Содержание к диссертации
Введение
Введение 4
1 Наследственное разнообразие ячменя по устойчивости
к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной
корневой гнили (обзор литературы) 8
1.1. Эколого-бшшогические особенности Bipolaris sorokiniana Shoem 8
и вредоносность вызываемых им болезней ячменя 8
1.2. Наследование устойчивости ячменя к темно-бурой листовой пятнистости 11
1.3. Наследование устойчивости ячменя к обыкновенной корневой гнили... 15
1.4. Сомаклональная изменчивость ячменя по устойчивости к болезням 17
2. Условия, материал и методы исследований 22
2.1. Условия и климатические особенности Пушкинского филиала ГНЦ РФ ВНИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова 22
2.2. Материал исследований 25
2.3. Методы исследований 30
2.3.1. Выделение изолятов и культивирование Я sorokiniana 30
2.3.2. Оценка устойчивости ячменя к темно-бурой листовой пятнистости 33
2.3.3. Оценка устойчивости ячменя к обыкновенной корневой гнили 37
2.3.4. Анализ устойчивости к болезням в потомстве сомаклонов при самоопылении 40
2.3.5. Гибридологический анализ 40
2.3.6. Анализ беккроссных линий сомаклонов 41
2.4. Статистическая обработка данных 41
3. Генетический контроль устойчивости коллекционных образцов ячменя к в. sorokiniana 42
3.1. Наследование устойчивости образцов ячменя к темно-бурой листовой пятнистости 42
3.2. Наследование устойчивости коллекционных образцов ячменя к обыкновенной корневой гнили 51
4. Генетический контроль устойчивости сомаклонов ячмебякв. sorokinjana 57
4.1. Устойчивость сомаклонов к темно-бурой листовой пятнистости 57
4.2. Наследование устойчивости сомаклонов к темно-бурой листовой пятнистости 63
4.3. Анализ компонентов устойчивости сомаклонов 70
4.4. Устойчивость сомаклонов к обыкновенной корневой гнили 72
4.5. Наследование устойчивости сомаклонов к обыкновенной корневой гнили
78
5. Длительность устойчивости образцов ячменя к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили 81
5.1. Длительность устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости 81
5.2. Длительность устойчивости к обыкновенной корневой гнили 85
Выводы 90
Литература 92
Приложение 107
- Эколого-бшшогические особенности Bipolaris sorokiniana Shoem
- Выделение изолятов и культивирование Я sorokiniana
- Наследование устойчивости коллекционных образцов ячменя к обыкновенной корневой гнили
- Наследование устойчивости сомаклонов к обыкновенной корневой гнили
Введение к работе
Актуальность темы Темно-бурая листовая пятнистость и обыкновенная корневая гниль, вызываемые гемибиотрофным грибом Bipolaris sorokiniana Shoem, — распространенные и вредоносные болезни во многих регионах возделывания ячменя (Hordeum vtdgareL). Даже при условии полного соблюдения технологии возделывания, потери урожая от этих болезней могут составлять 20 - 50% (Wilcoxson et al., 1990; Григорьев, 1996). Наиболее экологически безопасным и экономически выгодным методом борьбы с данными болезнями считается возделывание устойчивых сортов (Su Li, 1987; Заушинцена, 2001). Ряд образцов описанньж как устойчивые по данным отечественных и зарубежньж исследователей, восприимчивы в ювенильной фазе развития к изолятам В. sorokiniana с территории России (Тырышкин, Шевченко, 1994). Очевидно, что поиск доноров устойчивости с генами, эффективными против наиболее агрессивных изолягов патогена является актуальным.
Одним из перспективных методов расширения генетического разнообразия растений по устойчивости к болезням является индукция сомаклональной изменчивости (Laikin, Scowcroft, 1981). В работе Д.Н. Шевченко (1994) было получено около 2000 рас-гений-регенерантов пяти сортов ярового ячменя и выявлена высокая, до 10 %, частота изменчивости по устойчивости к болезням, включая листовую пятнистость, вызываемую В. sorokiniana. Полинейный анализ выявил наличие в потомстве устойчивых сомаклонов, устойчивых, восприимчивых и расщепляющихся форм. (Тырышкин, 1995). Знание генетического контроля устойчивости сомаклонов расширит наши представления о механизмах сомаклональной изменчивости ячменя, а также необходимо для использования выделенных устойчивых форм в селекции.
Цель представленной работы - изучение генетического контроля устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили у коллекционных образцов и сомаклональньж вариантов ячменя. В соответствии с указанной целью в задачи исследования входило:
- изучить устойчивость образцов ячменя из мировой коллекции ВИР к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили;
изучить устойчивость к двум болезням в поколениях самоопыления Rs-Rw ранее
полученных сомаклонов ячменя и выделить стабильно устойчивые сомаклоны;
изучить наследование устойчивости к болезням у выделенных образцов ячменя;
определить аллельные отношения генов устойчивости у выделенных образцов;
оценить возможную длительность устойчивости выделенных образцов к темно-
бурой листовой пятнистости и обыкновенной кориедой НИШ» і .і ' .
і I4)G НАЦИОНАЛЬНАЯ
J БИБЛИОТЕКА
Научная новизна. Установлено, что в коллекции ВИР устойчивые к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили образцы встречаются редко. Из 1000 изученных коллекционных образцов ярового ячменя (И. vulgare) выделили два среднеус-тойчивых к темно-бурой листовой пятнистости - к-8555 (Эфиопия), Jngve (Швеция) и пять гетерогенных по устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости к-27480, к-27481(Корея); к-28959, к-19 ПО, к-19645 (Индия); два среднеустойчивых к обыкновенной корневой гнили сорта культурного ячменя Viivi (Финляндия) и Scarlett (Германия). Выделили высокоустойчивый к обыкновенной корневой гнили образец дикорастущего ячменя H.agriocrithon - w-699 (Китай). Идентифицировано по одному рецессивному неаллельно-му гену устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости у образцов к-8555, Нутанс 187, Jngve, один доминантный ген устойчивости у образца NDB-112. Идентифицировано по одному неаллельному доминантному гену устойчивостя у сортов Viivi и Scarlett и один рецессивный ген у образца Н. agriocrithon w 699 к обыкновенной корневой гнили. В результате изучения сомаклонов ячменя в течение 6 поколений, выделены стабильные по устойчивости к двум болезням сомаклоны поколения Rjo: 21 - к обыкновенной корневой гнили и 33 - к темно-бурой листовой пятнистости. Установлен как рецессивный, так и доминантный характер наследования устойчивости к двум болезням у сомаклонов. Устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости у 9 сомаклонов сорта Одесский 115 контролируется более чем 1 геном, у 5-ти из них более чем 2-мя генами. Устойчивость 6 сомаклонов к обыкновенной корневой гнили сорта Golden Promise контролируется более чем 1 геном. Установлено, что гены устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили неидентичны у различных сомаклонов одного сорта. Выявлено дифференциальное взаимодействие сомаклонов и субпопуляций В. sorokiniana, что указывает на неидентичный генетический контроль устойчивости различных сомаклонов к темно-бурой листовой пятнистости.
Практическая ценность результатов исследований. Для селекции ячменя на устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости предлагаются выделенные сомаклоны сорта Одесский 115, коллекционные образцы, а также, линии, полученные в результате беккроссирования устойчивых сомаклонов восприимчивым сортом. Для селекции ячменя на устойчивость к обыкновенной корневой гнили предлагаются сомаклоны сорта Golden Promise и выделенные коллекционные образцы, а также линии, полученные в результате беккроссирования устойчивых сомаклонов восприимчивым сортом. Для изучения длительности ювенильной устойчивости ячменя к обыкновенной корневой гнили предлагается лабораторный метод, предусматривающий субкультивирование популяции В. sorokiniana на отрезках корней.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференциях молодых ученых и специалистов ГНЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова (С.-Петербург, 1998, 2001, 2002); всероссийской, научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (С.-Петербург, 2001); международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001); международной научно-практической конференции «Генетические ресурсы культурных растений» (С.-Петербург, 2001); научной конференции профессорско-преподавательского состава СПГАУ (С.-Петербург, 2002); международной конференции «Генетические коллекции, изогенные и аллоплазматические линии» (Новосибирск, 2001); международном. Менделевском Конгрессе (Брно, 2000); XVI Конгрессе ЕУКАРПИЯ (Эдинбург, 2001.); - международной конференции «Защита растений в Балтийском регионе в контексте интеграции в ЕС» (Каунас, 2002); международной конференции по защите растений «Вредители, болезни и сорняки» (С- Петербург, 2002).
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты РФФИ № 96-04-50322; № 02-04-48948; № 99-04-48053).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на ПО страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 8 рисунками - и 23 таблицами. Список использованной литературы включает 146 наименований, из них 74 на иностранном языке.
Эколого-бшшогические особенности Bipolaris sorokiniana Shoem
Bipolaris soroktniana (Sacc in Sorok) Shoem (син. Helminthosporium so-rokinianum (Sacc.) Shoemaker, Helmmtosporium sativum Parnell, King et Bakke., Helminthosporium californicum Mackie et Paxton, Drechslera sorokiniana Subra-manian et Jain) по своему систематическому положению относится к подотделу Deiiteromycotina классу Hyphomycetes, порядку Hyphomycetales, семейству De-matiaceae; телеоморфа - Cochliobolus saiivus Ito et Kurib относится к подотделу Ascomycotina, классу Loculoascomycetes, порядку Pleosporales7 семейству Pleo-sporaceae (Хасанов, 1992). Половая стадия в природе не обнаружена, в лаборатории путем использования штаммов разного типа спаривания получено сумчатое спороношение гриба (Tinline, Dickson, 1958).
При росте на искусственных питательных средах В. soroktniana образует быстро или медленно растущие колонии, гладкие, бархатистые, серые до почти черных.
Конидиеносцы одиночные или в небольших группах, простые, 20-200 х10 мкм. Конидии В. sorokiniana многоклеточные, прямые, обратнояйцевидные, эллипсоидальные. Зрелые конидии обычно изогнуты, веретеновидные, иногда обратно-булавовидные, темно-оливково-коричневые, 20-50-100-135x14-17-26-34 мкм, с 1-4-10-12 дистосептами, рубчик слегка выступает, усеченный, 2,5-4 -4-4,5-6 мкм диаметром. Наблюдали нетипичное спороношение гриба (конидии были на 24-87% длиннее, содержали на 2-4 септы больше), при совместном па-разитировании В, sorokiniana с возбудителем листовой ржавчины ячменя (Ски-лягина, Ашмарина, 1989).
В каждой клетке конидии может содержаться до 30 генетически разнородных ядер, поэтому возможно выщепление не идентичных по вирулентности или другим признакам субизолятов из моноконидиального изолята (Тьгрышкин, Афанасенко, 1989).
Bipolaris sorokiniana является широко специализированным факультативным паразитом. Круг хозяев гриба необычайно широк, он поражает листья, листовые влагалища, колосья, семена, стебли, корни и прикорневые органы представителей 52 родов семейства злаковых, а также 15 родов незлаковых растений (ХасановД992). Несмотря на широкую специализацию В. sorokiniana, у изолятов обнаружены различия в вирулентности к сортам растений хозяев (Val-javec-Cratian, Stefrenson, 1987; Хасанов, 1992; Gamba et al, 2000; Meldrum et al., 2000).
Из абиотических факторов на Bipolaris sorokiniana большое влияние оказывают влажность, температура и кислотность почвы, ее химический и физический состав (Иодко, 1975; Линник, 1983). Для накопления инфекции В. sorokiniana благоприятны дерново-подзолистые почвы, частое переувлажнение и подкисление почв (Линник, 1983; Grey et al.,1991).
В, sorokiniana характеризуется способностью синтеза неспецифических токсинов, которые также выполняют регуляторные функции, стимулируя прорастание небольшого количества конидий, и не допускают гибели гриба из-за истощения питательного субстрата. Токсины - гельминтоспорал, гельминтос-порол, цитокинин подобные вещества, виктоксины играют роль и в патогенезе В. sorokiniana. Гельминтоспорал задерживает прорастание семян и рост растений ячменя и пшеницы, ингибирует транспорт электронов, окислительное фос-форилирование, подавляет поглощение кислорода тканями растений, нарушает проницаемость клеточных мембран. Под влиянием токсинов патогена снижается интенсивность поглощения корнями растений элементов минерального питания, нарушается транспорт веществ из корней в надземные органы, происходит обезвоживание тканей, снижается синтез белка в них. Образование токсинов начинается при прорастании конидий и достигает максимума на 6-7 сутки. Токсины распространяются по всему растению в течение 15-30 минут, накапливаются в несколько больших количествах в корневой системе (Дурынина и др. 1982; ВеликановД987).
При паразитировании на ячмене Bipolaris sorokiniana вызывает обыкновенную корневую гниль корней и прикорневых органов, темно-бурую пятнистость листьев и стеблей, черный зародыш семян (Чулкина, 1985; Бенкен и др.Д987; Хасанов, ГлуховаД991).
Обыкновенную корневую гниль ячменя вызывает комплекс почвенных грибов: B.sorokiniana, Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc, F graminearum Schwabe, (Couture, 1981), а также виды родов Curvularia, Phythmm, Alternaria, Rhizoctonia, причем В. sorokiniana во многих регионах играет главную роль в этиологии заболевания. Обыкновенная корневая гниль может развиваться в эпифитотийной форме в ряде штатов США, Западной Австралии, Канаде (Hamilton etal, I960).
На Алтае, в Западной Сибири, на Урале, в Северном Казахстане и Поволжье, ежегодные потери урожая зерна от этой болезни могут составлять более 20 % (РочевД986; Бенкен и др., 1987).
Первые признаки обыкновенной корневой гнили появляются через 5-7 дней после посева ячменя. На первичных корнях образуются светло-коричневые точечные некрозы, которые постепенно увеличиваются в размерах. Проростки деформируются, буреют и частично погибают. При поражении всходов влагалище первого листа имеет бурую окраску, рост и развитие растения задерживается (ГригорьевД 984). При поражении корневой гнилью наблюдаются хлорозы, некрозы, снижение транспирации, увядание (Jones, 1987). В фазу кущения-трубкования поражается нижнее основание стебля, первое подземное междоузлие и узел. В фазу полной зрелости наблюдается щуплоколо-сость, белостебельность, пустоколосость. (Бенкен и др., 1987; MilesД987).
Темно-бурая листовая пятнистость в Дании, Шотландии, некоторых штатах США, а также европейской части бывшего СССР, в благоприятные годы для развития патогена, может снижать урожай ячменя более чем на 40% (Хасанов, ГлуховаД991; Ма&геД997).
Выделение изолятов и культивирование Я sorokiniana
Для оценки устойчивости ячменя к темно-бурой листовой пятнистости в 1997-2000 гг., использовали метод инокуляции патогеном отрезков листьев, помещенных в водный раствор бензимидазола (Hetzler, 1991; Тыръппкин, Михайлова, 1993). Позднее было обнаружено явление генотип-специфической индукции устойчивости под действием данного химического вещества (Tyryshkui, 2001), что могло бы приводить к ошибочной классификации восприимчивых образцов как устойчивых. Поэтому в дальнейшем использовали модификацию метода, при которой отрезки листьев помещали на вату, смоченную водой.
Семена изучаемых образцов высевали в эмалированную кювету 33 х 26 см на вату смоченную водой. Кювету с семенами помещали в темноту на двое суток, а затем в лабораторную светоустановку с интенсивностью освещения 2500 Люкс и температурой 22-25С. Через 7-10 дней после посева, растения в фазе 1-2-х листьев использовали для инокуляции.
Отрезки листьев (1,5 см), последовательно раскладывали в кювету на слой ваты смоченной водой, по периметру размещали увлажненные валики. Для оценки ювенильной устойчивости ячменя к темно-бурой листовой пятнистости растения инокулировали штаммом «Т» В. sorokiniana, поддерживаемом в культуре более 15 лет (Рис. 2.5.) и искусственной популяцией, полученной из смеси конидий 40 изолятов гриба приблизительно в равных соотношениях.
Инокуляцию проводили, нанося суспензию конидий В. sorokiniana из пульверизатора. Для инокуляции использовали 10-15-ти дневные культуры В, sorokiniana. Споры с поверхности агара собирали лопаткой и суспензировали в отстоявшейся водопроводной воде. Полученную суспензию фильтровали через двойной слой марли. Титр спор определяли, используя автоматическую микро-пипетку. При этом в капле суспензии 5мкл, в трехкратной повторности подсчитывали число конидий. Концентрация спор соответствовала количеству спор в 1 капле х 200. При необходимости суспензию разводили водопроводной водой. Использовали инфекционную нагрузку 30 тыс. конидий /мл. После инокуляции растений, на валики помещали стекло таким образом, чтобы оно не соприкасалось с листьями. Затем кюветы оборачивали полиэтиленовой пленкой, сутки выдерживали на рассеянном свету и помещали на све-тоустановку. Оценку проводили в 3-5 независимых экспериментах (2-3 повторности в каждом). Для инокуляции интактных растений семена образцов раскладывали на увлажненные валики из ваты, которые помещали в кювету с небольшим количеством воды в 1 ряд. После того как первый лист полностью сформировался, валики с растениями укладывали горизонтально в кювету, на дне которой находилась увлажненная фильтровальная бумага. Валики укладывали так, чтобы листья не перекрывали друг друга, затем наносили суспензию конидий (Тырышкин, Соловьева 2001).
Для оценки устойчивости к болезни потомства гибридов использовали способ раскладки листьев предложенный Л.А, Михайловой и Л.Г. Тырышкиным (1998). Срезанные листья последовательно раскладывали в кювету на ровный слой ваты смоченной водой, тонкими валиками из увлажненной ваты листья прижимали по краям, затем делили лист на четыре равные части, используя влажные валики ваты, либо палочки из оргстекла.
Через 3-5 дней после инокуляции отрезков листьев и 5-7 дней после инокуляции интактных растений (когда листья восприимчивого контроля были поражены на 6 баллов), оценивали балл поражения изучаемых образцов по шкале 0 - отсутствие симптомов; 1 - отдельные мелкие пятна; 2, 3, 4, 5, 6 - пятна среднего и крупного размера с хлорозом, занимающие соответственно 10, 30, 50, 80 и 100% поверхности листа (Тырышкин, Соловьева 2001) (Рис. 2.6).
Образцы, пораженные на балл 5-6, считали восприимчивыми, с более низкими баллами — обладающими различными уровнями устойчивости к темно-бурои листовой пятнистости.
Оценку устойчивости растений в стадии флаг-листа проводили в полевых условиях с использованием метода «камер».
На флаг-листья растений помещали полосу фильтровальной бумаги (1 1,5 см), смоченную в суспензии конидий В. sorokiniana, поверх которой закрепляли полосу полиэтиленовой пленки. Через 5 суток реакцию растений оценивали по приведенной шкале.
На естественном инфекционном фоне оценку растений проводили с использованием следующей шкалы; R - устойчивые (пятна не более 2мм длиной, без хлоротического окаймления); MR — умеренноустойчивые (пятна от 2 до 4 мм длиной, без хлоротического окаймления или с небольшим хлоротическим окаймлением); MS -умеренновосприимчивые (пятна от 4 до 6мм длиной, с постоянно присутствующим хлоротическим окаймлением по краям); S - восприимчивые (пятна крупные, более 6 мм длиной, с хлоротическим окаймлением распространяющимся по поверхности листа) (Fetch, Steffenson, 1997) (Рис 2.7).
Для изучения компонентов устойчивости - количества пятен на единицу листовой поверхности и размера пятен использовали растения в стадии 1-2-х листьев.
Отрезки 1-х листьев раскладывали на вату смоченную водой, опрыскивали водной суспензией конидий возбудителя (10 тыс. конидий/мл) и через 5 дней подсчитывали количество пятен на каждом отрезке листа. На отрезки листьев тех же образцов, микропипеткой наносили капли суспензии спор возбудителя (10 мкл) и через 5 дней измеряли размер сформировавшихся пятен. (Тырыгд-кин, Соловьева, 2001)
Для изучения возможной длительности устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости отрезки листьев образцов заражали искусственной популяцией В. sorokiniana. После появления симптомов болезни листья высушивали и помещали на вату, смоченную раствором лактозы (1 г/л) (Tyryshkin, Vo-ronkova, 1997). Через 3-5 дней, после образования обильного спороношения патогена, конидии переносили на отрезки листьев того же образца (1 цикл субкультивирования) .
Наследование устойчивости коллекционных образцов ячменя к обыкновенной корневой гнили
Фактически полученное соотношение устойчивых растений к восприимчивым, по объединенным результатам анализа расщепляющихся семей F3, комбинации скрещивания Белогорский 95 х Scarlett - 821: 290 (2 3:і0,75, Р=0,25-0,50), подтверждает гипотезу выдвинутую на основе анализа Бг, о том что устойчивость сорта Scarlett к обыкновенной корневой гнили детерминирована одним доминантным геном.
Фактически полученное соотношение устойчивых растений к восприимчивым, по объединенным результатам анализа расщепляющихся семей Б3, комбинации скрещивания Viivi х Белогорский 95 - 890: 321 (%23:ils47, Р О, 10-0,25), подтверждает гипотезу выдвинутую на основе анализа Бг, о том что устойчивость сорта Viivi к обыкновенной корневой гнили детерминирована одним доминантным геном.
Фактически полученное соотношение устойчивых растений к восприимчивым, по объединенным результатам анализа расщепляющихся семей F3, ком-бинации скрещивания w-699 Golden Promise - 305: 821 (% із 2,62, Р=0Д0-0,25), подтверждает гипотезу выдвинутую на основе анализа 2, о том что устойчивость образца w-699 Я. agriocrithon к обыкновенной корневой гнили детерминирована одним рецессивным геном.
Расщепление в F2 комбинации скрещивания Viivi х Scarlett (76У: 6В) свидетельствует о неидентичности генов устойчивости сортов. Расщепление соответствовало теоретически ожидаемому 15: 1 в случае., если устойчивость родительских форм детерминироана неаллельными доминантными генами -(Х2=0Д6;Р=0,50-0/75).
Таким образом, в результате изучения 1000 коллекционных образцов культурного ячменя, нами выделены 2 образца среднеустойчивых к темно-бурой листовой пятнистости и 2 - к обыкновенной корневой гнили. Подтвердили устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости 2-х образцов, выделенных ранее в исследованиях других авторов, 5 образцов были гетерогенны по устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости. Образцы одновременно устойчивые к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили не выявлены.
У выделенных образцов идентифицированы 3 рецессивных и один доминантный ген устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости. Олигогенный контроль устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости ранее был определен у ряда генотипов ячменя (Wilcoxson etal., 1990; Тырышкин, Шевченко, 1994; Valjavec-Gratian М., Steffenson В.J, 1997). В наших исследованиях выделен высокоустойчивый к обыкновенной корневой гнили образец дикорастущего ячменя її. agriocrithon и установлено, что устойчивость к болезни детерминирована одним рецессивным геном. По данным Вилкоксона с соавт. (1990), образцы И. agriocrithon могут являться источниками устойчивости и к темно-бурой листовой пятнистости. Н. agriocrithon рассматривается как один из наиболее перспективных доноров устойчивости к болезням ячменя, так как легко скрещивается с культурными сортами (Лукьянова и др., 1990). Очевидно, целесообразно в дальнейшем уделить большее внимание поиску доноров устойчивости среди образцов Я. agriocrithon.
Полученные результаты подтверждают сведения о редкой встречаемости устойчивых к данным болезням образцов ячменя в коллекции ВИР (Рочев, 1986; Тырышкин, Шевченко, 1994; Заушшщена, 2001). Таким образом, актуально использование других подходов для поиска доноров устойчивости ячменя к изучаемым болезням.
В наших исследованиях не удалось выделить высокоустойчивых форм среди изученных коллекционных образцов ячменя. Наибольший интерес с теоретической ЇЇ практической точки зрения представляет изучение наследования высокого уровня устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости. Ранее Л. Г. Тырыпшш и Д. Н. Шевченко (1995) выделили ряд высокоустойчивых сома-клональных вариантов ярового ячменя в поколении R4. Исходные сорта для получения растений-регенерантов были восприимчивы к болезни (балл поражения темно-бурой листовой пятнистостью 5-6). В поколении Rs анализировали потомство 7-ми сомаклонов поколения Рч сорта Golden Promise; 4-х - сорта Dissa; 3-х - сорта Roland; 2-х - сорта Mamie; 6-ти сорта Одесский 115. В каждом из поколений самоопыления отбирали растения с высоким уровнем устойчивости (1-2 балла), либо расщепляющиеся с преобладанием высокоустойчивых к болезни форм. Количество устойчивых, расщепляющихся и восприимчивых сомаклонов к темно-бурой листовой пятнистости, выявленных в поколениях самоопыления высокоустойчивых растений представлено в таблице 4.1.
В поколении R5 изучили 120 сомаклонов сорта Golden Promise, потомков 7-ми сомаклонов поколения Рм- Из изученых сомаклонов выделили 9 устойчивых и 87 расщепляющихся, 24 - оказались восприимчивыми. Так как среди расщепляющихся сомаклонов уровень устойчивости растений был низким, в следующем поколении самоопыления изучали реакцию потомства только 3 высокоустойчивых форм. В поколении Rs из 90 изученных сомаклонов устойчивых форм не выделили, расщеплялись по устойчивости к болезни - 66. Из-за отсутствия устойчивых и низкого уровня устойчивости растений среди расщепляющихся форм, анализ устойчивости сомаклонов сорта Golden Promise в последующих поколениях не проводили (Тьгрышкин, Воронкова 1998).
Наследование устойчивости сомаклонов к обыкновенной корневой гнили
Наблюдали дальнейшее приспособление популяции патогена к паразитированию на сомаклонах Од 143 III 14, Од 149 I 13, Од 116 I 2 (балл поражения увеличился до 4-х).
Нутанс 187, Jngve, NDB-112 поражались «собственными» субпопуляциями после 12 пассажей также как и исходной популяцией. Субпопуляция выделенная из восприимчивого сорта (Белогорский 95), поразила коллекционные образцы на уровне восприимчивого контроля.
Не изменился балл поражения «собственными» субпопуляциями Од 143 I 7 и Од 149 Г 29. Субпопуляция «восприимчивого сорта» поражала эти сомаклоны на уровне восприимчивого контроля. Балл поражения сомаклонов Од 1491 28 и Од 149 I 3 снизился при инокуляции «собственной» популяцией 12-го субкуль-тивирования по сравнению с исходной.
Наибольший интерес представляют сомаклоны Од 149 I 3 и Од 149 I 28, которые не поражались ни одной из 15-ти субпопуляций на уровне восприимчивого контроля.
Выявлено дифференциальное взаимодействие сомаклонов и субпопуляций В. sorokimana. Так например, сомаклон Од 143 Щ 10 поражался изолятом № 5 на 2 балла, а Од 143 Ш 14 на 4 балла, Од 149 I 28 поражался изолятом № 15 на 4 балла, а Од 143 I 4 на 6 баллов, Од 149 I 3 поражался изолятом № 14 на 2 балла, аОд11612на4 балла. Различия в баллах поражения, хотябы одним из изолятов, можно наблюдать при попарном сравнении всех сомаклонов (табл. 5.2.).
Наблюдали различия Б степени поражения сомаклонов Од 143 Ш 14 и Од 143 Ш 10 (потомков одного растения R9) - 10-ю субпопуляциями; Од 143 17 и Од 143 I 4 - 6-ю субпопуляциями; Од 149 I 28 и Од 149 I 13 - 10-ю субпопуляциями; Од 149128 и Од 149 129 - 10-ю субпопуляциями; Од 149 113 и Од 149 I 3 - 10-ю субпопуляциями; Од 149 I 13 и Од 149 I 29 - 11-ю субпопуляциями, что может служить косвенным доказательством в пользу предположения о неидентжчности генетического контроля устойчивости этих сомаклонов. Пассирование патогена на восприимчивом сорте Белогорский 95 привело к отбору субпопуляций, поразивших большинство образцов на уровне восприимчивого контроля. Пассирование популяции патогена на сомаклонах Од 149 I 28 и Од 149 I 3 привело к снижению балла поражения сорта Белогорский 95 с 6-ти (при поражении исходной популяцией) до 4-х. Для изучения возможной длительности устойчивости к обыкновенной корневой гнили, нами предложен метод «пассирования популяции В. sorokiniana «с корня на корень». Образцы выращивают до стадии двух листьев на тонком слое увлажненной ваты. Затем корневую систему вынимают пинцетом и промывают, корни разрезали на отрезки 1-1,5 см. Отрезки корней помещают в суспензию конидий В. sorokiniana с концентрацией 30-50 тыс/мл. Через 5-7 суток корни с визуальными признаками заражения тщательно промывают, раскладывают на фильтровальную бумагу и подсушивают в течение 2-х суток при 25 С. Затем фильтровальную бумагу с корнями помещают в чашки Петри на слой ваты, смоченной раствором лактозы. Концентрация лактозы 1%, оптимальна для развития обильного спороношения гриба (более 1 тыс. конидий на отрезок корня 6-10 мм вне зависимости от уровня устойчивости сорта) (табл.5.3). Чашки Петри помещают на светоустановку (2500 Люкс).
Через 3-5 суток, после появления обильного спороношения В. sorokiniana, споры переносили на корневую систему того же образца (1 цикл реинокуля-ции), для этого отрезки корневой системы изучаемых образцов, помещают в ячейки плексигласовых плато (диаметр ячеек 15 мм), заполненные стерильной водой (1мл), накрывают фильтровальной бумагой с отрезками корневой системы соответствующих образцов со спороношением В. sorokiniana. Плато оборачивают полиэтиленовой пленкой и инкубируют в темноте. Через трое суток фильтровальную бумагу и отрезки корней «предыдущего цикла» вынимают. После появления визуальных признаков заражения отрезки корней промывают и помещают в чашки Петри на слой ваты, смоченной раствором лактозы, как описано выше. После проведения ряда пассажей, подсушенные корни помещают на долуселективную среду. Изоляты В. sorokiniana, выделенные из каждого образца, размножают на модифицированной среде Чапека. Затем, выделенными изолятами шюкулируют экспериментальные образцы. Оценку устойчивости образцов осуществляют с использованием рулонного метода.
Для изучения возможной длительности устойчивости образцов к обыкновенной корневой гнили провели 12 циклов субкультивирования популяции В. sorokiniana на 2-х устойчивых сортах ячменя Scarlett и Viivi (балл поражения исходной популяцией - 3); 6 —ти сомаклонах поколения &ю (балл поражения исходной популяцией 2); восприимчивом сорте Белогорский 95 (балл поражения исходной популяцией -6).
После двенадцати субкультивирований при заражении «собственным» изо-лятом снизилась устойчивость сорта Scarlett. Реакция сорта Viivi на заражение «собственным» изолятом не изменилась, однако субпопуляции восприимчивого сорта Белогорский 95, поражали данные образцы на уровне восприимчивого контроля.
Балл поражения 4-х сомаклонов (GP741 I 4, GP741 I 7, GP741 115, GP7411 20) не изменился при инокуляции субпопуляциями с этих же образцов, но увеличился до 4-х, при инокуляции субпопуляциями, полученными с восприимчивого сорта. У двух сомаклонов (GP741 I 5 и GP741 11) балл поражения снизился с 2-х до - 1. У этих сомаклонов сохраняется высокий и средний уровень устойчивости при инокуляции всеми субпопуляциями, в том числе и популяциями, полученными после субкультивирования на восприимчивом сорте, (табл. 5.4.).
