Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Классификация дрожжей saccharomyces sensu stricto 8
1.1. Краткая история классификации 8
1.1.1. Генетический анализ 9
1.1.2. Молекулярно-биологичсская классификация 10
1.1.3. Современная таксономия рода Saccharomyces 16
1.2. Таксономические особенности видов рода Saccharomyces 18
1.2.1. Saccharomyces cerevisiae 18
1.2.2. Saccharomyces paradoxus 20
1.2.3. Saccharomyces bayanus 22
1.2.4. Saccharomycespastoriamis 23
ГЛАВА 2. Дивергенция геномов дрожжей рода saccharomyces 26
2.1 . Роль крупных хромосомных перестроек в процессах видообразования дрожжей 27
2.2. Генные дупликации и их роль в эволюции дрожжей Saccharomyces 28
2.3. Полиплоидия и межвидовая гибридизация 29
2.4. Сравнительный анализ генов и геномов 31
2.5. Тсломеры дрожжей Saccharomyces 32
ГЛАВА 3. Генетика ферментации сахаров 36
3.1. Полимерные гены ферментации мальтозы 37
3.2. Полимерные гены, контролирующие ферментацию а-м етил глю коз ида и растворимого крахмала 38
3.3. Полимерные гены SUC ферментации сахарозы дрожжей Saccharomyces 39
3.4. Полимерные гены MEL ферментации мелибиозы дрожжей Saccharomyces 44
3.4.1. Семейство полимерных генов MEL дрожжей S. cerevisiae 46
3.4.2. а-Галактозидазные гены MEL вндов-двонинков дрожжей S. ccrevisiac и гибридного таксона S. pastoriamts 52
3.4.3. Регуляция а-галактозндазных генов MEL 53
3.4.4. Ген ы MEL другі їх р одоп дрожжей 54
Экспериментальная часть и обсуждение 56
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 56
4.1. Объекты исследования 56
4.2. ПЦР-анализ 59
4.3. Методы генной инженерии 62
4.4. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Саузерн-гпбрндизация хромосом дрожжей 62
4.5. Филогенетический анализ 64
ГЛАВА 5. Сравнительный генетический анализ р-фруктозидаз дрожжей saccharomyces 66
5. Ї. Гены SUC африканских штаммов дрожжей S. ccrevisiac 66
5.2. Сравнение нуклеотидных последовательностей р-фруктозпдазпых генов SUC 69
5.3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей [ї-фруктозндаз 71
ГЛАВА 6. Рестриктазныи анализ а-галактозидазных генов дрожжей saccharomyces 78
ГЛАВА 7. Европейское семейство а-галактозидазных генов mel дрожжей S. ccrevisiac 81
ГЛАВА 8. Галактозидазные гены дрожжей S. bayamts и S. pastoriamts 84
8.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов MELb, melb0 и MELpt 84
8.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей а-галактозидаз MELb и MELpt 90
ГЛАВА 9. Дивергентное семейство а-галактозидазных генов дрожжей S. cerevisiae 95
9.1. Обнаружение и идентификация нового гсилМЕЫ5 95
9.2.Нуклеотидные и аминокислотные последовательности дивергентных генов MEL 100
9.3. Сравнительный молекулярно-генетический анализ последовательностей а-галактозидаз дрожжей-аскомицетов 105
Заключение 109
Выводы 115
Список литературы
- Краткая история классификации
- Роль крупных хромосомных перестроек в процессах видообразования дрожжей
- Полимерные гены, контролирующие ферментацию а-м етил глю коз ида и растворимого крахмала
- Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Саузерн-гпбрндизация хромосом дрожжей
Введение к работе
Естественный генофонд дрожжей представляет собой большой потенциал для фундаментальных и прикладных исследований. Изучая природное разнообразие дрожжей и, в частности, генетический полиморфизм биохимических и физиологических признаков у природных и промышленных штаммов, можно получать ценную информацию о разных уровнях организации генетического материала.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, геном которого был полностью секвенирован (Goffeau et al., 1996). Это создало основу для изучения геномов остальных пяти видов рода Saccharomyces; S, bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и 5. paradoxus. К настоящему времени в компьютерных базах данных имеются полные последовательности геномов видов S. bayanus, S. paradoxus, S, mikatae и S. kudriavzevii. Однако в проектах по секвенированию полных геномов было использовано лишь по одной генетической линии каждого вида, у которых могут отсутствовать многие ядерные и шггоплазматические детерминанты, представленные у других штаммов того же вида и, следовательно, информация, полученная таким путем, имеет ограниченный характер. Кроме того, известен значительный полиморфизм размеров хромосом, особенно у культурных штаммов дрожжей-сахаромицетов, свидетельствующий о больших вставках и делениях генетического материала.
Сравнительный анализ геномов дрожжей S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus и S. mikatae показал, что наиболее изменчивы теломерные районы хромосом (Kellis et al., 2003), содержащие гены ряда мультнгенных семейств. К их числу относятся полимерные гены ферментации различных Сахаров: мальтозы (гены MAL), мелибиозы (MEL), сахарозы (SUC) и другие (Carlson, Botstein, 1983; Charron et al., 1989; Naumov et al., 1995d).
К настоящему времени у дрожжей S. cerevisiae идентифицировано шесть Р-фруктозндазпых генов (SUCJ-SUC5 и SUC7). Анализ' физической структуры различных локусов SUC показал, что все гены SUC, за
исключением SUC2, локализованы в теломсрных районах хромосом (Carlson et al., 1985). Ген SUC2 - единственный р-фруктозидазный ген, расположенный не в телом ерном районе хромосомы (Mortimer-et al., 1992). Интересно отметить, что ген SUC2 имеется у всех штаммов дрожжей S. cerevisiae, хотя у некоторых из них он представлен нефункциональным мутаитным аллелем suc2 (Carlson, Botstein, 1983; Naumov et al., 1996c). p-Фруктозидазные гены остальных видов рода Saccharomyces практически не изучены, а у дрожжей S. саг'юсапш даже не определена его ігуклеотидная последовательность. Более того, эволюция р-фруктозидаз в рамках рода Saccharomyces еще никем не анализировалась.
Признак ферментации мелибпозы в целом не характерен для дрожжей S. cerevisiae, и большинство штаммов этого вида не имеют даже "молчащих" последовательностей генов MEL (Naumov et al., 1991; Turakainen et al, 1993b). К их числу относятся лабораторные линии, одна из которых была использована для секвенирования генома дрожжей S. cerevisiae. Известны популяции S. cerevisiae, обитающие в специфических субстратах (желудочно-кишечном тракте млекопитающих и отходах производства оливкового масла), в которых происходит накопление полимерных генов MEL (Naumov et аЦ1995е). К настоящему времени у дрожжей S. cerevisiae идентифицировано одиннадцать а-галактозидазных генов MEL1-MEL11, расположенных в теломсрных районах различных хромосом. Все штаммы, содержащие эти гены, имеют европейское происхождение. Редкие штаммы, сбраживающие мелибиозу, были выявлены среди винных и клинических изолятов (Naumov et al., 1996b).
Дивергентные гены MEL12-MEL14, обладающие низким уровнем гомологии с представителями европейского семейства MEL1-MEL1I, обнаружены в Африке (Наумов, Наумов, 1997а). Африканские гены, также как и гены европейского семейства, были картированы в теломерных районах хромосом (Наумов, Наумов, 19976). Происхождение африканского семейства генов дрожжей S. cerevisiae продолжает оставаться неясным.
Гены ферментации мелнбпозы (MEL) и сахарозы (SUC) дрожжей Saccharomyces представляют уникальную генетическую систему, позволяющую изучать быструю микроэволюшпо дрожжевого генома как на уровне хромосом, так и на уровне генов.
Целью данной работы является изучение молекулярного полиморфизма и эволюции ct-галактозидазных и Р-фруктозидазных генов дрожжей рода Saccharomyces.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. КЛАССИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES
SENSU STR1CTO 1.1. Краткая история классификации
Впервые название рода Saccharomyces, как и вида Saccharomyces cerevisiae было дано Меуеп (1838) при описании пивных дрожжей, Reess (1870) определил рад Saccharomyces как группу дрожжей, размножающихся в основном почкованием, но в определенных условиях способных образовывать аски, содержащие от одной до четырех аскоспор. Позднее Hansen (1883, 1888, 1908) ввел технику чистых культур и дал первое полное описание дрожжей-сахаромицетов, назвав пивные дрожжи верхового брожения S. cerevisiae, а низового — S. carlsbergensis. В дальнейшем род Saccharomyces подвергался многочисленным ревизиям. История этих ревизий подробно изложена в обзоре Barnett (1992). Остановимся лишь на ключевых моментах систематики дрожжей Saccharomyces.
Первый определитель дрожжей был опубликован Guilliermond (1914). Род Saccharomyces в нем представлен 46 видами, разделенными на шесть групп. Stelling-Dckker (1931) в своей работе по аскоспоровым дрожжам, включила в род Saccharomyces только 23 вида, разделив их на два подрода: Saccharomyces и Zygosaccharomyccs. Lodder и Kreger-van-Rij (1952) признали большинство из этих 23 видов и дополнительно включили в род Saccharomyces некоторые виды родов Debaryomyces и Torulaspora. Основной причиной, позволившей авторам объединить данные роды в один, стало их ошибочное представление о неразличимости жизненного цикла диплонтов и гаплонтов. Род Saccharomyces в этом определителе включал в себя 30 видов.
Однако, классификация дрожжей, предложенная Lodder и Kreger-van-Rij (1952) была принята не всеми таксономлстами. Так, в определителе дрожжей, составленном Кудрявцевым (1954), род Saccharomyces состоит всего из 18 видов. Согласно Кудрявцеву, в составе рода Saccharomyces
оставлены только дрожжи-дпплонты с сильно выраженной способностью сбраживать различные сахара и накапливать большое количество этанола.
van der Walt (1970) увеличил число видов рода Saccharomyces до 41. Он разделил данный род на четыре группы видов по морфологическим и физиологическим свойствам. В первую группу были объединены виды-диплонты, характеризующиеся активной ферментацией Сахаров: Saccharomyces sensu stricto. К остальным трем группам отнесены виды, неродственные S. cerevisiae.
Позднее в многочисленных работах была продемонстрирована мутационная, комплементационная и комбинативная изменчивость биохимических признаков дрожжей (Scheda, Yarrow, 1966, 1968; Наумов, Юркевич, 1970). Это свидетельствовало о необъективности видовой дифференциации дрожжей, построенной на способности утилизировать различные сахара. В результате, все представители группы Saccharomyces sensu stricto были объединены в один вид Saccharomyces cerevisiae. В определителе дрожжей под редакцией Krcger-van-Rij 1984), род Saccharomyces насчитывал только 7 видов: S. cerevisiae, S. dairensis, S. exiguus, S. kluyveri, S. servazzii, S. telluris и S. unisporus. К синонимам S. cerevisiae были отнесены более 80 видов дрожжей (Yarrow, 1984).
1.1.1. Генетический анализ
Впервые гибридологический анализ в таксономии дрожжей применил датский ученый Winge (Winge, Lausten, 1939). Он предложил использовать способность к скрещиванию и оценку выживаемости аскоспор гибридов в качестве критерия дифференциации видов вігутри рода Saccharomyces. Для контроля предлагалось изучать выживаемость аскоспор родительских штаммов. Однако, дальнейшие исследования, проведенные в других лабораториях, показали, что многие природные и, в особенности, промышленные штаммы дрожжей часто обладают низкой выживаемостью аскоспор вследствие многочисленных генетических факторов, таких как полиплоидия, анеуплоидия, рецессивные летали, делецни, траислокации и
инверсии, присутствующие в гетерозиготном состоянии. В этом случае родительские споры генетически разпокачественны и их суммарная выборка не может характеризовать споры, взятые в скрещивание. Объективная оценка родства между штаммами возможна только при использовании в генетическом анализе специально созданных инбредных линий дрожжей с высокой выживаемостью аскоспор (Наумов, 1997). В случае гомоталличных штаммов дрожжей такие линии создаются путем моноспорового клонирования, тогда как для гетероталлнчных штаммов необходимы вігутритетрадньїе скрещивания. Моноспоровое клонирование приводит к элиминации летальных факторов и существенно повышает выживаемость аскоспор.
В рамках гибридологического анализа классификация и идентификация дрожжей должна осуществляться на основании ряда генетических принципов (Наумов, Никоненко, 1987). Способность дрожжей к скрещиванию указывает на их принадлежность к одному роду, а жизнеспособность аскоспор — продуктов мейоза и регулярное мейотическое расщепление контрольных ауксотрофных маркеров свидетельствуют о принадлежности штаммов к одному биологическому виду. Для гибридов различных видов одного рода характерна стерильность.
С использованием метода гибридологического анализа были описаны три биологических вида рода Saccharomyces: S. cerevisiae, S. paradoxus и S. bayanus (Наумов и др., 1983; Naumov, 1987, 1996).
1.1.2. Молекулярно-биологическая классификация
В конце 70-х годов прошлого века в систематике дрожжей начинают использовать молекулярные методы, основанные на характеристике нуклеиновых кислот и белков. Одним из первых таких методов стало определение молярного процента гуанина и цитозииа (мол.% ГЦ) в ядерной ДНК. Диапазон мол.% ГЦ в ДНК аскомицетовых дрожжей составляет 28-52% (Kurtzmann, 1985). Колебания значений процентного содержания ГЦ внутри одного рода обычно не превышают 10 мол.% ГЦ, однако одинаковые
значения мол.% ГЦ не всегда означают близкое родство организмов (Price et al, I978;Kurtzmann, 1985).
Большей разрешающей способностью для установления видовых границ обладает метод ДНК-ДНК реассоциацин, основанный на способности одноцепочечных молекул ДНК двух различных штаммов образовывать гибридные двуцепочечные молекулы. Другими словами, метод ДНК-ДНК реассоциацин позволяет установить достаточно протяженные раПоЕгы генетической гомологии между молекулами ДНК различных организмов (Jahnke, 1987). На основании сравнения видов дрожжей родов Schwannhmyces, Saccharomyces, Debaryomyces и Pichia было показано, что штаммы, имеющие 80-100% сходства ДНК являются конспецифичными, т.е. относятся к одному виду (Price et al, 1978). Низкие значения реассоциацин ДНК (0-30%) свидетельствуют о принадлежности дрожжей к разным видам. Определенную трудность вызывает промежуточный уровень ДНК-ДНК реассоциацин — 50-70%, В этом случае возможны разные точки зрения: разные виды, один вид или разновидности одного вида.
Применение метода ДНК-ДНК реассоциацин подтвердило существование трех биологических видов Saccharomyces sensu stricto: S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus и позволило дифференцировать гибридный таксон S. pastorianus (syn. S. carlsbergensis) (Vaughan Martini, Kurtzman, 1985; Vaughan Martini, Martini, 1987; Vaughan Martini, 1989). Было установлено, что типовые культуры S. pastorianus CBS 1538 (дрожжи, загрязняющие пивное производство) и S. carlsbergensis CBS 1513 (дрожжи низового брожения) имеют 93% сходства и, следовательно, являются синонимами (Vaughan Martini, Martini, 1987). Так как дрожжи S. pastorianus были описаны раньше, чем S. carlsbergensis (Hansen, 1904, 1908), то в соответствии с международной Ботанической Номенклатурой именно это видовое название имеет приоритет.
В определителе дрожжей Barnett, Payne и Yarrow (1990), род Saccharomyces насчитывал 10 видов: S. cerevisiae с более, чем 130
синонимами, S. bayanus, S. paradoxus, S. pastorianus, S. caslcllii,S. dairensis,
S. exigitus, S. kluyvcri, S. scrvazzii и S. imisporns. I
В настоящее время в филогенетической систематике дрожжей широко используется изучение последовательностей рибосомальных генов (Kurtzman, Robnett, 1998), Анализ последовательностей генов N рибосомальнон ДНК позволяет оценивать родство дрожжей на видовом и родовом таксономических уровнях, а также на уровне семейств. При этом очень важным является правильный выбор генов или участков рДНК для секвестрования (Kurtzman, 2000; Valente et al., 1999). Благодаря своей консервативной природе и небольшому размеру, ген 5S рДНК стал первым рибосомальным геном, используемым для установления родства организмов. Его анализ применяется при оценке отдаленных эволюционных связей организмов. Изучение последовательностей этого гена 'yj аскомицетовых дрожжей позволило выделить три дивергентные группы: \ делящиеся дрожжи, почкующиеся дрожжи и мицелиальные грибы (Walker, 1985). Более часто в молекулярной таксономии используется анализ 1SS и 26S рДНК. Эти молекулы более гетерогенны и содержат участки, различающиеся по консервативности. Анализ последовательностей генов большой и малой рРНК используется для установления родства у грибов на разных уровнях: порядок, класс, семейство. Секвенирование гена 18S рДНК позволило пересмотреть ряд таксонов внутри рода Saccharomyces и описать новые виды комплекса Saccharomyces sensu lato (James et al., 1997; Ando et al., 1996; Oda et al., 1997, 1999; Mikata et al., 2001).
Исследование гена 26S рДНК также используется для установления родственных связей между родами и видами, при этом анализируются различные участки большой субъединицы рРНК. Так, Peterson и Kurtzman (1991) провели секвенирование вариабельного домена D2 (участок, размером около 300 нуклеотидов, расположенный на 5'-конце большой субъединицы рРНК) и показали, что этот район обладает достаточной изменчивостью для разделения близких видов внутри родов Issatchenkia, Pichia и Saccharomyces. Конспешіфичшле штаммы имели менее 1%
нуклеотпдных замен в данном домене, тогда как разные виды отличались значительно большим числом пар нуклеотидов. Позднее для анализа дрожжей на видовом уровне стал использоваться вариабельный домен D1/D2 рДНК, размером около 600 п.н. Kurtzman и Robnett (1998) провели секвенирование этого района у всех известных видов аскомицетовых дрожжей и показали, что различия по шести и более нуклеотидам указывают, как правило, на принадлежность штаммов к различным видам. Конспецифичные штаммы имеют идентичные последовательности в районе D1/D2 или отличаются не более чем по трем нуклеотидам.
Все перечисленные районы генов рДНК используются главным образом для дифференциации видов и родов дрожжей. Для разделения видов-двойников и разновидностей изучают более вариабельные некоднрующие участки рибосомалыюй ДНК, например внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2. Было показано, что на основании анализа района D2 невозможно дифференцировать вид S. bayanus и гибридный таксон S. pastorianus (Kurtzman, Robnett, 1998; Gouliamova, Hennebert, 1998). В то же время, исследование участков ITS1 и ITS2 позволило разделить виды S. ccrevisiae, S. paradoxus, S. bayanus, а также гибридный таксон S. pastorianus (Gouliamova, Hennebert, 1998). Установлено, что размер района, включающего внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 и ген 5.8S рРНК (5.8S-ITS), примерно одинаков у всех видов комплекса Saccharomyces sensu stricto и составляет около 850 п.н., тогда как у дрожжей Saccharomyces sensu lato он несколько меньшего размера— 800 п.н. (Valente et al., 1996).
Другими участками рДНК, применяемыми для дифференциации близких видов дрожжей, являются нетранскрибируемые межгенные спейсеры 1 и 2 (IGS1 и IGS2). Molina et al. (1993) показали, что с помощью рестриктазного анализа района IGS2 можно дифференцировать близкородственные виды комплекса Saccharomyces sensu stricto - S. ccrevisiae и S. pastorianus!S. carisbergensis. Рестриктазный анализ районов IGS и 5.8S-ITS, а также секвенирование последнего участка, имели сходную
разрешающую способность н позволили разделить дрожжи Saccharomyces sensu stricto на два кластера - "S. cerevisiae" и "S. iayam/s'XMontrocher et al., 199S).
Еще одним методом, позволяющим быстро и достоверно идентифицировать большое количество штаммов, является ПЦР-анализ. В основе лолимеразноґі цепной реакции (ПЦР) лежит многократное копирование определенного фрагмента ДНК с помощью ДНК-полимеразы. В классическом варианте ПЦР проводят с двумя разными праймерами, направленными на известную нуклеотидную последовательность. Для идентификации дрожжей-сахаромицетов чаще всего используют ПЦР-анализ некодирующих участков рибосомалыюй ДНК, а именно районов 5.8S-ITS и IGS (Huffman et al., 1992; Molina et a!., 1993; Valente et al., 1996; Nguyen, Gaillardin, 1997; Montrocher et al., 1998, Josepa et a!., 2000).
Другие последовательности ядерной ДНК в таксономии дрожжей используются реже. Одним из примеров является рестриктазный анализ ПЦР-амшшфицнрованного гена МЕТ2, позволивший разделить виды S. cerevisiae и S. bayanus (Masneuf et al., 1996, 1998), de Barros Lopes et al. (1996) создали ПЦР-праймеры, направленные на intron splice site, при помощи которых удалось дифференцировать многочисленные винные штаммы дрожжей. Позднее эти праймеры были использованы для идентификации дрожжей различных родов. Было показано, что данный метод теоретически применим для'изучения всех видов дрожжей, так как районы intron splice site являются достаточно консервативными (de Barros Lopes et al, 1998). ПЦР-анализ района RPL2 позволил четко дифференцировать виды S. cerevisiae и S. bayanus и подтвердил гибридную природу дрожжей S. pastorianus, у которых были обнаружены амплифицированные фрагменты ДНК, гомологичные как S. cerevisiae^ так и S. bayanus (Ryu et al., 1998a).
В 1990 году была разработана модификация ПЦР-анализа с использованием праймеров, не направленных на какой-либо конкретный ген - RAPD-ПЦР (от английского Random Amplified Polymorphic DNA
Polymerase Chain Reaction) н УП-ПЦР или ПЦР с универсальными праймерами (Williams et al, 1990; Булат, Мироненко, 1990). В этих технологиях обычно используется только один праймер со случайной нуклеотндной последовательностью длиной не более 15-20 нуклеотидов. Метод RAPD-ПЦР широко применяется для идентификации и дифференциации дрожжевых организмов. Так, в работе Molnar et al. 1995) была показана возможность использования RAPD-праймеров для классификации десяти видов рода Saccharomyces. Метод УП-ПЦР и последующая дот-гибридизация ПЦР-продуктов позволили четко разделить шесть видов-двойников комплекса Saccharomyces sensu stricto (Naumova et al., 2003). Для идентификации отдельных штаммов и дифференциации дрожжей на видовом уровне используется также ПЦР-анализ с мини- и микросателлитными праймерами. Например, микросателлитнын праймер (GTG)5 позволяет дифферерщировать виды-двойники Saccharomyces sensu stricto: S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus и гибридный таксон S. pastorianus (Naumova et ah, 2000).
Разработка метода пульс-электрофореза in пакти ой ДНК хромосом эукариотических микроорганизмов создала принципиально новые основы для изучения организации геномов, эволюции и систематики эукариот. Пульс-электрофорез или молекулярное кариотипировапие представляют собой электрофоретическое разделение в агарозном геле нативпых хромосомных ДНК в соответствии с их размером. Впервые этот метод был апробирован на лабораторных генетических линиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Carle, Olson, 1984, 1985). Сочетание молекулярного карнотнпирования и последующей блот-гибридизации хромосомной ДНК с картированными клонированными генами позволило определить у лабораторных штаммов S. cerevisiae соответствие всех 16 электрофоретических полос конкретным хромосомам, ранее идентифицированным рекомбинацнониым анализом (Mortimer et al., 1992).
По своим кариотипам дрожжи комплекса Saccharomyces sensu stricto легко отличимы от дрожжей Saccharomyces sensu lato (Vaughan-Martini ct al.,
1993; Naumov et al., 1995a). С помощью метода пульс-электрофореза была выявлена значительная гетерогенность кариотипов видов Saccharomyces sensu lato, в частности S. exiguns и 5. dairensis (Naumov et al., 1995a; Naumova et a!., 1996a). Полученные кариотипнческне данные хорошо согласуются с исследованиями по ДНК-ДНК реассоциацин и с анализом последовательностей рДНК. На основании результатов ДНК-ДНК реассоциацин внутри гетерогенного комплекса S. exiguus были описаны два новых вида: S. barnelti и S. spencerorum, имеющие менее 30% ДНК-ДНК реассоциацин с типовой культурой S. exiguus (Vaughan-Martini, 1995). Из другого кариотнпически гетерогенного таксона, S. dairensis, по результатам анализа последовательностей 18S рДНК были выделены еще два' новых вида - S. kunashirensis и S. martiniae (James et al., 1997).
Таким образом, в последнем определителе дрожжей род Saccharomyces был представлен уже 14 видами: S. barnetti, S. bayanus, S. castellii, S. cerevisiae, S. dairenensis, S. exiguus, S. kluyvery, S. paradoxus, S. pastorianus, S. rosinii, S. servazzii, S. spencerorum, S. transvaalensis, S. unisporus (Kurtzman, Fell, 1998).
1.1.3. Современная таксономия рода Saccharomyces
Недавно в комплексе Saccharomyces sensu stricto были описаны еще три новых вида: S. cariocanus, S. kudriavzevU и S. mikatae (Naumov et al., 2000a). Дрожжи S. cariocanus были обнаружены в Бразилии, a S. kudriavzevU и S. mikatae - в Японии. При скрещивании представителей этих видов друг с другом, а также с генетическими тестерами видов S. cerevisiae, S. paradoxus и S. bayanus, образовывались стерильные гибриды, тогда как в потомстве всех внутривидовых гибридов наблюдались высокая выживаемость аскоспор и нормальное мейотическое расщепление контрольных маркеров (Naumov et al., 1995b; Naumov et al., 1995c). Пул ье-электрофорез хромосомных ДНК показал видоспецифичность кариотипа S. cariocanus, но не позволил дифференцировать кариотипы видов S. kudriavzevU и S. mikatae. Их хромосомные профили оказались очень схожими с таковыми S, cerevisiae
и S. paradoxus. Тем не менее, все три новых вида отличаются друг от друга и от остальных дрожжей Saccharomyces sensu stricto нуклеотиднымп последовательностями района ITS1 (Naumov et al., 2000а). Установлено, что все шесть видов-двоГшиков комплекса Saccharomyces sensu stricto четко дифференцируются на основании данных мультилокусного и зо ферментного анализа и УП-ПЦР (Naumova et al, 2003).
Недавние исследования хромосомных карнотипов и сравнительный анализ последовательностей одного ядерного и двух митохондриальных генов у большого числа штаммов дрожжей комплекса Saccharomyces sensu lato показали генетическую неоднородность видов S. exiguus и S. transvaalensis. Это наблюдение позволило авторалі высказать предположение о том, что отдельные дивергентные группы штаммов внутри данных видов находятся на ранних этапах генетической изоляции и в будущем могут сформировать самостоятельные виды дрожжей (Spirek et al., 2003).
Kurtzman и Robnett (2003) провели мультнгенньш филогенетический анализ 75 видов Saccharomyces, Kluyveromyces и некоторых других близкородственных им дрожжевых родов, используя ігуклеотпдньїе последовательности генов рДНК (районы 18S, 26S и ITS), однокопийных ядерных (EF-la, актин-1, РНК полимераза II) и митохондриальных (СОХ II, малая субъединица рРНК) генов. На основании полученных данных авторы разделили все проанализированные виды на 14 кладов, причем во многих случаях эти клады не соответствовали родам, принятым в традиционной таксономии дрожжей. На основании комплексного мультигенного анализа, Kurtzman (2003) дал новое филогенетическое описание 9 родов, в том числе Saccharomyces и Kluyveromyces, и предложил включить в семейство Saccharomycetaceae пять новых родов: Lachancea, Nakaseomyces, Naumovia, Vanderwaltozyma и Zygotorulaspora. В составе рода Saccharomyces оставлены только дрожжи комплекса Saccharomyces sensu stricto (S. bayamis, S. cariocanus, S. cerevisiae, S. kudrlavzevii, S. mikalae, S. paradoxus и гибридный
таксон S. pasioriamis), а виды Saccharomyces sensu lato были отнесены к различным родам, преимущественно к Kazachstania и Naumovia.
1.2. Таксономические особенностн видов рода Saccharomyces 1.2.1. Saccharomyces cerevisiae
Культурные дрожжи-сахаромицеты, традиционно используемые в бродильных процессах, представлены биологическим видом Saccharomyces cerevisiae. Bicknell и Douglas (1970) изучили эволюционную дивергенцию 33 таксономических видов дрожжей Saccharomyces с помощью метода ДНК-ДНК реассоцнацип и показали, что высокая ДНК-ДНК реассоциация видов S. cerevisiae, S. italicus и 5". chevalieri (92-96%) указывает на их конспецифнчность. Позднее, в работе Rosini et al. (1982), также на основании данных по ДНК-ДНК реассоцнацип, дрожжи, ранее объединенные в вид Saccharomyces cerevisiae, были разделены на две группы: одну, включающую S. cerevisiae, S, chevalieri и iS". italicus, и вторую, представленную S. Ьауапш и S. uvarum. Уровень ДНК-ДНК реассоциации между этими группами составил менее 40%, тогда как внутри каждой группы он варьировал в пределах 90-95,2%.
Vaughan Martini и Kurtzman (1985) изучили уровень ДНК-ДНК реассоциации у 24 типовых культур видов, относящихся к комплексу Saccharomyces sensu stricto. В результате этой работы было установлено, что все анализируемые штаммы дрожжей могут быть отнесены к четырем таксонам: S. cerevisiae, S. bayanus, S. kluyveri и S. pasiorianus.
Генетический гибридологический анализ моноспоровых, высокофертильных культур дрожжей-сахаромицетов убедительно Продемонстрировал близкое родство большого количества таксономических видов комплекса Saccharomyces sensu stricto и позволил объединить их в один биологический вид S. cerevisiae (Наумов и др., 1983). Жизнеспособность аскоспор гибридов колебалась в пределах 44-100%. Значительных различий этого показателя у межвидовых и межштаммовых гибридов, а также у инбредных родительских линий не было. На общность
генофонда дрожжей S. cerevisiae также указывала рекомбинация биохимических и физиологических маркеров в так называемых "межвидовых" скрещиваниях.
Вид S. cerevisiae включает в себя преимущественно промышленные штаммы дрожжей, в природе его представители встречаются довольно редко. Несколько диких штаммов Saccharomyces, изолированных в Японии, были идентифицированы как S, cerevisiae при помощи гибридологического анализа (Наумов, Никоненко, 1988). Позднее природные популяции дрожжей S. cerevisiae были обнаружены также в центральной Сибири (Наумов, Наумова, 1991) и Северной Америке (Naumov et al., 1998; Sniegowski et al., 2002).
Культурные штаммы S. cerevisiae характеризуются значительным
полиморфизмом кариотипов и изоферментных профилей (Наумова и др.,
1993; Naumov et al., 1992; Duarte et al., 1999; Naumova et al., 2003).
Исследование многочисленных винных штаммов S. cerevisiae с
использованием рестрнктазного анализа митохондриальной ДНК выявило
значительные генетические различия между штаммами дрожжей,
изолированными в разных винодельческих регионах (Guillamon et al., 1996).
С помощью метода AFLP (от английского Amplified Fragment Length
Polymorphysm, метод определения полиморфизма длин
амплифицпрованных фрагментов ДНК) Azumi и Goto-Yamamoto (2001) изучили большое количество штаммов дрожжей Saccharomyces и обнаружили, что внутри кластера S. cerevisiae выделяются три подкластера, один из которых включает лабораторные штаммы, второй -многочисленные промышленные штаммы, а третий - дрожжи, изолированные из традиционных японских напитков.
Таким образом, было показано, что дрожжи S. cerevisiae очень гетерогенны и полиморфны по многим молекулярным маркерам.
1.2.2. Saccharomyces paradoxus
Дрожжи Saccharomyces paradoxus впервые были выделены из сокотсчешш дуба и березы в Санкт-Петербурге и Полтавской области и описаны Бачинской как новый вид (1914). По данным Кудрявцева (1954), представители этого вида широко распространены в сокотечениях дуба в европейской части России, в Крыму и на Дальнем Востоке.
Гибридологический анализ дрожжей-сахаромицетов, изолированных из сокотечений дуба, а также фенотипически близких к ним музейных штаммов S. paradoxus, S. terrestris и S. cerevisiae var. tetrasporus показал, что все эти дрожжи относятся к биологическому виду S. paradoxus (Наумов, 1986). По результатам межвидовых скрещиваний S. cerevisiae и S. paradoxus установлено, что образующиеся гибриды стерильны, и, следовательно, S. paradoxus должен рассматриваться как самостоятельный вид, генетически изолированный от S. cerevisiae. Эти данные впоследствии были подтверждены с помощью метода ДНК-ДНК реассоциации, уровень которой между видами S. paradoxus и S. cerevisiae составляет 50% (Vaughan Martini, 1989).
Позднее было установлено, что дрожжи S. douglasii nom. nud. также являются синономом 5. paradoxus (Наумов, Наумова, 1990). При скрещивании S. douglasii с генетическим тестером S. paradoxus наблюдалась высокая выживаемость аскоспор гибридов и нормальное расщепление контрольных маркеров.
Дрожжи & paradoxus являются ближайшими родственниками вида S. cerevisiae. Штаммы, относящиеся к этим видам, имеют практически идентичные ферментационные и ассимиляционные спектры (Naumov et al., 2000а; Kurtzman, Fell, 1998). Хромосомные кариотипы дрожжей S. paradoxus и диких штаммов S. cerevisiae та кисе очень похожи (Наумов и др., 1990; Naumov et al., 1992). Использование большого количества молекулярных маркеров, расположенных в различных хромосомах, показало, что гомеологичные хромосомы S. cerevisiae и S. paradoxus имеют одинаковые размеры (Naumov et al., 1992, Fischer et al., 2000). Тем не менее, виды S.
paradoxus и S. cerevisiac различимы Саузерн-гнбридизацией с зондом промоторной области гена. ADC J (Naumov et al., 1992).
Гибридологический анализ большого количества штаммов . paradoxus, изолированных в разных регионах мира, показал, что выживаемость аскоспор гибридов зависит от географического происхождения родительских штаммов. Так, дрожжи S. paradoxus, выделенные из сокотечений дуба и неокультуренных почв в разных районах Европы при скрещивании друг с другом имеют высокую выживаемость аскоспор: 60-80% (Naumov, 1987). Однако, при скрещивании штаммов S. paradoxus, изолированных на Дальнем Востоке России и в Японии с европейским тестерным штаммом CBS 5829, выживаемость аскоспор гибридов составила только 24-55% (Naumov et al., 1993а). Европейская и дальневосточная популяции дрожжей S. paradoxus значительно отличаются и по результатам мультилокусного изоферментного анализа (Naumov et al., 1997а). Еще более низкая выживаемость аскоспор гибридов наблюдалась при скрещивании североамериканских изолятов S. paradoxus с европейскими тестерами данного вида (Naumov et al., 1996а, 1998; Sniegowski et al., 2002). Гетерогенность биологического вида S. paradoxus была подтверждена также с помощью метода RAPD-ПЦР- Все проанализированные штаммы этого вида четко разделились на три кластера, соответствующие европейской, японской и американской популяциям S. paradoxus (Fernandes-Espinar et al., 2003). С помощью гибридологического анализа была описана еще одна дивергентная популяция вида S. paradoxus -гавайская. При скрещивании гавайских изолятов с американскими и дальневосточными штаммами S. paradoxus фертильность образующихся гибридов была выше, чем у гибридов гавайских и европейских штаммов дрожжей (Наумов, 1999). Это хорошо согласуется с географическим положением гавайской популяции: она расположена между Дальним Востоком и Северной Америкой и наиболее удалена от Европы.
Таким образом, вігутри вида S. paradoxus наблюдается значительная генетическая дивергенция, связанная с частичной репродуктивной
изоляциеіі штаммов, происходящих из разных регионов мира. Это может свидетельствовать о том, что данный вид представляет собой комплекс популяций, находящихся на ранних этапах процесса видообразования.
1.2.3. Saccharomyces bay amis
К биологическому виду S. bayanus (syn. S. uvarum) относятся криофильные, как правило сбраживающие мелибиозу, винные дрожжи Saccharomyces (Naumov, 1996). На основании данных ДНК-ДНК реассоциации, дрожжи S. bayanus были выделены в самостоятельный вид, имеющий низкую (30-40%) гомологию генома с видом S. cerevisiae (Bicknell, Douglas, 1970; Rosini et al., 1982; Vaughan Martini, Kurtzman, 1985; Vaughan Martini, Martini, 1987). Результаты сравнительного генетического изучения дрожжей S. bayanus подтвердили их видовой статус. При скрещивании штаммов S. bayanus с генетическими тестерами видов S. cerevisiae и S. paradoxus, образующиеся межвидовые гибриды были стерильны, тогда как внутривидовые обладали нормальной выживаемостью аскоспор с регулярным мейотическим расщеплением контрольных ауксотрофных маркеров (Наумов, Никоненко, 1987).
Применение генетических и молекулярных методов исследования показало значительную гетерогенность вида S. bayanus. На основании рестриктазного анализа ПЦР-амлифицировашюго района IGS2 рДНК дрожжи S. bayanus были дифференцированы на две группы (Nguyen et al., 1997). В одну вошли типовые культуры S, bayanus, S. giobosus, S. heterogenicus, S. intermedins var. valdensis и S. inusitatus, а в другую — типовые культуры S. uvarum, S. abuliensis и многочисленные винные штаммы S. bayanus (S. uvarum). Эти две группы отличались также и по своим хромосомным профилям. У штаммов, входящих о группу "bayanus" в районе 245-370 т. п. н. имеется три или четыре хромосомы, а не две, как у штаммов группы "uvarum". Rainieri et al (1999) изучили ряд физиологических характеристик у представителей групп "bayamis" и "uvarum"' и на основании полученных данных предложили восстановить вид
S. uvarum. Однако, типовые культуры S. bayanus CBS 380 и S. uvarum CBS 395 имеют 98% ДНК-ДНК реассоциации и не могут рассматриваться как отдельные виды (Vaughan Martini, Kurtzman, 1985). Гибридологическим анализом установлена частичная генетическая изоляция между штаммами этих двух групп. На этом основании было предложено рассматривать их как разновидности S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. uvarum (Наумов, 2000).
В отличие от многих штаммов S. bayanus, у типовой культуры этого вида (CBS 380) были обнаружены теломерные последовательности дрожжей S. cerevisiae (Naumov et al., 1992; Nguyen et al., 2000). Nguyen.et al. (2000) высказали предположение, что типовая культура S. bayanus CBS 380 вероятно имеет гибридное происхождение и содержит части геномов S. cerevisiae и S. uvarum. Штамм CBS 380 выделен в условиях пивоварения и обладает некоторыми генетическими особенностями. Так, Kaneko и Ваппо (1991) исследовали хромосомные кариотипы большого количества штаммов S. bayanus и установили, что типовая культура этого вида представляет собой анеуплоид 2п+3, содержащий три дополнительные хромосомы размером 500, 570 и 620 т.п.н. Известно, что многие производственные штаммы S. cerevisiae являются анеуплоидными. Кроме того, штамм CBS 380 не способен сбраживать мелибиозу, что нехарактерно для дрожжей S. bayanus. Тем не менее, он имеет "молчащую" последовательность тег и может ревертировать к фенотипу Mel+(GilIiand, 1969; Turakainen et al., 1993b).
1.2.4. Saccharomyces pasforianus
Существует два типа пивоварения: верховое (производство эля), в котором принимают участие дрожжи S. cerevisiae и низовое. Пивные дрожжи низового брожения представлены таксоном S. paslorianus, имеющим гибридное происхождение.
Гибридная природа дрожжей S. pasiorianus впервые была обнаружена в опытах по переносу отдельных хромосом S. pastorianus в геномы
лабораторных штаммов S. cerevisiae, проведенных в Карлсбергской лаборатории (Nilsson-Tillgren ct al., 1980, 1981), а позднее подтвердилась опытами по ДНК-ДНК реассоциации (Vaughan Martini, Kurtzman, 1985; Vaughan Martini, Martini, 1987). Все проанализированные штаммы S. pasiorianus имели 19-72% ДНК-ДНК реассоциации с S. cerevisiae и 57-78% -с і?, bayanus.
Впоследствии гибридное происхождение пивных дрожжей низового брожения было подтверждено пульс-электрофорезом хромосомных ДНК (Наумова и др., 1991), рестриктазным анализом и Саузерн-гибриднзацией тотальной ДНК (Pedersen, 1986), а также сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей некоторых генов (Hansen, Kielland-Brandt, 1994; Хїе, Jimenez, 1994; Fujii et al., 1996; Borsting et al., 1997). Bee полученные данные указывали на то, что одним из родителей данного таксона являются дрожжи S. cerevisiae. Однако в отношении таксономического статуса второго родителя имеется два различных мнения.
Некоторые авторы (Vaughan Martini, Kurtzman, 1985; Vaughan Martini, Martini, 1987; Fujii et al, 1996; Tamai et al., 1998; Yamagishi, Ogata, 1999) считают, что вторым родіггелем S. pastorianus являются дрожжи S. bayanus. Другого мнения придерживаются, в частности, исследователи из Карлсбергской лаборатории (Дания), долгое время занимающиеся генетикой пивных дрожжей (Pedersen, 1986; Casey, Pedersen, 1988; Hansen, Kielland-Brandt, 1994; Kiel land-Brandt et al., 1995; Andersen et al., 1999). Они рассматривают в качестве второго родителя S. pastorianus * дрожжи S. monacensis, также выделенные из пива.
Yoshimoto et al. (1998) провели исследование генов алкогольацетилтрансферазы (ATF) и установили, что дрожжи S. pasiorianus содержат два гена ATF-ATF1 и Lg-ATFJ, происходящие от S. cerevisiae и S. bayanus, соответственно. Аналогичная ситуация наблюдалась и при изучении генов ATF типового штамма S, monacensis. В результате авторы пришли к заключению, что вид S. monacensis должен рассматриваться как синоним S. pastorianus, а не как один из его родителей.
При изучении типовых штаммов S. pastorlanus, S. carlsbergcnsis и S. monacensis было показано, что только последние два штамма содержат хромосомы как S. cerevisiae, так и S. bayanus. Что касается типового штамма & pastorianus CBS 1538, то в его геноме были обнаружены только хромосомы, характерные для S. bayanus (Yamagishi, Ogata, 1999). В свое время, основываясь на данных ДНК-ДНК реассоциации, Kaneko и Ваппо (1991) предположили, что типовой штамм S. pastorianus CBS 1538 должен рассматриваться как S. bayanus, так как он обладает высоким сходством (96%) с типовой культурой S. bayanus CBS 380. Принимая во внимание данные по ДНК-ДНК реассоциации и собственные результаты, Yamagishi и Ogata предложили классифицировать пивные дрожжи низового брожения как S. carlsbergensis, а не S. pastorianus.
Joubert et al. (2000) изучили пивные дрожжи S. pastorianus с помощью метода двумерного (2D) гель-электрофореза. Авторы подтвердили гибридную природу таксона S. pastorianus и то, что одним из его родителей является S. cerevisiae. В качестве второго родителя рассматривался пивной штамм NRRL Y-1551, таксономическое положение которого осталось неясным. Позднее, на основании результатов ПЦР-аналнза, Саузерн-гибридизации с субтеломерными последовательностями ДНК н сравнения нуклеотидпых последовательностей генов HIS4, METJO, URA3 и МЕТ2 этот штамм был отнесен к виду S. bayanus (Casaregola et al., 2001).
Краткая история классификации
Краткая история классификации
Впервые название рода Saccharomyces, как и вида Saccharomyces cerevisiae было дано Меуеп (1838) при описании пивных дрожжей, Reess (1870) определил рад Saccharomyces как группу дрожжей, размножающихся в основном почкованием, но в определенных условиях способных образовывать аски, содержащие от одной до четырех аскоспор. Позднее Hansen (1883, 1888, 1908) ввел технику чистых культур и дал первое полное описание дрожжей-сахаромицетов, назвав пивные дрожжи верхового брожения S. cerevisiae, а низового — S. carlsbergensis. В дальнейшем род Saccharomyces подвергался многочисленным ревизиям. История этих ревизий подробно изложена в обзоре Barnett (1992). Остановимся лишь на ключевых моментах систематики дрожжей Saccharomyces.
Первый определитель дрожжей был опубликован Guilliermond (1914). Род Saccharomyces в нем представлен 46 видами, разделенными на шесть групп. Stelling-Dckker (1931) в своей работе по аскоспоровым дрожжам, включила в род Saccharomyces только 23 вида, разделив их на два подрода: Saccharomyces и Zygosaccharomyccs. Lodder и Kreger-van-Rij (1952) признали большинство из этих 23 видов и дополнительно включили в род Saccharomyces некоторые виды родов Debaryomyces и Torulaspora. Основной причиной, позволившей авторам объединить данные роды в один, стало их ошибочное представление о неразличимости жизненного цикла диплонтов и гаплонтов. Род Saccharomyces в этом определителе включал в себя 30 видов.
Однако, классификация дрожжей, предложенная Lodder и Kreger-van-Rij (1952) была принята не всеми таксономлстами. Так, в определителе дрожжей, составленном Кудрявцевым (1954), род Saccharomyces состоит всего из 18 видов. Согласно Кудрявцеву, в составе рода Saccharomyces оставлены только дрожжи-дпплонты с сильно выраженной способностью сбраживать различные сахара и накапливать большое количество этанола. van der Walt (1970) увеличил число видов рода Saccharomyces до 41. Он разделил данный род на четыре группы видов по морфологическим и физиологическим свойствам. В первую группу были объединены виды-диплонты, характеризующиеся активной ферментацией Сахаров: Saccharomyces sensu stricto. К остальным трем группам отнесены виды, неродственные S. cerevisiae.
Позднее в многочисленных работах была продемонстрирована мутационная, комплементационная и комбинативная изменчивость биохимических признаков дрожжей (Scheda, Yarrow, 1966, 1968; Наумов, Юркевич, 1970). Это свидетельствовало о необъективности видовой дифференциации дрожжей, построенной на способности утилизировать различные сахара. В результате, все представители группы Saccharomyces sensu stricto были объединены в один вид Saccharomyces cerevisiae. В определителе дрожжей под редакцией Krcger-van-Rij 1984), род Saccharomyces насчитывал только 7 видов: S. cerevisiae, S. dairensis, S. exiguus, S. kluyveri, S. servazzii, S. telluris и S. unisporus. К синонимам S. cerevisiae были отнесены более 80 видов дрожжей (Yarrow, 1984).
Впервые гибридологический анализ в таксономии дрожжей применил датский ученый Winge (Winge, Lausten, 1939). Он предложил использовать способность к скрещиванию и оценку выживаемости аскоспор гибридов в качестве критерия дифференциации видов вігутри рода Saccharomyces. Для контроля предлагалось изучать выживаемость аскоспор родительских штаммов. Однако, дальнейшие исследования, проведенные в других лабораториях, показали, что многие природные и, в особенности, промышленные штаммы дрожжей часто обладают низкой выживаемостью аскоспор вследствие многочисленных генетических факторов, таких как полиплоидия, анеуплоидия, рецессивные летали, делецни, траислокации и инверсии, присутствующие в гетерозиготном состоянии. В этом случае родительские споры генетически разпокачественны и их суммарная выборка не может характеризовать споры, взятые в скрещивание. Объективная оценка родства между штаммами возможна только при использовании в генетическом анализе специально созданных инбредных линий дрожжей с высокой выживаемостью аскоспор (Наумов, 1997). В случае гомоталличных штаммов дрожжей такие линии создаются путем моноспорового клонирования, тогда как для гетероталлнчных штаммов необходимы вігутритетрадньїе скрещивания. Моноспоровое клонирование приводит к элиминации летальных факторов и существенно повышает выживаемость аскоспор.
В рамках гибридологического анализа классификация и идентификация дрожжей должна осуществляться на основании ряда генетических принципов (Наумов, Никоненко, 1987). Способность дрожжей к скрещиванию указывает на их принадлежность к одному роду, а жизнеспособность аскоспор — продуктов мейоза и регулярное мейотическое расщепление контрольных ауксотрофных маркеров свидетельствуют о принадлежности штаммов к одному биологическому виду. Для гибридов различных видов одного рода характерна стерильность.
С использованием метода гибридологического анализа были описаны три биологических вида рода Saccharomyces: S. cerevisiae, S. paradoxus и S. bayanus (Наумов и др., 1983; Naumov, 1987, 1996).
Роль крупных хромосомных перестроек в процессах видообразования дрожжей
Одним из механизмов видообразования являются крупные хромосомные перестройки. Например, реципрокные транслокации способны индуцировать образование мультивалентов во время мейоза. В этом случае при расхождении хромосом часто формируются анеуплоидные гаметы и, следовательно, снижается фертильность гибридов. Пульс-электрофорез хромосо.мных ДНК и последующая Саузерн-гибридизация с генами, локализованными на разных хромосомах, позволили установить размеры и порядок гомеологичных хромосом у дрожжей рода Saccharomyces. Число хромосом (п=1б) является одинаковым у всех видов этого рода.1 При карнотипическом анализе большого количества штаммов дрожжей-сахаромицетов было обнаружено что, по крайней мере, четыре хромосомы S. bayanus имеют другие размеры, чем гомеологичные хромосомы S. cerevisiae (Наумов и др., 1990; Naumov et al., 1992, 1994а). Позднее было установлено, что хромосомы II и IV дрожжей S. cerevisiae перестроены в хромосомы 12 и 14 у S. bayanus, за счет реципрокной транслокации в дуплицированном локусе RPL2 (Ryu et al., 1996, 1998b). Надо отметить, что авторы нумеровали хромосомы S, bayanus по возрастанию их молекулярных весов, в отличие от нумерации хромосом S. cerevisiae (согласно группам сцепления генов). Всего в настоящее время у вида S. bayanus описаны три реципрокные и одна нереципрокная транслокации (Fischer et al., 2000). Четыре реципрокные транслокации обнаружены у дрожжей S. сагіосапш. Одна из них (между XVI и II хромосомами) вероятно произошла в результате эктопической рекомбинации между дуплицированными генами TEF1 и TEF2, нуклеотидные последовательности которых идентичны на 99%. У одного штамма S. mikatae была идентифицирована одна реципрокная транслокация, а у второго - две, одна из которых затрагивала уже транслоцнрованную хромосому (Fischer et al., 2000).
Таким образом, S. bayamis, S. cariocanus и S, mikatae обладают видоспецифичными кариотнпами. В то же время,, кариотипы дрожжей S. cerevisiae S. paradoxus и 5. kudriavzevii являются колинеарными (Naumov et al., 1992, 1994а, 2000а; Fischer et al., 2000). Следовательно, процесс видообразования у дрожжей не всегда связан с крупными хромосомными перестройками. В то же время, Delneri et al. (2003) установили, что реципрокные транслокации вызывают значительное снижение фертилыюсти межвидовых гибридов и, вероятно, являются одной из причин постзиготической изоляции видов. В данной работе" помощью генно-инженерных манипуляций у лабораторного штамма S. cerevisiae был так изменен молекулярный кариотип, что он стал колинеарным S. mikatae, сохраняя при этом 100%-ное сходство нуклеотидных последовательностей с дикими штаммами S. cerevisiae. При скрещивании полученных штаммов S. cerevisiae с S. mikatae образующиеся гибриды формировали жизнеспособные, хотя и преимущественно анеуплоидные споры. Другими словами, межвидовой барьер в данном случае в определенной степени исчезал.
Большую роль в процессах видообразования и эволюции дрожжей Saccharomyces могут играть и другие молекулярные механизмы, в частности дупликации и горизонтальный перенос генов.
Секвенирование полных геномов дрожжей рода Saccharomyces (Goffeau et al., 1996; Bon et al., 2000; Kellis et al., 2003) дало возможность изучать эволюцию этих организмов на принципиально новом уровне. В геноме дрожжей S. cerevisiae было обнаружено 55 душшцированных районов, включающих в себя несколько сотен пар гомологичных генов (Wolfe, Shields, 1997; Wong et al,, 2002). Локализация дуплицированных генов позволила авторам высказать предположение о том, что геном дрожжей S. cerevisiae сформировался в результате предковоП дупликации, а затем, в процессе эволюции, подвергся многочисленным перестройкам и потере отдельных генов. Обнаружено, что все шестнадцать центромер дрожжей S. cerevisiae, по-видимому, образовались путем дупликации восьми исходных центромер (Lalo et а!., 1993; Wong et al., 2002). Тот факт, что все виды рода Saccharomyces имеют одинаковое число хромосом, свидетельствует о том, что их дивергенция друг от друга происходила уже после дупликации генома. Сравнительный анализ дуплицированных генов у некоторых видов этого рода показал, что в процессе видообразования каждая пара гомологичных генов изменялась независимо (Langkjaer et al., 2003). На ориентацию іі/или локализацию отдельных генов или их фрагментов влияют крупные хромосомные перестройки, такие как транслокации, делении, дупликации и инверсии. Дополнительно, в процессе эволюции могла происходить потеря отдельных копий дуплицированных генов. Потери генов в основном обусловлены накоплением мутаций внутри кодирующей области. В некоторых случаях следы присутствия предкового гена Достатки") могут быть обнаружены на нуклеотидном уровне (Fischer et al., 2001). С другой стороны, быстрая эволюция одной- из копий дуплицированного гена может приводить к приобретению им повой функции (Piskur, Langkjaer, 2004).
Помимо дупликации всего генома, некоторые гены в ходе эволюции подвергались независимым дупликациям. Подобные дупликации описаны преимущественно для теломерных районов хромосом, которые являются наиболее вариабельными (Piskur, Langkjaer, 2004).
Полимерные гены, контролирующие ферментацию а-м етил глю коз ида и растворимого крахмала
Сбраживание а-метилглюкозида (а-мгл) у дрожжей S. cerevisiae контролируется сложной многокомпонентной системой, включающей пять комплементарных генов: MGLa, MGLb, MGLc, MGLd и MGLe. Гены MGLa, MGLb \i MGLc вероятно выполняют регуляторные функции, a MGLd и MGLe являются структурными генами а-метилглюкозндазы и пермеазы а-мгл, соответственно. Было показано, что природные штаммы дрожжей могут обладать одним или несколькими полимерными генами серий MGLa, MGLd п MGLe (Наумов, Башкир о ва, 1984а; Башкирова, 1986). Установлено также, что в детерминации сбраживания а-метилглюкозида принимают участие мальтозные гены MAL(f и malx (Наумов, Башкирова, 19846).
Семейство полимерных генов, контролирующих ферментацию растворимого крахмала (гены STA), впервые было описано у дрожжей S. cerevisiae (syn. S. diastaticus) (Tamaki, 1978). Это семейство представлено тремя высокогомологичными структурными генами: STA1 (локализован в хромосоме IV), STA2 (в хромосоме II) и STA3 (в хромосоме XIV), каждый из которых кодирует одіту из изоформ (GAI, GAII и GAIII, соответственно) внеклеточной глюкоамилазы (Pretorius, Mannur, 1988; Bignell, Evans, 1990; Pretorius et al., 1991; Козлов и др., 2002). Надо отметить, что гены STA отсутствуют у многих штаммов S. cerevisiae. Однако Саузерн-гибриднзация р зондом STA1 свидетельствует о том, что геномах дрожжей S. cerevisiae, не способных ферментировать растворимый крахмал и, следовательно, не имеющих активных генов STA, содержатся последовательности ДНК (SI, S2 и Asta), обладающие значительным сходством с отдельными районами гена STA1. Последовательности S1 и S2 были гомологичны 3 -концевому району гена STA1, a Asta - 5 -концевому району этого гена (Yamashita ct al., 1985а).
Авторы предположили, что рекомбинация между такими нефункциональными локусами SI, S2 и Asta может приводить к образованию активного гена STA (Yamashita et al., 1985a,b). Позднее было установлено, что последовательности SI и S2 связаны между собой и, вероятно, представляют один нефункциональный локус sta (Pretorius et al., 1986). Последовательность Asta, физически тесно связанная с геном STA1, впоследствии стала рассматриваться как ген SGA, кодирующий внутриклеточную глюкоамилазу, синтезируемую у дрожжей в период споруляции. Последовательности SI, S2 и SGA были картированы на хромосоме IX, S1 и S2 в ее правом плече, a SGA - в левом (Lambrechts et al., 1995). Хромосомная локализация SI, S2 и SGA и результаты сравнительного анализа их нуклеотидных последовательностей с последовательностью гена STAJ подтверждают предположение о том, что последний ген образовался в результате слияния SI, S2 и SGA (Yamashita et al., 1987). В дальнейшем, в процессе эволюции, очевидно, происходила транслокация гена STA в различные хромосомы дрожжей.
Р-Фруктозидазы - это ферменты, способные расщеплять p-D-O-фруктофуранозную связь в молекулах Сахаров и их производных. При этом остаток p-D-фру кто фуранозы (или его производное) переносится на молекулу акцептора, которой обычно является вода. Некоторые р-фруктозидазы способны использовать в качестве акцептора молекулы органических веществ, например углеводы и спирты. Субстратами р-фруктозидаз являются сахароза, раффиноза, стахиоза, и другие олиго- и полисахариды. Р-Фруктозидазы, не способные катализировать трансферазиую реакцию и использующие в качестве субстрата только низкомолекулярные вещества, называются сахаразами [К.Ф.3.2.1.26], их подразделяют на инвертазы и сахарозо-б-фосфат-гидролазы, соответственно, по отсутствию или наличию способности расщеплять фосфор ил про ваш юе по глюкозному остатку производное сахарозы (Enzyme Nomenclature, 1984).
На основании анализа аминокислотных последовательностей ферменты, обладающие [і-фруктозидазной активностью, относят к семействам GH32 гликозил-гидролаз, представленному прокариотическими и эукариотическими сахаразами и фруктапазами и GH68, включающему в себя бактериальные левансахаразы (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей представителей этих семейств показал наличие у них сходных по структуре олигопептидных блоков, что позволило объединить семейства GH32 и GH68 в р-фруктозидазное суперсемейство (Наумов, Дорошенко, 1998). Несколько позднее в состав данного супсрсемейства было предложено включить также a-L-арабиназьт и p-D-ксилозидазы семейств GH43 и GH62 (Naumoff, 2001). Ферменты, принадлежащие к семействам GH32 и GH68, имеют также и одинаковый механизм реакции гидролиза — двойное замещение с сохранением аномерной конфигурации p-D-фруктофуранозного остатка (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).
Известно, что для осуществления реакции гидролиза гликозидной связи необходимо наличие в активном цеіггре фермента донора нона водорода и нуклеофила. Rcddy и Maley (1990) изучали роль ряда аминокислотных остатков дрожжевых инвертаз в каталитических процессах при помощи сайт-направленного мутагенеза и установили, что остаток Asp23 является важным компонентом активного центра и играет роль нуклеофила. Позднее эти авторы обнаружили еще один важный компонент активного центра инвертаз дрожжей — аминокислотный остаток Glu204, выступающий в качестве донора протона (Reddy, Maley, 1996). Указанные аминокислотные остатки являются высококонсервативными и присутствуют в р-фруктозидазах различного происхождения (Reddy, Maley, 1996; Наумов, Дорошенко, 1998; Pons et al., 1998). Более того, Pons ct al. (1998, 2004) предположили, что остаток
Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Саузерн-гпбрндизация хромосом дрожжей
Выделение интактнон хромосомной ДНК. Дрожжи выращивали в 10 мл жидкой YPD среды (г/л: глюкоза - 20, пептон - 20, дрожжевой экстракт -10) при 28С в течение 12-16 часов. Дрожжи осаждали центрифугированием и осадок промывали раствором ЭДТА/трис (50 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 7.5), затем суспендировали в 0.2 мл раствора ЭДТА/трис, содержащего мкг/мл энзиматического препарата Novozym 234 (Novo Industri A/S, Дания). К полученной клеточной суспензии добавляли 0.8 мл 1% легкоплавкой охлажденной до 38-42С агарозы (Bio-Rad, США). Получешгую смесь выдерживали на льду в течение 30-60 мин. Агарозные блоки инкубировали в 1 мл раствора ЭДТА/трис (0.5 М ЭДТА, 10 мМ трис) в течение 8 ч при 37С. Затем инкубировали в буфере, содержащем 0.5 М ЭДТА, 10 мМ трис (рН 7.5), 1% N-лаурол-саркозин (рН 9.5), 2 мг/мл протеиназы К при 50С в течение 8-10 ч. Агарозные блоки промывали в растворе ЭДТА/трис (50 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 7.5) и хранили в этом же буфере при 4С.
Пульс-электрофорез. Разделения хромосомных ДНК осуществляли на аппаратах CHEF-DRII и CHEF-DR III (Bio-Rad, США) при 200 В. В обоих случаях в качестве буфера использовали 0.5 х ТВЕ (45 мМ трис, 10 мМ ЭДТА, 45 мМ борная кислота), который охлаждали до 14С,
Пульс-электрофорез штаммов Saccharomyces проводили в 1%-ном агарозном геле с использованием двуступенчатой программы: I) 15 часов при времени переключения полей 60 с, 2) 9 часов при времени переключения полей 90 с.
После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 1-2 часов, промывали в дистиллированной воде и фотографировали в УФ свете.
Саузерн-гибридизация. Перенос хромосомной ДНК на нитроцеллюлозную мембраігу проводили капиллярным способом. ДНК фиксировали на мембране отжигом при 80С в течение 2 часов. В качестве зондов использовали ПЦР-амплифицированные фрагменты генов MEL1, MELJ2 и SUC2. ПЦР-продукты эллюировали из агарозного геля с помощью "GeneClean kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США). Для мечения ДНК применяли нерадиоактивную метку с использованием dUTP, меченного дигоксигенином (dig-11-dUTP) из набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I" ("Roche", Германия).
Гибридизацию проводили в гибридизационном буфере 5 х SSC (0.15М NaCl, 0.015М цитрат натрия, рН 7.0), содержащем 0.1 % N-лаурол-саркозин, 0.02 % SDS (додеішлсульфат натрия) и 1% блокирующий реагент, в течение 12-16 часов при 68С. После гибридизации фильтры сначала дважды отмывали в 2 х SSC, содержащем 0.1% SDS по 10 минут при комнатной температуре, а затем дважды по 15 минут при 68С в 0.1 х SSC, содержащем 0.1% SDS. Проявление гибридизационных сигналов проводили по инструкции Roche (Германия) следующим образом. Фильтры промывали малеиновым буфером (0.1М малеиновой кислоты и 0.15М NaCl, рН 7.5). Инкубировали 30 минут в 100 мл 1%-го раствора блокирующего реагента в малеиновом буфере. Инкубировали еще 30 минут в 20 мл такого же раствора, содержащего 75 ед./л поликлональных овечьих антител к дигоксигенин-11-dUTP. Затем фильтры дважды по 15 минут отмывали в 100 мл малеинового буфера и помещали на несколько минут в 20 мл проявляющего буфера (0.1М трис-НСІ, 0.1М NaCl и 50мМ MgCl2 рН 9.5). После этого фильтры экспонировали в темноте в течение 4-10 часов в свежеприготовленнм проявляющем растворе, содержащем красители: шггросиний тетразолий (nitroblue tetrazolium salt) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат (5-bromo-4-chloro-3-indoIyl phosphate, toluidinium salt).
![Полиморфизмы [B]#32#1-адренорецептора и их роль в нарушении функции легких при атопической бронхиальной астме](/i/i/4354/407107.png "Полиморфизмы [B]#32#1-адренорецептора и их роль в нарушении функции легких при атопической бронхиальной астме Васьковский Николай Валерьевич")
