Введение к работе
Актуальность работы. Дрожжи широко распространены во многих экосистемах и играют важную роль в различных пищевых связях. Таксономически наиболее изучен род Saccharomyces, включающий биологические виды S. cerevisiae, S. arboricolus, S. bayanus, S. cariocanus, S. paradoxus, S. kudriavzevii и S. mikatae (Naumov et al., 2000; Kurtzman, 2003; Wang et Bai, 2008). Дрожжи S. cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, у которого определена нуклеотидная последовательность генома (Goffeau et al., 1996). В геноме этих дрожжей обнаружено 55 дуплицированных блоков, включающих в себя несколько сотен пар гомологичных генов (Wolfe, Shields, 2007). Одинаковый порядок и ориентация паралогичных генов в дуплицированных блоках послужили доказательством того, что геном дрожжей S. cerevisiae сформировался в результате дупликации и последующих массовых хромосомных перестроек и делеционных потерь отдельных генов. За последнее десятилетие проведено секвенирование полноразмерных геномов еще более 20 видов аскомицетовых дрожжей. Сравнительный анализ геномных последовательностей ряда видов дрожжей показал, что полная дупликация восьми предковых хромосом у дрожжей S. cerevisiae произошла после их расхождения с дрожжами Kluyveromyces waltii (Kellis et al., 2004).
Молекулярно-генетическое изучение одного из ближайших родственников дрожжей Saccharomyces — рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt показало, что этот род очень гетерогенен и содержит ряд дрожжей не находящихся в близком родстве между собой и с типовым видом рода - К. polysporus (Cai et al., 1996; Naumov, Naumova, 2002; Kurtzman, 2003; Kurtzman, Robnett, 2003). В то же время обнаружена небольшая группа видов из различных родов (Zygosaccharomyces cidri, Z. fermentati, К. thermotolerans, К. waltii, S. kluyveri), имеющих в той или иной степени близкие рибосомальные последовательности. На базе пяти указанных видов был образован новый род Lachancea (Kurtzman, 2003). Недавно описаны еще два новых вида L. meyersii (Fell et al., 2004) и L. dasiensis (Lee et al., 2009).
Помимо дупликации всего генома в ходе эволюции дрожжей S. cerevisiae происходили множественные дупликации отдельных хромосом, сегментов хромосом и отдельных генов. В геноме дрожжей Saccharomyces гены, представленные большим числом копий, образуют мультигенные семейства. Гены рибосомальной РНК расположены на XII хромосоме по типу тандемных повторов, образуя последовательность ген-спейсер-ген-спейсер. Гаплоидный геном дрожжей S. cerevisiae содержит примерно 120-200 наборов генов рРНК (Maleszka, Clark-Walker, 1993). Упорядоченная структура рРНК и единообразие последовательностей в повторах сохраняются за счет так называемой
"концертной" эволюции, при которой тандемные повторы ("члены одного оркестра") эволюционируют как единое целое (Nei, Rooney, 2005). При этом происходит гомогенизация тандемных повторов, так как возникающие мутации элиминируются или распространяются по другим повторам за счет неравного кроссинговера или генной конверсии. В настоящее время анализ последовательностей рРНК является одним из наиболее используемых методов определения родственных отношений дрожжей, как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях (Valente et al., 1999; Kurtzman, 2000; Suh et al., 2006). Сравнительный анализ домена D1/D2 гена 26S рРНК позволил разделить все аскомицетовые виды дрожжей на 10 клад; дрожжи родов Saccharimyces и Lachancea объединились в кладе "Saccharomyces" (Kurtzman, Robnett, 1998,2003).
Другой тип организации имеют рассеянные по геному не тандемные повторы. К числу таких мультигенных семейств относятся полимерные гены ферментации различных Сахаров дрожжей S. cerevisiae. Как правило, эти гены расположены в субтеломерных районах хромосом — наиболее динамичных участках дрожжевого генома (Kellis et al, 2003). Особый интерес представляют а-галактозидазные гены ферментации мелибиозы. а-Гапактозидазы [К.Ф.3.2.1.22] - широко распространенные ферменты, которые присутствуют у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у дрожжей. Среди дрожжей Saccharomyces и Lachancea известны как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы негативные по этому признаку. В отличие от Saccharomyces, род Lachancea практически не изучен.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции дрожжей рода Lachancea на материале штаммов различного экологического и географического происхождения. В этой связи в работе решались следующие задачи:
Сравнение геномов видов рода Lachancea с помощью пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК и анализа нуклеотидных последовательностей генов рРНК.
Идентификация а-галактозидазных генов ферментации мелибиозы и определение их хромосомной локализации у дрожжей Lachancea.
Определение нуклеотидной последовательности генов MEL дрожжей Lachancea и филогенетический анализ а-галактозидаз.
Скрининг штаммов Saccharomyces различного географического происхождения с целью обнаружения новых а-галактозидазных генов MEL.
Сравнительный анализ а-галактозидаз дрожжей клады "Saccharomyces".
Научная новизна и практическая значимость работы. На материале штаммов различного экологического и географического происхождения впервые исследован молекулярный полиморфизм дрожжей рода Lachancea. Обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L. thermotolerans и обладающий способностью ферментировать мелибиозу.
С помощью пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК изучены видовые особенности геномов дрожжей рода Lachancea. Установлено, что все виды этого рода имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8, тогда как предельные размеры хромосом у разных видов существенно отличаются. Наибольший диапазон размеров хромосомных полос отмечен у штаммов L. cidri (400-2800 т.п.н.), а наименьший - у L. waltii (1400-2800 т.п.н.).
Впервые изучены а-галактозидазные гены MEL у дрожжей рода Lachancea и установлена их хромосомная локализация у разных штаммов. Из восьми видов рода Lachancea штаммы Ме1+ не обнаружены только у двух видов: L. meyersii и L. waltii. Показано, что не сбраживающие мелибиозу штаммы не содержат даже молчащей последовательности MEL Обнаружено накопление полимерных генов MEL у представителей видов L. fermentati, L. cidri и Lachancea sp. Скрининг штаммов Saccharomyces не европейского происхождения позволил впервые обнаружить полимерные гены MELpl и MELp2 у дрожжей S. paradoxic. Сравнительный филогенетический анализ а-галактозидаз клады "Saccharomyces" показал видоспецифичность генов MEL аскомицетовых дрожжей.
Создана коллекция охарактеризованных молекулярными методами штаммов дрожжей Lachancea и Saccharomyces, которая может быть использована в фундаментальных и прикладных исследованиях.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Ш-ем Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (2004, Москва); Международной школе-конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия" (2005, Москва); 25-м Международном специализированном симпозиуме по дрожжам (2006, Хельсинки, Финляндия); 12-м Международном конгрессе по дрожжам (2008, Киев, Украина); V-м съезде ВОГиС "200 лет со дня рождения Дарвина (Москва, 2009). Диссертационная работа была апробирована на заседании секции генетики микроорганизмов Ученого совета ГосНИИгенетика 9 ноября 2009 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи и 5 материалов симпозиумов и конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть и обсуждение, а также заключение и выводы. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного
текста, содержат 31 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает 260 источников.
