавших оба или один из родительских признаков утилизации Сахаров. Однако метод учета двойных пртотрофов является принципиально неверным (Наумов, 1980). Johannsen и van der Walt, проводившие гибридизацию, с большой долей вероятности объединяли прототрофные сегреганты гибридов, диплоидные гетерозиготные клоны и возможно ревертанты по ауксотрофному маркеру родителей. На частоту встречаемости прототрофов могла повлиять и селекция в процессе пересевов; можно ожидать повышение выживаемости аскоспор гибридов за счет отбора жизнеспособных спор, возвратных скрещиваний, инбридинга и самодиплоидизации. В данном случае правильным подходом было бы учитывать двойные ауксотрофные, а не прототрофные рекомбинанты. В работе (Johannsen, 1980) также использовался метод учета двойных
прототрофов и с незначительными изменениями повторены выводы предыдущего исследования. Межвидовые скрещивания были осуществлены у следующих видов: К. marxianus, К. bulgaricus, К. cicerisporus, К. dobzhanskii, К. drosophilarum, К. fragilis, К. lactis, К. phaseolosporus, К. vanudenii, К. wikenii и К. wickerhamii. К этой группе примыкают виды К. waltii и К. thermotolerans, способные давать редкие гибриды в отдельных комбинациях, и дрожжи К. aestuarii. Последние компетентны к половому гормону дрожжей К. lactis (Herman, 1970). Полученные данные позволили авторам рассматривать скрещивающиеся штаммы первой группы как разновидности К. marxianus: var. bulgaricus, var. dobzhanskii, var. drosophilarum, var. lactis, var. marxianus, var. vanudenii, var. wikenii.
Важным следствием данных работ явилось обособление группы из 11 немногоспоровых гибридизуемых видов от многоспоровых видов рода Kluyveromyces sensu van der Walt 1956.
В определителе дрожжей под редакцией Barnett et al. (1983) род Kluyveromyces претерпел существенные изменения. Гибридизируемые дрожжи К. lactis, К. bulgaricus, К. drosophilarum, К. dobzhanskii, К. vanudenii и К. wikenii были причислены к синонимам К. marxianus. Дополнительно к списку видов (van der Walt, 1970) в состав рода были включены 4 новых вида К. blattae, К. thermotolerans, К. waltii, К. delphensis. Таким образом, полный список содержал следующие виды: К. aestuarii, К. africanus, К. blattae, К. delphensis, К. lodderae, К. marxianus, К. phaffii, К. polysporus, К. thermotolerans, К. waltii, К. wicherhamii. Латинское название дрожжей К. lodderi в соответствии с существующими правилами Ботанической номенклатуры было изменено на К. lodderae.
В определителе дрожжей под редакцией Kreger-van Rij (1984) шесть таксонов, описанные van der Walt как самостоятельные виды, рассматриваются в качестве разновидностей вида К. marxianus: var. lactis, var. bulgaricus, var. dobzhanskii, var. drosophilarum, var. vanudenii, var. wikenii. Дрожжи К cicerisporus были отнесены к синонимам К. marxianus var.
bulgaricus, К. phaseolosporus к К. marxianus var. drosophilarum, a K. fragilis к К. marxianus var. marxianus.
Наумов (1986, 19876) на основании данных гибридологического анализа и ДНК-ДНК реассоциации провел ревизию рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt. Было предложено выделить в отдельный род группу гибридизируемых видов с гапло-диплонтным циклом развития и фенотипически близкие к ним виды с небольшим (1-4) количеством спор в аске. Расширение диагноза рода Zygofabospora Kudriavzev (1960) с включением дрожжей, образующих наряду с бобовидными, круглые или овальные гладкие споры по 1-4 в аске, позволило отнести выделенную гибридизируемую группу в род Zygofabospora emend. G. Naumov. Название рода Zygofabospora отражает важнейшую особенность гапло-диплонтного жизненного цикла этих дрожжей - образование зигот в условиях споруляции. В состав рода вошли следующие виды: Zf marxiana, Zf. aestuarii, Zf. delphensis, Zf dobzhanskii, Zf. drosophilarum, Zf. lactis, Zf. lodderi, Zf. phaseolospora, Zf. thermotolerans, Zf. waltii, Zf. wickerhamii. Полиспоровые виды К. polysporus, К. africanus и К. blattae остались в роде Kluyveromyces. Диплоидные дрожжи К. phaffii было рекомендовано выделить в самостоятельный род. Позднее это сделали Ueda-Nishimura и Mikata (1999), создав род Tetrapisispora с типовым видом - Т. phaffii (van der Walt) Ueda-Nishimura et Mikata comb. nov. Типовым видом рода Zygofabospora Kudriavzev emend. Naumov предложено считать Zf. marxiana. Этот вид использовался в качестве эталонного при генетическом изучении рода.
На основании данных электрофоретического изоферментного анализа Sidenberg и Lachance (1983,1986) вновь возобновили виды К. dobzhanskii и К. lactis. Вид К. lactis был представлен двумя разновидностями К. lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum. Такое разделение было произведено с учетом физиологических и экологических особенностей дрожжей К. lactis. Дрожжи, усваивающие лактозу и ассоциированные с молочнокислыми продуктами, представлены в разновидности К. lactis var. lactis. В разновидность К. lactis var. drosophilarum были объединены дрожжи,
неспособные усваивать лактозу и выделяемые из природных источников, таких как сокотечения деревьев, кишечник плодовой мушки Drosophila sp. Эта классификация была принята в последнем определителе дрожжей Kurtzman, Fell (1998). Однако род Kluyveromyces, по-прежнему, оставался гетерогенным, включая как многоспоровые, так и малоспоровые виды. Полный список рода Kluyveromyces по определителю Kurtzman, Fell (1998) содержит 15 видов: К. aestuarii, К. africanus, К. blattae, К. delphensis, К. dobzhanskii, К. lactis, К. lodderae, К. marxianus, К. phqffii, К. polysporus, К. thermotolerans, К. waltii, К. wicherhamii, в том числе два новых вида К. bacillisporus и К. yarowii.
Таким образом, мы рассмотрели основные этапы развития фенотипической классификации рода Kluyveromyces. Следует отметить, что видовая и родовая дифференциация с использованием морфологических и физиологических характеристик имеет существенные ограничения. Физиологические признаки достаточно изменчивы и на их основании не всегда можно дать объективную оценку родства дрожжей. Показано, что мутационная, комплементационная и комбинативная изменчивость этих признаков может приводить к неверной идентификации штаммов (Scheda, Yarrow, 1966, 1968; Наумов, Юркевич, 1970). В 80-х годах прошлого века в систематике дрожжей стали широко применяться различные молекулярные методы, основанные на характеристике белков и нуклеиновых кислот. Наиболее часто используемые в таксономической практике молекулярные методы будут рассмотрены в следующей главе. Использование этих методов привело к пересмотру видового состава многих родов, включая род Kluyveromyces.
Установление филогенетического родства дрожжей с помощью анализа последовательностей рДНК
С конца 80-х годов прошлого века происходит интенсивное развитие филогенетической систематики дрожжей, основанной на изучении последовательностей рибосомальной ДНК (рДНК). Анализ рибосомальных последовательностей позволяет оценивать родство дрожжей на видовом и родовом таксономических уровнях, а также на уровне семейств. Интерес к изучению рибосомальной ДНК объясняется тем, что: 1) рибосомы имеются у всех клеточных организмов и обладают общим эволюционным происхождением; 2) консервативные последовательности рДНК могут служить соответствующими контрольными участками для выравнивания более вариабельных последовательностей, которые используются для оценки эволюционного родства организмов (Kurtzman, Blanz, 1998). Очень важным является правильный выбор генов или некодирующих участков рДНК для секвенирования, поскольку они характеризуются разным уровнем консервативности (Kurtzman, 2000; Valente et al., 1999). На рис. 1 представлено строение кластера рДНК у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Гены 26S, 18S, 5.8S и 5S рРНК, расположенные на XII хромосоме, организованы в виде тандемных повторов типа "голова к хвосту" (Maleszka Clark-Walker, 1993). Количество таких повторов может варьировать от 100 до 200 копий на геном (Kaback, Davidson, 1980). Рисунок 1. Организация генного кластера рибосомальной ДНК у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ITS-внутренний транскрибируемый спейсер. IGS-межгенный спейсер.
Кодирующие области генов 18S, 5.8S и 26S рРНК разделены двумя промежуточными некодирующими участками, называемыми внутренними транскрибируемыми спейсерами ITS1 и ITS2. Все указанные последовательности кластера сгруппированы в одну транскрипционную единицу. Ген 5S рРНК, входящий в повтор, транскрибируется отдельно (Kutrzman, 1994). Транскрипционные единицы в пределах кластеров разделены участками, которые первоначально обозначались - как нетранскрибируемые спейсеры или NTS. Позднее была выявлена транскрипционная активность этих участков, и применительно к ним стали использовать другое название - межгенные спейсеры IGS1 и IGS2. В отличие от более консервативных кодирующих последовательностей, длина IGS и ITS спейсеров, а также их нуклеотидные последовательности сильно варьируют у разных видов.
Благодаря своей консервативной природе и небольшому размеру (120 п.н.), ген 5S рРНК стал первым рибосомальным геном, используемым для установления родства организмов. Изучение последовательностей этого гена у аскомицетовых дрожжей позволило выделить три филогенетические группы: делящиеся дрожжи, почкующиеся дрожжи и мицелиальные грибы (Walker, 1985). Позднее в систематике дрожжей стали анализировать более информативные 18S и 26S рРНК. Если сравнение последовательностей 5S рРНК позволяет оценивать отдаленные эволюционные связи, то анализ 18S и 26S рРНК чаще применяют для изучения родов и видов дрожжей. Анализ последовательностей 18S рРНК использовался в систематике разных дрожжей: Pichia, Saturnospora, Williopsis (Liu, Kurtzman, 1991; Yamada et al., 1994a,b), Brettanomyces, Debaryomyces, Dekkera, Kluyveromyces (Cai et al., 1996), Saccharomyces (James et al., 1997).
Большая субъединица рДНК очень гетерогенна и содержит наряду с консервативными и более вариабельные участки. Так, Peterson и Kurtzman (1991) установили, что вариабельный домен D2 (участок, размером около 300 нуклеотидов, расположенный на 5 -конце 26S рДНК) обладает достаточной изменчивостью для разделения близких видов внутри родов Issatchenkia, Pichia и Saccharomyces. Штаммы одного вида имели менее 1% нуклеотидных замен в данном домене, тогда как штаммы разных видов отличались значительно большим числом нуклеотидов. Позднее для видовой дифференциации дрожжей стали использовать вариабельный домен D1/D2 26S рДНК, размером около 600 п.н. Для этих целей гораздо удобнее секвенировать непосредственно ПЦР-амплифицированные районы рибосомальной ДНК. Kurtzman и Robnett (1998) провели секвенирование района D1/D2 26S рДНК у типовых культур всех известных на то время видов аскомицетовых дрожжей и обнаружили, что различия по 6 и более нуклеотидам указывают, как правило, на принадлежность штаммов к различным видам. Конспецифичные штаммы имеют идентичные последовательности в районе D1/D2 или отличаются не более чем 3 нуклеотидами. Тем не менее, штаммы с идентичными последовательностями или отличающиеся 1-5 нуклеотидными заменами не обязательно относятся к одному и тому же виду.
Пульс-электрофорез хромосомных ДНК
Выделение хромосомной ДНК. Дрожжи выращивали в 10 мл жидкой YPD среды (г/л: глюкоза - 20, пептон - 20, дрожжевой экстракт - 10) на качалке при 28С в течение 12-16 часов. Суспензию выросших клеток осаждали центрифугированием и осадок промывали в 1 мл раствора ЭДТА/трис (50 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 7.5), затем ресуспендировали в 0.2 мл раствора ЭДТА/трис, содержащего 4 мкг/мл энзиматического препарата Novozym 234 (Novo Industri A/S, Дания) и держали на водяной бане при 42С в течение 10-15 мин. К этой суспензии добавляли 0.8 мл 1%-ной легкоплавкой агарозы (Bio-Rad, США), охлажденной до 38-42С. Полученную смесь выдерживали на льду в течение 30-60 мин. Агарозные блоки инкубировали в 1-2 мл раствора ЭДТА/трис (0.5 М ЭДТА, 10 мМ трис) при 48С в течение 8-Ю ч. Затем инкубировали в лизисном буфере с протеиназой К (0.5 М ЭДТА, 10 мМ трис, рН 7.5, 1% N-лаурол-саркозин рН 9.5, 2 мг/мл протеиназы К) при 50С в течение 8-Ю ч. Агарозные блоки промывали в растворе ЭДТА/трис (50 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 7.5) и хранили при 4С.
Пульс-электрофорез. Разделения хромосомных ДНК осуществляли на аппарате CHEF-DR III (Bio-Rad, США). В качестве буфера использовали 0.5хТВЕ, который охлаждали до 14С.
Пульс-электрофорез штаммов видов К. lactis и К. marxianus проводили в 0.8%-ном агарозном геле с использованием трехступенчатого режима: 1) при 65 В в течение 50 ч при времени переключения полей 1600-2000 сек; 2) при 70 В в течение 48 ч при времени переключения полей 800-1600 сек; 3) при 75 В в течение 22 ч при времени переключения полей 120-600 сек. После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете.
Разделение хромосомной ДНК у штаммов К. dobzhanskii и К. wickerhamii проводили в 0.9%-ном агарозном геле с использованием двух режимов кариотипирования. Четырехступенчатый режим при 150 В:1) в течение 12 ч при времени переключения полей 240 сек; 2) в течение 16 ч при времени переключения полей 160 сек; 3) в течение 16 ч при времени переключения полей 90 сек, 4) в течение 8 ч при времени переключения полей 60 сек. Трехступенчатый режим: 1) при 170 В в течение 8 ч при времени переключения полей 40-120 сек; 2) при 130 В в течение 24 ч при времени переключения полей 120-360 сек; 3) при 100 В в течение 9 ч при времени переключения полей 360-1200 сек. После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием в течение 2-3 ч, затем промывали в дистиллированной воде и фотографировали в УФ свете.
В качестве кариотипических стандартов использовали коммерческие препараты ДНК штаммов Saccharomyces cerevisiae YNN. 295 и Pichia canadensis (syn. Hasenula wingei) YB-4662-VIA (Bio-Rad, США).
Полученные нуклеотидные последовательности анализировали при помощи программы SeqMan package (DNAStar Inc., США). Уже имеющиеся нуклеотидные последовательности штаммов, используемые в работе, приводятся по базе данных сайта CBS (http://www.cbs.knaw.nl/databases/) из ГенБанка на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Выравнивание последовательностей осуществлялось с использованием программ CLUSTAL W и BioEdit version 5.0.9 (Hall, 1999). Установление филогенетических родственных связей у изученных штаммов и построение дендрограмм проводили с использованием программ SEQBOOT, DNADIST, NEIGHBOR и CONSENSE из компьютерного пакета PHYLIP 3.52 (Felsenstein, 1993), а также с использованием методов Neighbour-Joining и UPGMA из компьютерного пакета TREECON (van der Peer, de Wachter, 1994) и MEGA 3 (Kumar et al., 2004). Индексы бутстрэпа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, подсчитывали для 100 псевдореплик.
Филогенетические связи между штаммами устанавливали также путем сравнения профилей ПЦР-продуктов, амплифицированных с микросателлитными праймерами (ATG)5, (GTG)5 и RAPD праймерами ОРА 09, ОРА-11. Дендрограммы, основанные на матрице различий по ПЦР-профилям с указанными праймерами строили с помощью программы Neighbor-Joining из компьютерного пакета TREECON (van der Peer; de Wachter, 1994). Индексы бутстрепа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, определяли для 100 псевдореплик.
Среди шести видов рода Kluyveromyces два - К. lactis и К. marxianus представлены как дикими, так и культурными штаммами, выделяемыми из молочных продуктов и, как правило, сбраживающими лактозу. Это свойство оказалось основополагающим для разделения дрожжей К. lactis на две разновидности К. lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum (Sidenberg, Lachance, 1986; Lachance, 1998). Остальные четыре вида - К. dobzhanskii, К. wickerhamii, К. aestuarii и К. nonfermentas встречаются исключительно в природных условиях, причем штаммы двух последних видов выделяются только из морской воды и обитающих в ней организмов (Lachance, 1998; Nagahamaetal., 1999).
Фенотипические признаки, используемые для идентификации и классификации видов рода Kluyveromyces, не всегда дают достоверные результаты. Отличительной особенностью дрожжей Kluyveromyces, которая в свое время послужила важным критерием выделения их в отдельный род, является бобовидная форма спор. Однако такие споры характерны для видов К dobzhanskii и К. wickerhamii, тогда как К aestuarii и К. nonfermentas имеют шаровидные споры, а К. lactis и К. marxianus включают штаммы, как с бобовидной, так и с шаровидной формой спор.
Изменчивые фенотипические признаки видов рода Kluyveromyces представлены в таблице 4. По устойчивости к циклогексимиду можно дифференцировать две группы видов внутри рода Kluyveromyces. Первая образована резистентными к циклогексимиду (100 мкг/мл) гибридизируемыми видами К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii, вторая группа включает чувствительные к циклогексимиду виды К aestuarii и К. nonfermentas
Сравнение нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК типовых культур рода Kluyveromyces
Как мы уже отмечали, наиболее часто в молекулярной таксономии дрожжей применяют анализ домена D1/D2 26S рДНК (Kurztman, Robnett, 1998). Согласно предложенной шкале, различия по 6 и более нуклеотидам ( 1%) в районе D1/D2 26S рДНК свидетельствует о принадлежности штаммов к разным видам, тогда как конспецифичные штаммы обычно имеют идентичные последовательности или различаются по 1-3 нуклеотидам.
На рисунке 2 представлен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК типовых культур видов рода Kluyveromyces, имеющихся в компьютерой базе данных ГенБанк. Филогенетическое древо построено на основании алгоритма Neighbour-Joining из программного пакета TREECON. В качестве внешней группы использовали типовую культуру Lachancea kluyveri CBS 3082. На филогенетическом древе со 100% достоверностью выделяются два кластера. Первый образован типовыми культурами гибридизируемых видов К. lactis ВКМ Y-868, К. marxianus CBS 712, К. dobzhanskii CBS 2104 и К. wickerhamii ВКПМ Y-1168. Районы D1/D2 типовых культур К. lactis и К. marxianus различаются всего одной нуклеотиднои заменой, тогда как отличия типовых культур К. dobzhanskii и К. wickerhamii от К. marxianus составляют, соответственно, 7 и 12 нуклеотдных замен. В состав второго кластера вошли типовые культуры видов К. aestuarii CBS 4438 и К. nonfermentas CBS 8778, их D1/D2 последовательности отличаются от представителей первого кластера по 14 и 19 нуклеотидными позициями.
Таким образом, с помощью секвенирования района D1/D2 26S рДНК можно достоверно дифференцировать виды К. dobzhanskii, К. wickerhamii, К. aestuarii и К. nonfermentas. Однако этот участок не обладает достаточной изменчивостью для разделения видов К. lactis и К. marxianus.
Более вариабельным участком рДНК является район 5.8S-ITS, включающий ген 5.8S и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2. На рисунке 3 представлены результаты множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS рДНК типовых культур видов К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii, К. wickerhamii, К. aestuarii и К. nonfermentas, доступных через компьютерную базу данных ГенБанк. Все проанализированные штаммы значительно отличаются по последовательностям ITS1 и ITS2 участков рДНК. Так, практически неразличимые по последовательностям D1/D2 26S рДНК виды К. lactis и К. marxianus достоверно различаются по последовательностям ITS1 и ITS2: 22 нуклеотидные замены.
Мы провели амплификацию 5.8S-ITS-panoHa рДНК у типовых культур шести видов рода Kluyveromyces. Размер полученных ПЦР-продуктов был одинаковым у всех видов и составил примерно 720 п.н. Последующий рестриктазный анализ осуществляли с помощью ферментативного расщепления эндонуклеазой Hinjl. Амплифицированный 5.8S-ITS-y4acTOK рДНК типовой культуры К. lactis ВКМ Y-868 разделился на пять фрагментов размером около 290, 180, 120, 80 и 50 п.н. (рисунок 4, дорожка 1). Типовые культуры видов К. marxianus CBS 712, К. dobzhanskii CBS 2104 и К. wickerhamii ВКПМ Y-1168 имеют сходные паттерны с шестью фрагментами размером около 240, 180, 120, 80, 60 и 40 п.н. (дорожки 2-4). Рестриктазный профиль типовой культуры К. aestuarii CBS 4438 характеризуется наличием одинарного фрагмента размером около 380 п.н. и двойного - в районе 170 п.н. (дорожка 5). У типовой культуры К. nonfermentas CBS 8778 выявлено два одинарных фрагмента размером около 380 и 170 п.н. и один двойной -около 85 п.н. (дорожка 6).
ПДРФ-анализ амплифицированных Ю82-фрагментов рДНК
Электрофорез интактных хромосомных ДНК представляет собой своего рода "молекулярную кариологию" и в последние годы широко используется для изучения различных дрожжей, в том числе и Kluyveromyces. Тем не менее, еще не разработаны условия электрофореза, позволяющие разделить все хромосомы дрожжей Kluyveromyces и установить их количество и размеры.
Мы провели молекулярное кариотипирование четырех гибридизируемых видов рода Kluyveromyces: К. marxianus, К. lactis, К. dobzhanskii и К. wickerhamii. Установлено, что в одном электрофоретическом режиме невозможно получить хорошее разделение хромосом для всех четырех видов сразу. Поэтому для каждого вида отдельно были подобраны оптимальные условия пульс-электрофореза, включая время переключения полей, силу тока и напряжение. На рисунке 8 представлены молекулярные кариотипы 14 штаммов Kluyveromyces. Размеры хромосомных полос определяли согласно кариотипическому стандарту штамма S. cerevisiae YNN 295. Хромосомные ДНК изученных штаммов разделились на 3-9 полос размером от 700 до 3000 т.п.н. Согласно интенсивности окрашивания бромистым этидием, некоторые из полос содержат более одной хромосомы.
Все изученные виды характеризуются специфичными хромосомными профилями. Хромосомные ДНК типовой культуры К. dobzhanskii CBS 2104 и штамма UCM Y-321 разделились на 6 полос размером примерно от 1040 до 3130 т.п.н. (дорожки 6 и 7). У типовой культуры К. wickerhamii ВКПМ Y-1168 и штамма UWO85-330.5 обнаружено 6 хромосомных полос в районе 700-2600 т.п.н. Исходя из интенсивности свечения, третья полоса снизу содержит более одной хромосомы (дорожки 8 и 9).
Для штаммов К. lactis и К. marxianus выявлен полиморфизм по количеству и размерам хромосомных полос. Так, хромосомная ДНК штаммов К. lactis разделилась на 3-5 полос. Типовая культура К. lactis var. lactis ВКМ Y-868 и штамм NRRL Y-1118 имеют сходные кариотипы с 5 полосами размером от 1050 до 2800 т.п.н., четвертая полоса снизу является двойной (дорожки 2 и 3). В то же время, штаммы ВКМ Y-1302 и ВКМ Y 1296, формально относящиеся к разновидности К. lactis var. drosophilarwn, по своим кариотипам существенно отличаются друг от друга и от типовой культуры К. lactis var. lactis ВКМ Y-868. Кариотип штамма ВКМ Y-1302 характеризуется наличием четырех полос размером от 1600 до 2300 т.п.н., первая и четвертая полосы, очевидно, являются двойными (дорожка 4). Хромосомная ДНК штамма ВКМ Y-1296 разделилась на 3 полосы в диапозоне от 1200 до 2600 т.п.н. (дорожка 5). Судя по интенсивности окрашивания бромистым этидием, вторая и третья полосы содержат более одной хромосомы.
Типовая культура К. marxianns CBS 712 имеет 5 хромосомных полос в районе 1000-2400 т.п.н. (дорожка 10). Верхняя и нижняя полосы, по-видимому, содержат более одной хромосомы. Сходный кариотип установлен у типовой культуры вида-синонима К. wikenii CBS 5671 (дорожка 11). Типовые культуры еще двух видов-синонимов К. fragilis CBS 397 и К. bulgaricus CBS 2762, а также С. kefyr NRRL Y-329, являющейся анаморфой дрожжей К. marxianus, характеризуются уникальными хромосомными профилями (дорожки 12-14). Хромосомные ДНК штаммов CBS 2762 и CBS 397 разделились, соответственно, на 8 и 9 полос большинство из которых расположено в диапозоне 1000-2400 т.п.н. Штамм NRRL Y-329 имеет кариотип с тремя полосами размером от 1000 до 3100 п.н.
Проведенный пульс-электрофорез хромосомных ДНК позволил дифференцировать близкородственные виды К. marxianus, К. lactis, К. dobzhanskii и К. wickerhamii. С использованием специально подобранных режимов кариотипирования были установлены различия в количестве и размерах хромосомных полос у всех указанных видов. Значительная изменчивость выявлена для хромосомных ДНК дрожжей К. lactis и К. marxianus, тогда как К. dobzhanskii и К. wickerhamii характеризуются видоспецифичными кариотипами легко отличимыми как друг от друга, так и от кариотипов К. lactis и К. marxianus.
Полученные результаты позволили разработать подходы и методы молекулярной дифференциации видов рода Kluyveromyces.
С помощью секвенирования района D1/D2 26S рДНК можно дифференцировать виды К dobzhanskii, К. wickerhamii, К. aestuarii и К. nonfermentas. Однако данный участок не обладает достаточной специфичностью для разделения фенотипически сходных дрожжей К. marxianus и К. lactis. Последние виды можно достоверно дифференцировать на основании анализа нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS-фрагмента рДНК.
Виды рода Kluyveromyces также можно различить с помощью секвенирования ядерного гена ACTL Обнаружено, что филогенетические деревья, построенные на основании нуклеотидных последовательностей гена АСТ1 и домена D1/D2 26S рДНК, имеют сходную топологию. На обоих деревьях дрожжи К. aestuarii и К. nonfermentas занимают наиболее отдаленное положение.
Для изучения природного полиморфизма дрожжей Kluyveromyces необходимо оперировать большим количеством штаммов известной видовой принадлежности. Однако секвенирование является достаточно трудоемким и дорогостоящим методом и не подходит для массовой идентификации штаммов. Для этих целей более применим ПДРФ-анализ некодирующих участков рДНК. Рестриктазным анализом 5.88-ГТ8-фрагмента рДНК с использованием эндонуклеазы Hinfi можно дифференцировать виды К. aestuarii и К. nonfermentas от группы гибридизируемых видов К. marxianus, К. lactis, К. dobzhanskii и К. wickerhamii. Рестриктазный анализ более вариабельного района рДНК - межгенного спейсера IGS2 эндонуклеазой Alul позволяет дифференцировать все виды рода Kluyveromyces. Данный метод был выбран нами для определения видовой принадлежности изученных штаммов Kluyveromyces. Пульс-электрофорез нативных хромосомных ДНК выявил различия между молекулярными кариотипами дрожжей К. marxianus, К. lactis, К. dobzhanskii и К. wickerhamii.
