Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА І.Обзор литературы 11
1.1 . Сохранение биологического разнообразия растений методами биотехнологии 11
1.2. Факторы, влияющие на процессы регенерации в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений 18
1.3. Модели регенерации растений в культуре in vitro 29
1.4. Основные этапы микроразмножения растений 45
ГЛАВА 2.Материал и методы исследования 61
ГЛАВА 3. Культура изолированных тканей редких и исчезающих видов растений
3.1. Adonis vernalis 71
3.2. Brachanthemum baranovii 76
3.3. Dendranthema sinuatum 90
3.4. Представители рода Fritillaria 100
3.5. Rhododendron ledebourii 104
CLASS ГЛАВА 4. Культура изолированных тканей уникальных форм и сортов растений AA.Actinidia chinensis CLASS 112
4.2. Allium сера 118
4.3. Begonia rex 127
4.4. Camellia sinensis 133
4.5. Представители рода Cerasus 147
4.6. Представитель рода Clematis 151
4.7. Daucus sativus 157
4.8. Представители рода Fragaria 166
4.9. Представители рода Grossularia 172
4.10. Представитель рода Hemerocallis 179
4.11. Представители рода Iris 182
4.12. Представители рода Malus 193
4.13. Представители рода Primula 202
4.14. Stevia rebaudiana 212
ГЛАВА 5. Адаптация растении-регенерантов к условиям выращивания ex vitro 218
ГЛАВА 6. Включение биотехнологических методов в систему сохранения и воспроизводства растительных ресурсов 233
6.1. Коллекции растений in vitro 233
6.2. Изучение регенерантов 238
6.3. Экономические аспекты применения методов биотехнологии 249
Выводы 260
Список литературы
- Сохранение биологического разнообразия растений методами биотехнологии
- Факторы, влияющие на процессы регенерации в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений
- Brachanthemum baranovii
- Представители рода Cerasus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сохранение биологического разнообразия -одна из важнейших задач в деле охраны природы, которой уделяют большое внимание во всем мире. Связано это с ограниченностью необходимых для существования человека биологических ресурсов и угрозой их истощения. С начала XX века исчезновение сортов, видов и даже родов происходит по экспоненте (Драгавцев, 1995; Коропачинский, 1997). Особую актуальность имеют исследования по разработке методов сохранения растений, ареалы и численность которых резко снижается, а также для уникальных форм, расширяющих и улучшающих сортимент возделываемых растений. Стратегия сохранения биологического разнообразия заключается в сохранении его in situ и ex situ. Наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ все большее значение приобретает использование для этих целей культуры изолированных тканей и органов (Камелин, 1997).
Привлечение методов биотехнологии, базирующихся на культивировании изолированных органов, тканей и клеток растений для решения проблем сохранения биологического разнообразия имеет преимущества перед традиционно используемыми подходами. Методы биотехнологии позволяют получать оздоровленный материал от пораженных вирусными и грибными болезнями растений, а также материал, свободный от нематод; осуществлять быстрое размножение ценного экземпляра растения; получать в больших количествах вегетативное потомство трудно размножаемых в обычных условиях видов и форм растений; работать в лабораторных условиях круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку; размножать растения без вывода их из ювенильной фазы; длительно хранить пробирочные растения и создавать «банк» ценных форм (Высоцкий, 1986).
Однако широкому использованию биотехнологий для многих видов и даже сортов растений препятствует то, что морфогенетический потенциал и регенерационная способность культивируемых тканей часто строго зависят от генотипа и условий культивирования. Отсутствие надежных способов адаптации регенерантов к условиям ex vitro приводит к значительной потере регенерантов и, в некоторых случаях, существенно снижает возможности использования биотехнологических методов, как для^ сохранения биологического разнообразия, так и для производства высококачественного посадочного материала ценных растений.
Следует отметить, что исследования в области культуры ткани для решения проблем сохранения генофонда растений имеют свои особенности. Довольно часто они связаны с отсутствием возможности свободного выбора объекта, а также дефицитом исходного материала нужного растения. Это, безусловно, оказывает влияние на постановку задач исследований, и, в некоторых случаях, позволяет решить их только эмпирическим путем.
Цель я задачи исследований. Основная цель исследований заключалась в
разработке и совершенствовании методов культурадсэддщрЯЦвЛУКЛй^ней
растений для использования в системе сохранения и воспроизвЬдства растительных ресурсов.
В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:
изучить влияние регуляторов роста на регенерационные процессы на стадиях собственно размножения и укоренения;
выявить роль типа экспланта и его видовой принадлежности в процессах регенерации растений в культуре in vitro;
определить модель регенерации, обеспечивающую наиболее высокую эффективность микроразмножения для конкретных видов растений;
установить влияние продолжительности культивирования изолированных тканей на их регенерационную способность;
усовершенствовать технику и приемы адаптации растений-регенерантов к условиям выращивания ex vitro;
определить место методов биотехнологии в стратегии мероприятий сохранения биологического разнообразия растений ex situ.
Научная новизна. Впервые изучен морфогенетический потенциал и предложены способы сохранения генофонда для редких и исчезающих видов флоры Алтая. В результате детального изучения процессов регенерации впервые разработаны эффективные способы микроразмножения для ряда уникальных новых форм и сортов растений, полученных или интродуцированных во ВНПОЧСК и ЧП (Грузия), в НИИ садоводства Сибири им. М.А.Лисавенко, в Южно-сибирском ботаническом саду Алтайского государственного университета. Показана целесообразность подбора основных питательных сред и регуляторов роста на каждом этапе микроразмножения. Усовершенствованы конкретные приемы адаптации регенерантов к условиям ех vitro с использованием гидропонных установок и впервые продемонстрирована их высокая эффективность для многих видов растений.
Эффективность использования методов биотехнологии в стратегии мероприятий сохранения биологического разнообразия связана с сокращением сроков получения необходимого количества растений за счет высокого коэффициента размножения в культуре in vitro, с сокращением используемых площадей под коллекциями, а также с возможностью более ранней комплексной оценки новых форм по хозяйственно-полезным признакам за счет ускорения роста и развития регенерантов в условиях открытого грунта. На защиту выносятся следующие положения:
-
Сохранение биоразнообразия редких, исчезающих видов представителей родов Adonis, Brachanthemum, Dendranthema, Frttillaria, Rhododendron, а также уникальных форм и сортов растений представителей родов Actinidia, Allium, Begonia, Camellia, Cerasus, Clematis, Daucus, Iris, Fragaria, Grossularia, Hemerocallis, Malus, Primula, Stevia, характеризующихся низкой способностью к воспроизводству в естественных условиях произрастания и/или при традиционных способах их размножения, достигается путем использования биотехнологических методов.
-
Повышение эффективности регенерационных процессов в культуре изолированных клеток, тканей и органов достигается за счет подбора
(минеральный состав) и модификации (регуляторы роста) питательной среды
для культивирования в зависимости от вида, формы или сорта растения.
3. Эффективность методов биотехнологии в системе сохранения
биоразнообразия и воспроизводства растительных ресурсов обеспечивается двухэтапным приемом адаптации регенерантов к условиям выращивания ex vitro на гидропонных установках «Минивит».
Практическая значимость. Для конкретных видов растений разработаны и усовершенствованы следующие методы регенерации in vitro:
- для Iris hybrida - метод эмбриокультуры;
для сортов и форм Camellia sinensis, гибридов рода Malus - методы регенерации растений в культуре изолированных тканей семядолей;
для Actinidia chinensis, гибрида №1 Primula х polyantha, Brachanthemum baranovii, Dendranthema sinuatum, Daucus sativus - методы регенерации в культуре каллуса от листьев, Allium сера - в культуре каллуса от завязей, а для трех видов рода Iris (I. ensata, I. sibirica, I hybrida) - в культуре каллуса от лепестков венчика цветка;
для Begonia rex - методы прямой регенерации в культуре изолированных эксплантов листьев и эксплантов чешуи луковиц для двух видов рода Fritillaria (F. meleagris и F. verticillata);
для Actinidia chinensis, двух форм рода Grossularia, гибридов рода Cerasus, гибридов и сортов рода Fragaria, двух видов рода Primula (P. polyantha и Р. prugonicenses), Rhododendron ledebourii, представителя рода Clematis (сорт Мефистофель), представителя рода Hemerocallis (сорт Алан), Brachanthemum baranovii, Dendranthema sinuatum, Adonis vemalis и Stevia rebaudiana - методы регенерации путем активации пролиферации существующих меристем.
На основе указанных моделей регенерации разработаны эффективные технологии микроразмножения для названных видов, форм и сортов растений, усовершенствована технология адаптации растений-регенерантов к условиям выращивания ex vitro. Результаты проведенных исследований являются основой для создания коллекций in vitro, сохранения биоразнообразия растений и их ускоренного воспроизводства.
Разработан способ регенерации in vitro, обеспечивающий ускоренное получение большого числа растений Camellia sinensis (А.с. № 1621825 от 23.01. 1991). С применением технологии микроразмножения получен сорт Р. polyantha - Весеня (А.с. № 35188 от 6.02.2001).
Результаты законченных исследований положены в основу методических указаний «Методы получения и ранняя диагностика гибридного потомства Allium сера L.» (2001) и «Регенерация, размножение in vitro и интродукция эндемиков флоры Алтая: Brachanthemum baranovii (Krasch. et Poljak) Krasch. и Dendranthema sinuatum (Ledeb.) Tzvel.» (2004), изложены в монографии «Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений» (2004).
В отделе биотехнологии растений ЮСБС АлтГУ создана живая коллекция различных видов растений, включающая представителей редких и исчезающих
видов, а также уникальных форм и ценных сортов хозяйственно-важных растений.
Культивируемые in vitro ткани некоторых видов растений активно используются в учебном процессе в качестве модельных систем для изучения физиологических процессов, протекающих в растительных клетках.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных заседаниях ученого совета ВНПОЧСК и ЧП (Грузия) (1983 - 1994), Южно-сибирского ботанического сада АлтГУ (1995 - 2004 гг.) и НИИ им. М.А.Лисавенко (1997 - 2004 гг.), на Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов (Махарадзе-Анасеули, 1985), международных научных и научно-практических конференциях: «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (Новосибирск, 1988), "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), «Современные проблемы научных исследований и развития садоводства, субтропического растениеводства и цветоводства» (Сочи, 1998), «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Новосибирск, 1999), «Проблемы охраны растительного мира Сибири» (Новосибирск, 2001), «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), а также на региональной научно-практической конференции «Научно-экономические проблемы регионального садоводства» (Барнаул, 2002), на XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в азиатской России» (Новосибирск - Барнаул, 2003) и на научной сессии СО РАСХН, посвященной 35-летию образования СО РАСХН «Сельскохозяйственная наука - агропромышленному комплексу Сибири» (Новосибирск, 2004).
Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 37 печатных работах, в т.ч. в 2 методических рекомендациях, 2 авторских Свидетельствах и монографии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 325 стр., состоит из введения, 6 глав, выводов, содержит 55 рисунков и 69 таблиц. Список литературы включает 583 наименования, в том числе 306 на иностранных языках.
Сохранение биологического разнообразия растений методами биотехнологии
Сохранение биологического разнообразия растений является необходимой задачей, так как существует угроза истощения биологических ресурсов из-за "мощного техногенного воздействия цивилизации на окружающую среду. От этого растения иногда могут пострадать. Многие виды еще не достаточно хорошо изучены, однако все они являются генетическим ресурсами, которые человек может использовать. Поэтому потеря любого из них является невосполнимой утратой.
Мобилизация мировых растительных ресурсов на службу человеку является одной из важнейших предпосылок прогресса сельскохозяйственного производства. Она неразрывно связана с интродукцией культурных растений и их дикорастущих сородичей, их изучением и целенаправленным использованием в селекционных программах (Горбатенко, 2003а). Поэтому в настоящее время очень актуальной является проблема сохранения генофонда как дикорастущих видов, так и культурных растений, представляющих ценный селекционный материал. Существующие традиционные подходы сохранения генофонда базируются, во-первых, на создании разнообразных коллекций, а также банков семян (хранение ex situ); во-вторых, на организации заповедников и заказников (хранение in situ).
Создание коллекций растений невозможно без их первичного интродукционного изучения, когда они оцениваются на перспективность интродукции и по этому критерию разделяются на три основные группы: очень перспективные, перспективные и малоперспективные. Для растений, входящих в две первые группы, чаще всего не возникает особых сложностей в создании коллекции, тогда как для третьей группы обычные методы хранения живой ткани в вегетативной форме лимитируются трудностями создания оптимальных условий их выращивания.
Сохранение генофонда возможно, как было сказано выше, при создании банка семян. Однако семена группы растений, относящихся к малоперспективным для интродукции, как правило, очень быстро теряют всхожесть при хранении. Представлены эти растения в основном видами, находящимися под угрозой исчезновения, причем многие из них являются лекарственными. Утрата таких растений в скором будущем может стать невосполнимой (Пименова, 2003).
Учитывая, что прогресс селекции немыслим без целенаправленной интродукции нового исходного материала, одной из задач интродукции является привлечение и сохранение генофонда видов, форм и сортов различных сельскохозяйственных культур. Коллекции разнообразных сельскохозяйственных культур способны решить большинство актуальных проблем селекции (Горбатенко, 20036). Однако хранение в виде банка семян ценного селекционного материала не решает полностью проблемы поддержания генофонда в чистоте из-за гетерозиготности семенного потомства. Для некоторых видов культурных растений такая форма хранения просто неприемлема, так как они размножаются исключительно вегетативно, и, следовательно, их необходимо хранить только в виде клонов (например, картофель) (Roberts, 1975).
Применяемые традиционные методы сохранения биоразнообразия растений трудоемки, а иногда и очень дорогостоящи, неприемлемы для ряда видов растений. Ценность сохраняемых растений часто лимитируется возможными болезнями и прихотливостью растений к новым средам обитания. Необходимы новые подходы, позволяющие преодолеть названные трудности и расширить список растений, сохраняемых в живых коллекциях.
Одним из альтернативных подходов к проблеме сохранения биологического разнообразия растений может стать использование методов биотехнологии. Но эти методы могут быть применимы только к таким видам, для которых разработаны методы регенерации и микроразмножения in vitro. Системы in vitro, из которых невозможно получить растения-регенеранты, не представляют большого интереса для генетического сохранения (Хеншоу, О Хара, 1987; Белокурова и др., 1997; Молканова и др.,2003).
Использование методов биотехнологии для сохранения генофонда имеет преимущества перед традиционными методами заключающиеся в том, что отпадает необходимость в большой площади земли и регулярном уходе за посадками, а также исключается возможность потери растений из-за заболеваний. Методические приемы, существующие в настоящее время, можно подразделить на две группы. Одна группа методов базируется на хранении без нарушения процессов роста растений и, в дополнение к сказанному, именно эта группа методов имеет все те преимущества, которые с практической точки зрения дает использование методов культуры in vitro в размножении растений. Другие методы основаны на хранении при полной остановке роста, либо при его замедлении.
Факторы, влияющие на процессы регенерации в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений
Первичный эксплант
Эксплант - фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса (Чайлахян и др., 1982). Выбор экспланта в работе по регенерации играет решающую роль. Прежде всего, эксплант должен содержать меристемоидные клетки, или клетки, способные превращаться в меристемоидные. Такие клетки чаще всего локализованы в специальных тканях или органах.
Так, в апикальных и латеральных почках имеются меристемы, обладающие высоким морфогенетическим потенциалом. Они используются для размножения многих растений, как травянистых, например, Rhodiola rosea (Кафтан и др., 1988), Indica rice (Sanduhu et al.,1995), эндемичного растения Индии Trichopus zeylanicus (Krishnan et al., 1995), лекарственного растения Tridax procumbens (Sahoo et al.,1996), Colocasia esculenta (Chand et al.,1998), так и древесных, например, Prunus domestica (Neskovic, 1985), Vitis vinifera (Diaz et al., 1999), Diospyros kaki (Chamhum et al., 1999). Использование апикальных или латеральных меристем позволяет получать генетические копии растений, то есть клонировать их.
Часто в качестве эксплантов, особенно для индукции каллусных культур, используют фрагменты листа. Выбор листьев связан с тем, что они, во-первых, обладают высоким морфогенетическим потенциалом, а во-вторых, у исследователей появляется возможность использовать растения, находящиеся на любой стадии развития. Имеются сообщения о регенерации представителей как травянистых, так и древесных видов растений в каллусе, индуцированном от листьев путем стеблевого органогенеза или соматического эмбриоидогенеза: Gossypium hyrsutum (Hirimburegama, Gamage, 1994), Phlox drummondii (Li et al., 1996), Psophocarpus tetragonolobus (Rina A. et al.,1996), Sterculia urens (Purohit, Dave, 1996), Fragaria ananassa (Takahiro, 2002), Acacia sinuate (Vengadesan et al., 2002). Регенерировать растения из листьев можно без каллусогенеза: прямым путем, как например, у Begonia х tuberhybrida (Peck, Comming, 1984), Pyrus communis (Лебедев и др., 1999).
Высоким морфогенетическим потенциалом обладают ткани луковиц у ксинофитума, нарциссов, тюльпанов (Выхристова, Смирнова, 1981), нуцеллус у цитрусовых (Das et al., 2000), ткани семядолей, например, у плодовых (Rubos, Pryke, 1984; Наош et al.,2000), участки корней у Clerodendrum viscosum (Prasad et al., 1984) и Psordea corylifolia (Suresh, Kumar, 2002).
Однако есть и такие экспланты, которые используется редко - это часть цветка - лепестки. В тех случаях, когда удается индуцировать нормальные процессы морфогенеза в культуре изолированных лепестков, использование их имеет ряд преимуществ перед другими типами эксплантов. Во-первых, упрощается метод стерилизации исходного растительного материала; во-вторых, появляется возможность размножения лучшего и/или единственного гибрида уже оцененного и отобранного по декоративности цветка; в-третьих, полностью исключается возможность повреждения уникального растения-донора экспланта. Примерами растений, у которых изолированные ткани лепестков обладают высокой регенерационной способностью, являются растения рода Rosa (Berardi, 1989), Dianthus (Fisher et al., 1993; Masaru et al.,1994), Crocus (Чуб и др.,1994).
У одного и того же растения различные экспланты проявляют разную способность к регенерации. Например, при изучении регенерационной способности каллуса, индуцированного от трех типов эксплантов (фрагменты семядолей, эпикотиль и апекс побега) у Cercospora canescens, было установлено, что частота и интенсивность регенерационных процессов была выше у каллусов из апексов (Kaushal et al., 1997).
Для каждого типа экспланта существует свой критический размер, который существенно уменьшает степень пролиферации клеток и отражается на регенерации. Это особенно важно учитывать при работе с культурой изолированных зародышей, когда разрабатываются высокоэффективные системы регенерации. В культуре незрелых зародышей размер экспланта является одним из главных факторов (Deng, Wei, 2000).
В зависимости от вида растения должны быть учтены сроки изоляции эксплантов и фаза развития растения-донора эксплантов. Ряд авторов сообщает, что экспланты двух видов рода Dioscorea (Asokan et al., 1983), трех промышленных сортов Gladiolus (Dantu, Bhojwani, 1987) изолировали во время хранения, то есть в фазу покоя и такие экспланты обладали повышенной регенерационной способностью. У нескольких сортов рода Rhododendron при оценке пригодности цветочных почек для размножения было установлено, что максимальная регенерационная способность у них также проявляется при изоляции в период покоя растений (Pavingerova et al., 2000). Однако большинство растений лучше поддается переводу в культуру in vitro в фазу активного роста. Поэтому часто в качестве доноров-эксплантов используют различные части активно растущих проростков (Zhou et al., 1993, Спасеноски, Колева, 1995, Wingender et. al., 1996; Fiore et al., 1997), а для большинства древесных растений - апексы, изолированные от активно растущих побегов (Bondok et al., 1986; Founda et al., 1994).
Brachanthemum baranovii
Термин «микроразмножение», впервые использованный в 1968 году Хартманном и Кестером, оказался широко распространенным и принятым для данной технологии. Но как и все термины, в процессе развития он также пришел к своему специальному значению, которое сформулировано в обзорной статье английского ученого А.Д. Крикориана «Клонирование высших растений из асептически культивируемых тканей и клеток» и до сих пор наиболее полно отражает его суть. Под микроразмножением обычно понимают какую-либо асептическую процедуру, включающую манипуляции растительными органами, тканями или клетками, результатом которой являются многочисленные растения, и которая позволяет миновать обычный половой процесс или существующие традиционные способы вегетативного размножения. Подразумевают, что при клональном микроразмножении каждое полученное растение фенотипически и генотипически идентично растению, из которого оно произошло (Krikorian, 1982).
Традиционно растения размножают семенами или вегетативным способом, который является трудоемким процессом, требующим много времени. Поэтому в последние годы возрос интерес к использованию методов культуры тканей для размножения растений. Первоначально этот метод был разработан для травянистых растений, а в последующем применен и к древесным, для которых он оказался даже более важным, чем для травянистых растений. В 80-е годы началось интенсивное применение новой технологии для древесных растений. Успех применения новой технологии во многом зависел от ряда требований, которым должны были удовлетворять применяемые тканевые культуры к вегетативному размножению. Сутью первого требования является высокая способность систем к органогенезу или эмбриоидогенезу. Конечным продуктом системы должны быть растения или зрелые эмбриоиды; второго - закаливание и способность к переносу и выживанию их в полевых условиях; третьего - использование культуры тканей должно сочетаться или иметь преимущества перед существующей системой размножения (Sommer, 1983).
Мурасиге (Murashige, 1974; 1976) выделил три этапа, или три стадии микроразмножения: I - введение в культуру in vitro эксплантов; II -собственно размножение; III - укоренение и подготовка к пересадке в почву. Самым критическим моментом из всех этапов микроразмножения оказалась процедура переноса укорененных растений-регенерантов в нестерильные условия выращивания, поэтому позже был выделен IV этап микроразмножения как самостоятельный: этап (стадия) адаптации полученных растений-регенерантов к условиям выращивания их in vivo (Anderson, 1980).
Введение в культуру in vitro эксплантов
Целью первой стадии микроразмножения растений является достижение длительного выживания свободных от инфекции растительных эксплантов.
В виду того, что поверхность растительных тканей сильно загрязнена разнообразной бактериальной и грибной микрофлорой, а питательная среда является отличным субстратом для ее развития, требуется процедура поверхностной стерилизации растительного материала. Для стерилизации используют различные стерилизующие вещества. Однако всегда придерживаются принципа, по которому следует выбирать наиболее пригодный стерилизующий раствор. Принцип прост: вещество должно обеспечивать большой процент неповрежденных тканей, способных к росту и новообразованиям, при наименьшем проценте инфекции. Этого принципа следует придерживаться и при выборе длительности стерилизации, то есть экспозиции (Бутенко, 1971).
Для поверхностной стерилизации растительных тканей используют различные хлорсодержащие соединения: хлорамин Б, гипохлориты натрия, калия, кальция. Препараты, содержащие активный хлор, обладают бактерицидным эффектом для широкого круга микроорганизмов как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Поэтому в некоторых случаях достаточным оказывается применение только растворов определенной концентрации названных препаратов для получения свободного от инфекции растительного материала.
Представители рода Cerasus
Camellia sinensis L. (синоним Thea sinensis L.) или чай китайский входит в семейство Theaceae. Это вечнозеленый кустарник с густым ветвлением высотой до 3 м; лист овальный или удлиненно-овальный, 60-70 мм длины и 35-40 мм ширины, с тупым, иногда раздвоенным кончиком. Венчик цветка белый. Цветение С sinensis в Грузии продолжается с сентября до наступления заморозков, возобновляясь иногда весной. Плод - коробочка, обычно трехстворчатая, часто антоциановая, семена округлые, коричневые, 12-15 мм в диаметре, в плотной скорлупе (Бахтадзе, 1948).
Сорта С sinensis «Грузинский №2» и «Грузинский №3» получены путем гибридизации и отбора на основе китайского чая. Это крупнолистный чай, относящийся к группе южных гибридов. Сорт-клон Колхида получен методом отбора среди семенного потомства, полученного от свободного опыления C.sinensis. Он также является крупнолистным чаем и характеризуется усиленным ростом побегов. Китайская крупнолистная форма чая (C.sinensis var. macrophylla Sieb.) - растение с очень крупными листьями (120 - 150 мм длины и 70-80 мм ширины), имеет преимущественно спящие почки, обладает высокой жизненностью, не-смотря на замедленный темп роста. Генеративная деятельность понижена. Высокозимостойкая форма (Бахтадзе, 1952).
Основной способ размножения С. sinensis - семенной. Способ вегетативного размножения зелеными черенками трудоемок и длителен по времени (не менее 100 дней до получения саженца). Частота укоренения варьирует от ЗО до 56%. Причиной плохой укореняемости черенков считается высокое содержание в них таннина (Бахтадзе, 1971).
Интенсификация чаеводства предусматривает создание сортов и форм, позволяющих существенно расширить ареал промышленного возделывания чая. Наряду с традиционными подходами в решение этой проблемы могут внести существенный вклад методы биотехнологии. Для этого необходимо углубленное изучение потенциальных морфогенетических возможностей С.sinensis.
Культура изолированных зародышей
Использование недозрелых семян, имеющих дифференцированные зародыши, позволяет полностью решить проблему получения стерильных гибридных сеянцев. Зародыши надежно защищены семенной оболочкой и мощной зеленой кожурой коробочки. Поэтому достаточно провести поверхностную стерилизацию коробочек с семенами путем обжигания в пламени спиртовки, а затем удалить все наружные покровы и извлечь зародыши. Такой способ поверхностной стерилизации гарантирует 100% выход неинфицированных эксплантов (зародышей) (Вечернина и др., 1989). Полностью исключается необходимость использования в питательной среде антибиотиков, без которых невозможно осуществить культивирование зародышей, изолированных из зрелых семян С. sinensis (Ниссанка, Катаева, 1988).
Изоляцию и введение в культуру in vitro зародышей С. sinensis проводили в четыре срока. В большинстве недозрелых семян (не менее 70%) зародыши, находящиеся на семядольной стадии развития, имели средний диаметр 2-3 мм (конец июля), 5-7 мм (середина августа), 10-12 мм (конец августа), 14 -16 мм (середина сентября).
Изолированные зародыши помещали на питательную среду В5 без регуляторов роста, а также на питательную среду, дополненную различными регуляторами роста. Не удалось индуцировать развитие зародышей ни у одного из исследуемых сортов С. sinensis в первые два срока их изоляции.
При введении in vitro зародышей в конце августа, в большинстве случаев получали нормальные проростки. Так, у сорта Колхида из 20 введенных зародышей 18 проросли (90%), у сорта №2 проросли 86 % зародышей, у ККФ проросли 20% зародышей. Нормальные проростки получали на питательной среде, дополненной 5 мкМ ИМК и 1 мкМ БАЛ. Использование безгормональной среды в большинстве случаев приводило к формированию проростков с измененной морфологией: наблюдалось разрастание корня и образование на укороченном стебле листьев семядольного типа, собранных в виде розетки.
Зародыши, изолированные из недозрелых семян в сентябре, были полностью дифференцированными и хорошо развивались как на безгормональной питательной среде, так и при использовании в ее составе небольших концентраций регуляторов роста: БАЛ (0.2 - 0.5 мкМ) и ИМК (0.1 -0.2 мкМ). Первые 2-3 недели зародыши культивировали в условиях темноты, а затем в условиях фотопериода. Для доращивания их переносили на безгормональную среду. Через 2.5 - 3 месяца формировалось 8-10 побегов с хорошо развитой корневой системой.
Таким образом, стерильные проростки ценных сортов и форм С. sinensis, можно получать в культуре зародышей, изолированных из недозрелых семян. Стерильные проростки могут быть использованы как доноры различных эксплантов, в том числе пазушных почек, например, в исследованиях по разработке метода микроразмножения.
