Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Наследственный потенциал изменчивости ячменя по адаптивно важным признакам (обзор литературы) 9
1.1 Скороспелость и фотопериодическая чувствительность ячменя ю
1.2 Устойчивость ячменя к фитопатогенным грибам и насекомым із
1.3 Устойчивость ячменя к неблагоприятным эдафическим факторам 36
Глава 2 Условия, материал и методы исследований 45
2.1 Условия и климатические особенности районов проведения полевых экспериментов 45
2.2 Экспериментальный материал 49
2.3 Методы исследований 51
2.3.1 Изучение биологических признаков дагестанских ячменей 51
2.3.2. Оценка устойчивости ячменя к облигатным паразитам 53
2.3.3. Оценка устойчивости ячменя к гемибиотрофным грибам 56
2.3.4. Оценка устойчивости ячменя к насекомым 59
2.3.5. Оценка устойчивости ячменя к засолению почвы и токсичным ионам алюминия 60
2.3.6 Молекулярно-генетические методы 61
Глава 3 Результаты исследований 65
3.1 Полиморфизм ДНК дагестанских ячменей 65
3.2 Скороспелость и фотопериодическая чувствительность дагестанских ячменей 68
3.2.1 Скороспелость 68
3.2.2 Чувствительность к фотопериоду 72
3.3 Устойчивость дагестанских ячменей к вредным организмам и абиотическим стрессорам 78
3.3.1 Устойчивость ячменя к облигатным паразитам 78
3.3.2 Устойчивость ячменя к гемибиотрофным грибам g6
3.3.3 Устойчивость ячменя к насекомым 90
3.3.4 Устойчивость ячменя к абиотическим стрессорам 94 Заключение 96 Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список литературы
- Устойчивость ячменя к фитопатогенным грибам и насекомым
- Изучение биологических признаков дагестанских ячменей
- Оценка устойчивости ячменя к засолению почвы и токсичным ионам алюминия
- Устойчивость ячменя к облигатным паразитам
Устойчивость ячменя к фитопатогенным грибам и насекомым
Успехи мировой селекции ячменя связаны с экологической пластичностью культуры и ее высокой адаптивностью к местным условиям. Н.И. Вавилов (1957) отмечал, что вегетационный период является важнейшим сортовым экологическим свойством и во многом зависит от влияния на сорт климатических факторов. Выявлены различия сортов по скороспелости среди экологических групп ячменя, что связывается с разной степенью адаптации к природно-климатическим факторам (Лукьянова, 1958). Исследования генетических ресурсов ячменя в последнее время показывают, что ультраскороспелые и скороспелые формы сосредоточены в Центральном и Северо-Западном регионах России, в Сибири, странах Балтии, Скандинавии, Турции, Эфиопии, Индии (например, Батакова, 2009; Заушинцена, 2009).
Время колошения у ячменя в основном определяется тремя факторами: прежде всего, это гены, контролирующие тип развития, нечувствительность к фотопериоду и собственно скороспелость. Скороспелость контролируется четырьмя генами: Eaml {Ed), еат7 {еаТ), еат9 {еа,,с) и eamlO {easp), локализованными соответственно в хромосомах 2, 6, 4 и 3 (Franckowiak, Lundqvist, 2011).
Тип развития детерминируется тремя парами генов: sh, Sh2 и Sh3 (впоследствии обозначены как VRN-H1, VRN-H2, VRN-H3); любое сочетание этих генов ответственно за яровой тип развития. Гены Sh2 и Sh3 эпистатичны по отношению к доминантному аллелю Sh, а аллель sh имеет аналогичное влияние на рецессивные аллели озимого типа sh2 и sh3. Гены Sh, Sh2 и Sh3 локализованы в хромосомах 4 (4Н), 7 (5н) и 5 (Ш) соответственно. Рецессив по трем локусам под влиянием я/г-аллеля обусловливает развитие растений-двуручек. В локусе Sh2 существует серия аллелей {Sh2\ Sh2", Sh2"\ Sh2[V, Sh2v, Sh2VI), которая контролирует различные градации ярового типа развития от типично ярового до крайне озимого; в отсутствие генов sh и Sh3 последние имеют более слабый эффект на длину вегетации (Takahashi, Yasuda, 1956; 1971). Гены Vrn контролируют потребность растений в яровизации для перехода к колошению и, следовательно, принимают участие в регуляции скорости развития ячменя.
D.A. Laurie с соавторами (1994, 1995) идентифицировали 5 главных генов и 8 локусов количественных признаков (quantitative trait loci - QTL), контролирующих время колошения у ячменя. Среди них гены Ppd-Hl и Ppd-Hl (photoperiod response), локализованные в хромосомах 2 (2Н) и 5 (Ш) соответственно, а также контролирующие реакцию на яровизацию гены VRN-Ш и VRN-H2, локализация которых совпадает с положением идентифицированных ранее генов Sh и Sh2. В возделываемых сортах идентифицируют VRN-H1 и VRN-H2, аллель VRN-H3 редка.
Доминантный аллель Ppd-Hl контролирует быструю реакцию на удлинение фотопериода и раннее колошение в условиях длинного дня. Задержка колошения на длинном дне обусловлена рецессивным аллелем ppd-Hl (Laurie et al., 1995; Cockram et al., 2007; Casao et al, 2011). В результате сравнения последовательностей гена Ppd-Hl у различающихся по фотопериодической чувствительности образцов ячменя выявили 23 SNP (single nucleotide polymorphism), среди которых 7 меняли аминокислотный состав кодируемого регуляторного белка (Turner et al., 2005). Исследовали связь сроков колошения у 87 местных сортов ячменя из Европы при длинном и коротком дне с аллельным полиморфизмом Ppd-Hl. Для одной из 40 выявленных нуклеотидных замен (SNP48) была выявлена достоверная связь с исследовавшимся фенотипом ячменя. SNP15 (С/Т) обусловливает замену аминокислоты пролин (Ppd-Hl) на серии (ppd-Hl). На основе полученных данных авторы разработали аллель-специфичные праймеры для идентификации Ppd-Hl (Jones et al., 2008).
При коротком фотопериоде более раннее колошение контролирует доминантный ген Ppd-H2. Наиболее вероятным геном-кандидатом для локуса Ppd-H2 является HvFT3 (Faure et al., 2007; Kikuchi et al., 2009). Описаны доминантный и рецессивный аллели HvFT3; причем последний представляет собой усеченный и нефункциональный вариант структуры гена, фактически псевдоген. Доминантный аллель Ppd-H2 в условиях короткого дня ускоряет наступление колошения, рецессивный аллель обусловливает задержку колошения. Показано, что сорт Могех содержит интактный ген HvFT3 (доминантный аллель), включающий 4 экзона и 3 интрона, a HvFT3 у сорта Steptoe утратил почти всю структурную часть, кроме фрагмента одного из экзонов.
Сотрудниками ВИР у 91 сорта ярового ячменя, допущенного к использованию на территории России и Беларуси, с помощью аллель-специфичных молекулярных маркеров проанализировано аллельное состояние генов Vrn-Hl, Vrn-H2, Vrn-H3, Ppd-Hl и Ppd-H2. Показано, что сорта ячменя, имеющие доминантный аллель гена Ppd-Hl, достоверно опережают другие генотипы по скорости развития (колошению) и являются более скороспелыми при возделывании в условиях длинного светового дня. Среди изученного отечественного сортимента ячменей носители доминантного аллеля Ppd-Hl составили всего 9%. Аллели генов Vrn также оказывают достоверное влияние на продолжительность периода «всходы-колошение» изученных сортов. Среди генотипов, несущих одинаковые аллели генов Ppd-Hl и Ppd-H2, носители аллельной комбинации Vrn-Hlvrn-H2Vrn-H3 переходят к колошению достоверно раньше генотипов с другим сочетанием аллелей генов Vrn (Злотина и др., 2013).
Изучение биологических признаков дагестанских ячменей
Экспериментальная работа выполнена в 2012 - 2015 гг. в Пушкинских лабораториях ВНИИ растениеводства имени Н.И. Вавилова (ПЛ ВИР) и на Дагестанской опытной станции ВИР (ДОС ВИР).
Дагестанская опытная станция ВИР расположена в южной плоскостной зоне Дагестана у Каспийского моря, в 10 км южнее от г. Дербента. Станция находится ниже уровня моря на 17 м. Почвы каштановые, светло-каштановые; слабо и среднесолонцеватые; тяжело суглинистые.
Климат характеризуется мягкой и непродолжительной зимой (средняя температура января 1,4С), ранней затяжной весной, умеренно-жарким и сухим летом (средняя температура июля 24,9С) и теплой влажной осенью. Осадки выпадают преимущественно в осенне-зимний период, конец весны и летние месяцы сухие. Для осени и зимы характерны сильные северные ветры, весной преобладают приморско-береговые ветры. По средним многолетним данным, за год выпадает 400-500 мм мм осадков, а испарение составляет около 1000 мм. Близость моря, искусственное орошение обусловливают постоянно высокую относительную влажность воздуха, которая в самом жарком месяце - июле, как правило, не ниже 67% Сумма активных температур за год составляет 3400-4500С.
Климатические условия в годы исследований различались как по температурному режиму, так и по влагообеспеченности. В целом они благоприятствовали возделыванию ячменя, но в ряде случаев отмечены аномалии (рис. 2.1.1., 2.1.2). Так, зимой 2012 - 2013 гг. выпало рекордное количество осадков, а весной 2012 гг. отмечена сильная засуха. Температурный режим значительно более выровнен в сравнении с суммой осадков. ;:
Сумма осадков на ДОС ВИР в 2012-2014 гг. Пушкинские лаборатории ВИР, которые являются одной из основных научно-экспериментальных баз института, расположены в г. Пушкине, в 30 км от Санкт-Петербурга. Почвы дерново-подзолистые, легкосуглинистые, супесчаные, хорошо или среднеокультуренные, с глубиной перегнойного горизонта 23-47 см. Являясь легкими по механическому составу, эти почвы имеют хорошую влаго- и воздухопроницаемость и низкую влагоемкость. Органические вещества в них быстро минерализуются, а питательные вещества вымываются и уносятся с водой. Содержание гумуса 3-4%. На большей части площадей почвы имеют нейтральную и слабокислую реакцию.
Благодаря влиянию Финского залива и Ладожского озера, климатические условия региона характеризуются переходом морского климата в слабо континентальный. Зима умеренно-холодная, лето умеренно-теплое и влажное. Сумма активных температур 1600-2000С.
Среднегодовое количество осадков 500-600 мм, 65-75% из которых выпадает в теплое время года. В теплый период, с мая по сентябрь, выпадает 425 мм, или 70% годового количества осадков. Обычно в мае и июне осадков бывает недостаточно, а к концу лета идет их увеличение.
Зимой снеговой покров доходит до 31-80 см, но бывают как многоснежные, так и малоснежные зимы. В то время как в октябре-ноябре температура может снижаться до -20С-23С, толщина снежного покрова колеблется в пределах 10-17 см. Такое же положение наблюдается в апреле, когда снег почти сходит, а температура нередко снижается до -21 С. В этих условиях нередко наблюдается выпирание и вымерзание посевов и насаждений.
В течение 2012-2014 гг. температура воздуха была выше в сравнении со среднемноголетней, относительная влажность воздуха - также несколько повышенная (рис. 2.1.3, 2.1.5), варьирование этих признаков незначительно. В то же время сумма осадков варьировала существенно (рис. 2.1.4). Так, в июне 2014 г. сумма выпавших осадков значительно превышала норму, в июле отмечена засуха. В июле 2012 г. также наблюдали засуху, тогда как июль 2013 г. характеризовался существенным превышением среднемноголетней нормы осадков. Таким образом, период экспериментальной работы охватил годы с различной динамикой гидротермического режима.
Материал для исследований получен из отдела генетических ресурсов овса, ржи и ячменя ВИР. Исследовали 282 образца из Дагестана (200 -яровых, 81 - озимых, 1 - двуручка), среди которых преобладали местные формы (239 образца); сорта и селекционные линии были представлены 43 образцами. Образцы местного ячменя собраны в экспедициях по Дагестану, которые проводились в 1901-1917 гг. (7 образцов), 1918-1941 гг. (103 образца) и 1946-1981 гг. (129 образцов). Собранные формы относятся к двум подвидам: ячмень шестирядный (subsp. vulgare) и двурядный (subsp. distichori), представлены 29 разновидностями. Ряд образцов при регистрации их в коллекции ВИР представляли собой популяции, которые включали до 5 разновидностей.
Большинство образцов (106) собрано в горном территориальном округе республики (рис. 2.2.1), значительно меньше - в южном (44), центральном (10) и северном (11) округах. Сведения о месте сбора 68 образцов отсутствуют. Селекционный материал представлен 23 линиями и 20 сортами, среди которых лишь 3 стародавних сорта отобраны исключительно из местных ячменей. Изучили также 39 линий ячменя, несущих ранее идентифицированные гены устойчивости к мучнистой росе, 37 линий, защищенных известными генами устойчивости к возбудителю карликовой ржавчины, а также 15 почти изогенных линий с генами устойчивости к ринхоспориозу и универсально восприимчивый сорт Cambrinus из Голландии.
При изучении коллекции на полях ДОС ВИР в качестве стандартов использовали районированные в республике сорта ярового - Темп (к-22055, Краснодарский край) и озимого - Дагестанский 239 (к-15240, Дагестан), Циклон (к-26049, Краснодарский край), Завет 3 (к-21905, Краснодарский край), Виктория (к-26894, Румыния) ячменя. В ПЛ ВИР стандартом служил сорт ярового ячменя Белогорский. Кроме того, при изучении устойчивости хозяйственно ценных признаков дагестанских ячменей в лабораторных экспериментах использовали контрольные сорта, которые упомянуты в разделе 2.3. В «Методах исследований» приводятся исследовавшиеся популяции вредных организмов, а также выделенные из них изоляты.
Оценка устойчивости ячменя к засолению почвы и токсичным ионам алюминия
На ДОС ВИР оценили также 39 линий ячменя, несущих ранее идентифицированные гены устойчивости к мучнистой росе. Среди них образцы к-30225, несущий ген mloll, и к-31011 {Міа і) характеризовались наиболее высокой устойчивостью в 2013 г. (9 баллов); поражение 13 линий составило 7 баллов (табл. 3.3.1.2).
В лаборатории при искусственном заражении интактных растений оценили ювенильную устойчивость к северо-западной популяции гриба двух выделенных форм и 47 линий с известными генами устойчивости. Оба образца оказались гетерогенны по изучаемому признаку. Поражение устойчивых растений (88% от числа изученных) образца к-28212 составляло 7-9 баллов, уровень экспрессии устойчивого компонента (80% растений) образца к-23787 несколько ниже: 5-7 баллов. Практически не поражались грибом 11 линий с известными генами устойчивости к грибу, 2 формы оказались гетерогенными (табл. 3.3.1.2).
С помощью молекулярных маркеров, разработанных P. Piffanelli с соавторами (2004), у образцов к-23787 и к-28212 обнаружили растения, несущие рецессивные (функциональные) аллели mloll (рис. 7). Семнадцать из 26 проанализированных растений образца к-28212 были гомозиготны по рецессивному аллелю mloll, 9 растений несли доминантные аллели в гомозиготном состоянии. Среди 34 растений образца к-23787 обнаружили одно гетерозиготное по аллелям локуса mloll растение. Тем не менее, это растение и ряд других характеризовались устойчивостью к грибу, т.е. образец к-23787 защищен другим (другими) генами устойчивости.
Ген mloll был обнаружен у местных форм ячменя из Эфиопии и в настоящее время широко распространен в современных сортах (Piffanellietal., 2004). По сведениям отдела генетических ресурсов овса, ржи и ячменя ВИР, линия к-28212 получена с участием ярового ячменя из Эфиопии к-17554, а родословная образца к-23787 неизвестна. С помощью праймеров ADUP7, М1о6 и MlolO у образца к-17554 были обнаружены растения, несущие рецессивный аллель mloll, т.е. эта форма, вероятно, использовалась как донор при отборе линии к-28212 (рис. 3.3.1.2).
P. Piffanelli с соавторами (2004) провели анализ гаплотипов местных и современных сортов ячменя, а также образцов H.spontaneum, используя различные молекулярные маркеры, в том числе SNP смысловой части локуса Mlo. Эти авторы показали, что все современные европейские сорта, несущие рецессивный аллель mloll почти идентичны по исследованным признакам. Мы сравнили образец к-28212 и изогенную линию - носителя аллеля mloll. С помощью праймеров MloF и MloR амплифицировали фрагменты смысловой последовательности локуса. У изогенной линии с аллелем mloll (3 растения) и устойчивого дагестанского образца к-28212 (7 растений), секвенировали фрагмент длиной 530 пн. В последовательностях секвенированных фрагментов обнаружили различия по двум полиморфным сайтам (рис. 3.3.1.3). Были выявлены две замены нуклеотидов (Т-С и С-Т), а также полиморфизм между отдельными растениями, причем некоторые замены ранее в литературе не обсуждались
Семена инокулировали суспензией хламидоспор возбудителя каменной головни (Ustilago hordei (Pers.) Kell. et Swing.) за две недели до посева. Устойчивость оценивали в период выколашивания по шкале от 0 до 4 (поражено более 40% колосьев). На полях ПЛ ВИР в 2012 и 2014 гг. исследовали устойчивость к патогену 103 образцов ярового ячменя. Выделили 1 высокоустойчивый образец (к-23823), все колосья которого не были поражены грибом, слабо (до 20%) поражались 20 изученных форм. Устойчивость к патогену 81 образца озимого ячменя исследовали в Дербенте на искусственном инфекционном фоне. Выделили 45 образцов, колосья которых не были поражены грибом, 9 образцов проявили себя как устойчивые (поражение до 5%), слабо (до 20%) поражались 24 формы.
На фоне искусственного заражения в ПЛ ВИР изучили устойчивость 88 форм ячменя к возбудителю пыльной головни (Ustilago nuda (Jens) Kell. et Swing). Наиболее устойчив образец к-23830, у которого было поражено 7-9% растений (табл. 3.3.1.5), слабовосприимчивыми оказались 5 образцов. Поражение грибом восприимчивого контроля составило 100%.
Ринхоспориоз, или окаймленная пятнистость листьев (возбудитель -гемибиотрофный гриб Rhynchosporium secalis (Oudem.) J.J. Davis) - болезнь ячменя, широко распространенная во всех основных районах выращивания культуры. В результате лабораторных исследований выделили 44 устойчивых либо гетерогенных по этому признаку образца ячменя, которые оценили на инфекционном фоне в поле. Использовали смешанную споровую суспензию из 58 изолятов, выделенных из 3-х популяций R. secalis. Развитие болезни оценивали по шкале, где поражение до 2-х баллов соответствует реакции устойчивости, 3-5 - восприимчивости. Выделили 7 гетерогенных по устойчивости образцов (табл. 3.3.2.1).
Устойчивость ячменя к облигатным паразитам
В лаборатории изучили устойчивость 278 образцов ячменя к возбудителям сетчатой (Pyrenophora teres f. teres Drechsl.) и темно-бурой (Cochliobolus sativus Ito and Kurib.) пятнистостей. Наиболее высоким уровнем устойчивости (до 4-х баллов) к смеси изолятов С. sativus из северо-западной (С.-Петербург) популяции характеризовались 5 образцов, (табл. 3.3.2.2), 17 отнесены к ере днеу стойчивым.
В 2014 г. на полях ПЛ ВИР наблюдали естественную эпифитотию темно-бурой пятнистости (поражение восприимчивого контроля - 9 баллов). Оценили 204 образца ячменя, выделили 17 умеренно устойчивых образцов и 18 - умеренно восприимчивых. Устойчивостью в лабораторных и полевых условиях характеризовались 3 образца: к-15183, к-23822 и к-30084, у которых уровень экспрессии признака в лабораторных опытах выражался баллами 4,0 -4,5 (табл. 3.3.2.2).
В лабораторных опытах наиболее высокой устойчивостью к северозападной популяции P. teres teres обладали 7 форм (табл. 3.3.2.3), меньший уровень экспрессии признака выявлен у 18 образцов; к популяции гриба из Дагестана (г. Дербент) наиболее устойчивы 6 образцов (табл. 3.3.2.4), 8 образцов характеризовались несколько меньшим уровнем устойчивости. К обеим популяциям гриба устойчивы 3 образца ячменя (табл. 3.3.2.5).
Северо-западная и дагестанская популяции P. teres f. teres различаются по вирулентности и агрессивности (рис. 3.3.2.1). Так, образцы к-21760, к-25616, к-21816, к-21807, к-18180 устойчивы к северо-западной и восприимчивы к дагестанской популяции патогена, что свидетельствует о дифференциальном взаимодействии паразита и хозяина. Лишь 3 образца слабо поражаются двумя популяциями гриба. У 32-х образцов наблюдали различную экспрессию устойчивости. Например, образцы к-13232, к-18025, к-18171, к-18180, к-21807, к-25616 обладали высокой устойчивостью при заражении северо-западной популяцией гриба, однако при инокуляции дагестанской популяцией устойчивость была слабо выражена. «Более агрессивной» оказалась дагестанская популяция гриба. a
В результате исследований выделили 40 гетерогенных по устойчивости к обыкновенной злаковой тле образцов ячменя, поврежденность устойчивых компонентов у которых составляла 7-8 баллов. Образец местного ячменя к-21754 характеризовался несколько более высоким уровнем устойчивости к фитофагу (поврежденность растений 6-7 баллов). Выделившиеся формы могут иметь слабоэкспрессирующиеся гены устойчивости к обыкновенной злаковой тле либо в популяции фитофага присутствуют клоны с различной вирулентностью к изученным образцам ячменя.
Для проверки этого предположения изучили устойчивость шести выделившихся образцов (табл. 3.3.3.1) к 17 клонам тли из краснодарской популяции. Для этого опытные образцы и неустойчивый контроль (по 3-5 зерен) высевали в круговом порядке в сосуды с почвой и накрывали стеклянными изоляторами. В фазу второго листа проростки под изолятором заселяли данным клоном тли и при гибели контроля (сорт Белогорский) оценивали устойчивость по шкале. В силу ограниченного количества имевшихся в нашем распоряжении семян оценили поврежденность двух образцов лишь 11-ю клонами насекомого. Кроме того, 3 наиболее устойчивые формы заселили 20-ю клонами, выделенными из дагестанской (г. Дербент) популяции тли.
Оказалось, что верны оба предположения: наблюдали слабоэкспрессирующуюся устойчивость у всех образцов и отчетливо выраженную - у местного ячменя к-13232, причем оба типа устойчивости проявлялись лишь против части клонов тли (табл. 3.3.3.2). Три первых образца характеризуются устойчивостью примерно к 50% клонов из краснодарской популяции, однако при заселении этим форм дагестанской популяцией насекомого частоты вирулентности существенно меняются: образец к-13232 обладает устойчивостью к 70% клонов, а к-1067 и к-13992 -лишь к 35% и 22% соответственно. Таблица 3.3.3.2. Устойчивость образцов ячменя к клонам S. graminum
Образец Изученоклоновтли Частоты клонов, обусловливающих различную поврежденность (1-10 баллов)
Oscinella frit L. вредит на всходах и в период колошения. В первом случае повреждается стебель, во втором - колос. В Дагестане преобладает второй тип повреждения. При озимом и яровом посеве на естественном фоне изучили устойчивость 222 образцов ячменя к фитофагу. При озимом посеве в 2012-2013 гг. наиболее устойчивыми оказались образцы к-13988, к-1028, к-13233, к-13234, к-13991 (табл. 3.3.3.3).
В лаборатории оценили алюмоустойчивость 211 образцов ячменя. Длину зародышевых корней проростков, выращенных в растворе с содержанием 185 мкМ ионов алюминия (рН = 4,0), соотносили с длиной корней растений, выращенных в растворе без добавления солей алюминия (рН = 6,5). Наиболее высокие корневые индексы характерны для 9 образцов ярового ячменя (табл. 3.3.4.1). Для дагестанских ячменей характерен широкий спектр изменчивости по устойчивости, большинство (67%) образцов - среднеустойчивые формы. Использовали дополнительный тестовый признак - индекс длины ростка и также выявили значительную изменчивость по этому признаку. Образцы к-18172 и к-21808 имеют наиболее высокие индексы корня (0,92 и 0,97 соответственно) и ростка (0,97 и 0,98).
