Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Создание коллекций мутантов с изменениями морфогенеза и устойчивости к стрессовым факторам. Обзор литературы 13
Материалы и методы 20
Результаты и обсуждение
1.1. Коллекция мутантов резушки с изменениями морфогенеза 29
1.2. Коллекция мутантов резушки с измененной чувствительностью к индукторам окислительного стресса 44
1.3. Выделение мутантов из длительно-культивируемых каллу сных культур гороха 56
1.4. Селекция in vitro толерантных к гербицидам клеточных линий и растений-регенерантов гороха 75
Глава 2. Изучение генетического контроля морфогенеза побега растений in vivo
Обзор литературы 87
Материалы и методы 108
Результаты и обсуждение 111
2.1. Мутанты с изменением высоты побега 111
2.1.1. Морфологические особенности мутантов 111
2.1.2. Физиологические особенности мутантов 118
2.1.3. Изучение генетических взаимодействий 124
2.1.4. Генетические и физиологические механизмы регуляции роста стебля 128
2.2. Мутанты с аномальным развитием центральной оси побега 137
2.3. Мутанты с аномальным развитием латеральных органов побега 143
2.3.1. Морфологические особенности мутанта bra 143
2.3.2. Анализ экспрессии генов ZJ Tи TFLIB растениях дикого типа и мутантах bra 146
2.3.3. Изучение взаимодействия мутантного гена bra с генами Ify, tjll и арі 146
2.3.4. Роль гена BRACTEA в развитии побега растений 150
2.3.5. Морфологические особенности мутанта abruptus 154
2.3.6. Физиологический анализ мутанта abruptus 158
2.3.7. Изучение взаимодействия мутации abr с мутациями Ify, tfll 160
2.3.8. Изучение взаимодействия мутации bra с гомеозисными мутациями арі, ар2, арЗ, ag 169
2.3.9. Изучение взаимодействия мутации abr с мутацией сЫ 173
2.3.10. Изучение взаимодействия мутации abr с мутацией bra 174
2.3.11. Роль гена ABRUPTUS в развитии побега растений 176
2.4. Генетические и физиологические механизмы регуляции морфогенеза побега A. thaliana 181
Глава 3. Изучение генетического контроля роста и морфогенеза в культуре in vitro 183
3.1. Влияние генов резушки, контролирующих морфогенез растений, на рост и морфогенез каллусных культур 195
3.2. Влияние генов гороха, контролирующих морфогенез растений, на рост и морфогенез каллусных культур 201
3.3. Популяционно-генетические процессы в культуре in vitro 206
3.4. Источники генетической гетерогенности клеток в культуре in vitro 208
3.5. Возможные причины специфичности сомаклональной изменчивости 210
3.6. Генетические факторы, контролирующие рост и морфогенез каллусных культур 211
Глава 4. Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости к стрессовым факторам у мутантов с изменениями морфогенеза. Обзор литературы 216
Материалы и методы 225
Результаты и обсуждение 229
4.1. Фенотипические особенности мутантов с измененной чувствительностью к индукторам окислительного стресса 229
4.2. Физиологический анализ мутантов 233
4.3. Изучение активности антиоксидантных систем 235
4.4. Изучение активности и содержания супероксиддисмутазы и пероксидазы на разных стадиях онтогенеза. 237
4.5. Влияние норфлуразона на активность супероксиддисмутазы и пероксидазы 242
4.6. Изучение перекрестной устойчивости карликовых мутантов к параквату 246
4.7. Механизмы устойчивости к окислительному стрессу карликовых мутантов 249
Заключение 257
Основные выводы 263
Благодарности 265
Список литературы 266
- Коллекция мутантов резушки с изменениями морфогенеза
- Морфологические особенности мутантов
- Влияние генов резушки, контролирующих морфогенез растений, на рост и морфогенез каллусных культур
- Механизмы устойчивости к окислительному стрессу карликовых мутантов
Коллекция мутантов резушки с изменениями морфогенеза
В нашем распоряжении имелась коллекция мутантов резушки кафедры генетики, созданная СИ. Янушкевичем. На первом этапе работы нами были проведены исследования мутантов из этой коллекции, краткое описание которой содержится в работе Янушкевича (1985). В данной коллекции преобладали эмбриональные летали и пигментные мутации. В то же время имелись морфологические мутанты, которые могли быть полезны для исследований по теме диссертации. Подробная фенотипическая характеристика, сведения о локализации мутаций на генетической карте и об аллелизме с имеющимися в международных коллекциях мутантами отсутствовали. В связи с этим мы провели подробный фенотипический и генетический анализ мутантов и комплементационные тесты с мутантами из Ноттингемского международного банка семян (NASC) и мутантами из Центра биоресурсов штата Огайо (ABRC).
Генетический анализ позволил уточнить морфологические характеристики мутантов, данные о характере наследования ряда мутаций и выявить целый ряд дополнительных мутаций, присутствующих в линиях в гомозиготном состоянии, но не описанных автором коллекции (морфологические, пигментные, биохимические мутации). В линии К-164, помимо полудоминантной карликовой мутации папа, присутствовала рецессивная мутация spyndly2 (spy), вызывающая светло-зеленую окраску листьев и частично восстанавливающая рост цветоноса и плодовитость растений (Рис. 2). Мутации, способные вызвать частичную или полную фенотипическую супрессию интересующих мутантных признаков -ценный материал для изучения генетического контроля этих признаков. Направленное получение таких супрессорных мутаций - эффективный метод выявления новых генов, участвующих в тех же морфо-физиологических процессах, что и основная мутация.
В линии К-122 помимо описанной автором рецессивной мутации tae, вызывающей сужение листа, обнаружены еще 4 мутации:
(1) рецессивная пигментная мутация, вызывающая желто-зеленую окраску листьев,
(2) рецессивная мутация, вызывающая появление белых выцветающих пятен на листьях,
(3) рецессивная мутация laf2, увеличивающая ширину листа,
(4) рецессивная мутация agr, вызывающая нарушение гравитропизма корней.
После выделения мутации tae в отдельную линию жизнеспособность tae уменьшилась, а экспрессивность основного признака (узкий лентовидный лист) повысилась. Кроме того, обнаружено, что на отдельных листьях мутанта наблюдается формирование дополнительных меристематических очагов, из которых могут возникать укороченные побеги- розетки (Рис.3) или дополнительные листочки на краю листа (лист усложняется, Рис.3). Такие особенности описаны лишь у трансгенных растений (35S::KNAT1) с эктопической экспрессией гомеобокс-содержащего гена KNAT1, который был выделен по гомологии с геном KNOTTED1 (KN1) кукурузы (Lincoln et al., 1994). Сходный фенотип наблюдали у растений риса, табака и томата, трансформированных геном кукурузы KN1 или собственными ортологами этого гена под контролем 35S промотора (Matsuoka et al., 1993; Hake et al., 1995; Ori et al., 1999; Reiser et al., 2000). Превращение листьев в недетерминированные побегоподобные органы наблюдали у трансформированных растений салата с эктопической экспрессией гена KNAT1 A. thaliana (Frugis et al., 2001). У кукурузы и томата появление дополнительных меристематических очагов на листьях наблюдали также у растений, содержащих доминантные мутации в собственных гомеобоксных генах KN1 и LeT6/TKn2 (гомолога KN1\ соответственно (VoUbrecht et al., 1991; Avivi et al., 2000), приводящие к их усиленной экспрессии.
Мутация tae имеет рецессивный характер наследования. Можно предполагать, что мутация tae затрагивает не ген KNAT1, а его негативный регулятор. В настоящее время у A. thaliana уже идентифицированы два таких гена - гены AS1 и AS2 (Ori et al., 2000; Semiarti et al., 2001). Рецессивные мутации в этих генах приводили к формированию волнистых асимметричных листьев и эктопической экспрессии гомеобоксных генов генов KNAT1 и KNAT2 в листьях (у дикого типа гены KNAT1 и KNAT2 экспрессируется только в AM побега). Поскольку у томата, имеющего сложные листья, .ЮУ7-побобные гены экспрессируются не только в AM, но и в развивающихся листьях, высказано предположение, что формирование простого листа может быть результатом функционирования негативных регуляторов (подобных генам AS1 и AS2), ограничивающих экспрессию гомеобоксных генов в листьях (Ori et al., 2000). Мутант tae имеет иной и гораздо более яркий фенотип, чем мутанты asl и as 2, что говорит о том, что нами идентифицирован новый ген - предположительный регулятор гомеобоксных генов.
Помимо узколистности мутант tae характеризуется еще рядом интересных особенностей структуры побега: нарушением апикального доминирования, тенденцией к фасциации стебля.
В линии К-156, помимо описанной автором карликовой мутации ег2 (после проведения тестов на аллелизм с карликовыми мутантами из банка NASC мутация переименована нами в 1е-2), обнаружена кодоминантная мутация pxd, изменяющая спектр пероксидаз (Рис.4, 5). Ген PXD по результатам проведенного нами генетического анализа контролирует образование трех мажорных неспецифических форм пероксидазы, активность которых еще больше возрастает при стрессовых воздействиях (Лебедева и др., 2003). Мутаций, вызывающих изменение подвижности сразу нескольких форм пероксидазы, ранее описано не было. В связи с этим было проведено молекулярное картирование гена PXD (Рис.6), показавшее, что ген PXD локализован на расстоянии 6.5±1.5 сМ от RAPD1-маркера (среди 41 растений, гомозиготных по мутации pxd, выявлено 5 рекомбинантов). После клонирования и секвенирования последнего, определено его положение на физической карте A.thaliana хромосомы 5 в ВАС-клоне MYH9 (верхнее плечо хромосомы, 3047 - 3129 т.п.н. на физической карте). С помощью ПЦР-анализа растений F2 от скрещивания мутанта pxd с растениями расы Dijon со специфическими праймерами к клонированному RAPD1-маркеру подтверждены данные о совместном наследовании гена PXD и клонированного фрагмента (Рис. 6). В районе локализации RAPD1-маркера (ВАС-клона MYH9) находятся следующие гены, предположительно кодирующие пероксидазу (Рис.7): слева -высоко гомологичные гены P5S и Р54 (1900-2200 т.п.н.), возникшие в результате тандемной дупликации, а справа гены Р55 (-4500 т.п.н), Р56 (-4900 т.п.н), Р57 (-5800 т.п.н) (классификация генов пероксидаз Tognolli et al., 2002).
Поскольку ген Р57 по данным анализа EST (Лебедева и др., 2003) обладает довольно высоким и неспецифическим характером экспрессии, мы амплифицировали и секвенировали его копию из растений дикого типа и мутанта pxd. У мутанта в гене Р57 выявлено несколько незначимых замен нуклеотидов, т.е. мутация pxd затрагивает не ген Р57. На основании одной из замен, затрагивающих сайт рестрикции Tagl, сконструирован кодоминантный CAPS-маркер (CAPSP57), выявляющий различия растений дикого типа и мутанта pxd. Анализ F2 с помощью этого маркера показал, что расстояние от PXD до CAPSP57 составляет 11.3 ± 1.9 сМ (из 40 растений F2, гомозиготных по аллелям PXD и pxd выявлено 6 рекомбинантных гетерозигот). Расстояние от sRAPDl до CAPSp57 равно 5.9 ± 2 сМ, так же как и расстояние от PXD до sRAPDl (Рис. 7). Следовательно, ген PXD локализован не справа, а слева от RAPD-маркера, где расположены гены Р53 и Р54. Секвенирование генов Р53 и Р54 из растений дикого типа и мутанта pxd позволит выяснить, кодирует ли ген PXD пероксидазу, которая образует 3 изоформы, или другой белок, осуществляющий посттранскрипционную или посттрансляционную модификацию пероксидаз, кодируемых несколькими генами.
После возвратных скрещиваний морфологические мутации па, tae и 1е-2 были выделенны нами в отдельные линии. При этом жизнеспособность и плодовитость описанных СИ. Янушкевичем мутантов значительно снизилась. Например, после выделения мутации le-2 в отдельную линию и 5 возвратных скрещиваний с исходной расой Dijon всхожесть семян мутанта к-2 снизилась до 70% (всхожесть семян исходной линии К-156 составляла не менее 90%), а выживаемость растений - до 50% (у К-156 она составляла 95%). По-видимому, обнаруженные дополнительные мутации возникли спонтанно при длительном, « 30-35 летнем, поддержании линий путем самоопыления и были отобраны в гомозиготном состоянии, поскольку повышали жизнеспособность и фертильность основных мутантов. О том, что дополнительные мутации были отобраны в процессе поддержания линий, а не были привнесены в них из других линий, свидетельствует тот факт, что обнаруженные нами дополнительные мутации не показали аллелизма с мутациями из других линий коллекции кафедры генетики.
Дополнительные морфологические мутации с четким фенотипическим проявлением обнаружены также в линии К-158. Помимо карликовой мутации ег-2, которая была обозначена автором как ег4, в линии обнаружены мутации, показавшие аллелизм с имеющимися в коллекции мутациями glabra2 (gl2) и apetalal (арі). При возвратных скрещиваниях мутация ег-2 была выделена в отдельную линию, причем жизнеспособность мутанта ег-2 при этом не уменьшилась. По-видимому, линия К-158 имеет гибридное происхождение. Гибридное происхождение имеет и линия К-205. Помимо мутации, вызывающей формирование булавовидных стручков (c/v/), в этой линии выявлена мутация asJ, которая есть в коллекции (линия К-102) и пигментная мутация, вызывающая светло-зеленую окраску листьев. При разделении мутаций в разные линии жизнеспособность мутации c/v/ даже повысилась.
Морфологические особенности мутантов
Основной отличительной особенностью мутантов ег-1 (линия К-155), er-2 (К-158), er-З (К-161), ег-4 (М-3), er-5 (М-4) и le-2 (К-156) является укорочение длины главного стебля в 2-4 раза по сравнению с растениями расы Dijon (Табл.13). Кроме того, у этих мутантов наблюдалось также укорочение гипокотиля в 1.5-3 раза (Табл.13), что характерно для мутантов со сниженным содержанием гиббереллинов и брассиностероидов и мутантов, нечувствительных к этим фитогормонам (Clouse , 1996; Li et al., 1996; Azpiroz et al., 1998).
Мутант па (линия К-164) характеризовался более существенным укорочением стебля: в 8 раз у гетерозиготных растений и в 13 раз у гомозиготных по сравнению с растениями дикого типа, но в отличие от других мутантов, мутант па имел нормальную длину гипокотилей (Табл. 13).
Снижение высоты стебля у мутантов ег-1, ег-2, ег-3, ег-4, ег-5, па связано с уменьшением числа узлов (у мутантов ег-2, ег-4 и па это уменьшение статистически достоверно), а также со снижением длины вегетативных и генеративных междоузлий стебля (Табл.13). Мутанты 1е-2 отличались от мутантов других линий тем, что число узлов стебля у него было достоверно выше, чем в контроле (Табл.13), т.е. карликовый фенотип у растений этой линии полностью связан со снижением длины вегетативных и генеративных междоузлий стебля.
Микроскопический анализ показал, что эпидермальные клетки гипокотилей и междоузлиев мутантов ег-2 и 1е-2 мельче, чем у дикого типа в 1.5-2 раза, а их число в междоузлиях примерно такое же, как и у дикого типа (данные не приводятся). У мутанта па размер эпидермальных клеток гипокотилей не отличался от такового у дикого типа (Рис. 24). В то же время, длина клеток междоузлиев была меньше, чем у растений дикого типа в 23 - 27 раз (Рис.24, Табл.14), а их число выше, чем у растений дикого типа. (Табл.14). Следовательно, уменьшение длины цветоносов у мутанта па связано исключительно с уменьшением размера составляющих их клеток. Интересно, что размер эпидермальных клеток всех латеральных органов, формирующихся цветоносом (листьев, цветоножек, всех органов цветка), у мутанта па не отличался от таковых у дикого типа. Более того, в отличие от карликовых мутантов, дефицитных по ГА, имеющих укороченные стручки, длина стручков мутантов па была больше, чем у растений дикого типа.
У большинства карликовых мутантов (исключение представляет мутант 1е-2) наблюдали формирование дополнительных розеточных побегов, что свидетельствует о нарушении апикального доминирования. У мутантов ег-1, ег-2, ег-3 и ег-4 линий наблюдали появление 1-2х дополнительных розеточных побегов, отсутствующих у растений дикого типа (Табл.13). У мутантов па число дополнительных розеточных побегов достигало иногда 12 (в среднем - 5,5 и 7,1, у цветущих гомо- и гетерозиготных мутантов, соответственно, Табл.13, Рис. 26). Исследование структуры апикальных частей молодых цветоносов, которые только начинают приподниматься над поверхностью розетки (2-5мм высотой) показало, что AM цветоносов гетерозиготных мутантов па в 2-3 раза меньше, чем у дикого типа (Рис. 25). Поскольку размер клеток AM мутантов и растений дикого типа одинаков, уменьшение размера AM у мутанта па связано с уменьшением числа клеток AM. По-видимому, уменьшение числа узлов цветоноса у мутанта па является следствием уменьшения пула клеток AM.
У гомозигот по мутации па главный цветонос, как правило, не развивался. В то же время уже на вегетативной стадии развития наблюдалось развитие почек из меристем в пазухах розеточных листьев. Сформировав 1-2 листа, почки прекращали развитие. В пазухах листьев этих побегов тут же начинали формироваться новые почки и побеги. В результате розетка становилась похожей на кочку из многочисленных листочков.
Лишь 5-10% гомозиготных растений, выращенных в условиях теплицы в почве, формировали цветки, причем не на главном, а на дополнительных побегах, развившихся из пазух нижних листьев розетки. После формирования нескольких цветков нормальной морфологии и фертильных стручков пул клеток AM истощался и AM прекращала пролиферацию (Рис.25). Низкая частота зацветающих мутантных гомозигот не связана с поздним зацветанием. Подтверждением этого служит одинаковое число листьев розетки у растений дикого типа, гомо- и гетерозигот по мутации па (Табл. 13), свидетельствующее о том, что длительность ювенильнои стадии развития и время индукции цветения у мутантов и растений дикого типа примерно одинаковое.
У других карликовых мутантов (кроме ег-4) наблюдали удлинение ювенильнои (розеточной) стадии развития на 7-12 дней. У мутантов ег-1, ег-2, ег-3 это приводило к увеличению числа розеточных листьев (Табл.13). Наблюдается также задержка появления стебля, времени зацветания, времени созревания и удлинение общей продолжительности жизненного цикла. Мутанты линии ег-4 в отличие от других мутантов формировали стебель, зацветали и созревали на 3-7 дней раньше, чем исходная раса.
Следует отметить, что замедление скорости развития у мутантных растений является плейотропным эффектом мутаций карликовости. Об этом свидетельствовало отсутствие расщепления по этим признакам в F2 поколении от скрещивания с исходными расами или маркерными линиями. Раннее время зацветания, обнаруженное у ег-4, по-видимому, не является эффектом карликовой мутации. В F2 от скрещивания с растениями расы Dijon обнаружена очень широкая вариабельность по времени зацветания среди карликовых форм. Возможно, что более раннее развитие растений линии ег-4 связано с присутствием в линии мутации устойчивости к норфлуразону, не имеющей проявления на уровне морфологических признаков.
У всех мутантов, кроме мутанта па, листья имели более округлую форму за счет укорочения длины как черешка, так и листовой пластинки, и более темную окраску, чем у растений дикого типа. Особенно ярко выражены эти признаки у мутанта 1е-2. Листья мутанта па были слегка волнистыми, что особенно заметно у гомозигот.
Таким образом, анализ морфологических особенностей мутантов позволяет четко разделить их на 3 основные фенотипические группы, каждая из которых имеет свои уникальные особенности: ег-1, ег-2, er-З, ег-4, ег-5 - полукарликовые мутанты, характеризующиеся укорочением длины гипокотиля и стебля за счет уменьшения длины составляющих их клеток. Кроме того, у мутантов этой группы наблюдается некоторое снижение числа узлов и нарушение апикального доминирования.
1е-2 - полукарлик, характеризующийся значительным укорочением длины междоузлий и гипокотилей, связанное с уменьшением длины составляющих их клеток. В отличие от мутантов 1ой группы у 1е-2 число узлов стебля увеличено.
па - карлик с очень существенным укорочением стебля (в зарубежной литературе такие мутанты называют суперкарликами), связанным с укорочением междоузлий и снижением числа узлов, и характеризующийся ярко выраженным нарушением апикального доминирования
Влияние генов резушки, контролирующих морфогенез растений, на рост и морфогенез каллусных культур
Проявление функции гена ABRUPTUS в системе in vitro. Исследование способностей к каллусогенезу эксплантов из листьев растений расы Dijon (дикий тип) и мутантов abr на средах с разными концентрациями ауксина показало, что формирование каллуса происходило при концентрации НУК не менее 0.1 мг/л. Через 20 дней культивирования эксплантов на среде с 0.1 мг/л НУК каллусогенез наблюдали у 72% эксплантов из нормальных растений и только у 30% эксплантов мутантов. На 30-й день культивирования каллус формировали 100% эксплантов обоих генотипов. При этом наблюдалась лишь частичную дедифференцировку эксплантов. Через 40 дней средняя масса каллуса из мутантных растений оказалась в два раза выше (63+6.5 мг) чем масса контрольных каллусов (31±3.4мг, Рис.59а).
На среде с 1 мг/л НУК происходила полная дедифференцировка листовых эксплантов. В конце культивирования средняя масса каллусов из мутантных растений также оказалась достоверно выше (776±48.9мг), чем из нормальных растений (776±48.9мг, Рис. 59а).
Для того, чтобы убедиться, что различия между двумя генотипами по способности к росту определяются особенностями клеточного метаболизма, а не различным содержанием гормонов в растениях - источниках эксплантов (это различие было выявлено при анализе содержания ИУК в растениях, см. главу 2), определяли динамику прироста вторичного каллуса на среде с 0.5 мг/л НУК и 0.2 мг/л 6-БАП (Рис. 60). Обнаружено, что прирост вторичных каллусов у мутантов оставался почти тем же, что и у каллусов из нормальных растений в течение 24 дней культивирования, но перестал снижаться и даже увеличился после 30 и 37 дней (Рис. 60). Эти данные свидетельствуют о том, что чувствительность клеток мутанта abr к ауксину и его эндогенное содержание в первые недели культивирования не отличались существенно от контрольного уровня.
Мутация оказывала влияние и на морфогенез в культуре ткани. В первичных листовых и корневых каллусах из нормальных растений наблюдали формирование побегов (почек и розеток), причем наибольшая частота каллусов с побегами наблюдалась при концентрации НУК 0.1 мг/л. Регенерационные способности корневого каллуса оказалась значительно выше (75 ± 17.2% каллусов с побегами и почками), чем листового (15 ± 4.7%, Рис. 596).
При концентрации 1 мг/л наблюдали побегообразование у 17±3.1% каллусов из корней и лишь у 6.7±2.3% каллусов из листьев растений дикого типа (данные на рисунке не приведены). Ни на одном из каллусов, полученных из мутантных растений на средах с 0.1 мг/л НУК на 40-й день не было обнаружено нормальных почек или розеток. На двух каллусах из корневых эксплантов на среде с 0.1 мг/л НУК наблюдали образование листьев, которые вновь начинали дедифференцироваться.
Частота регенерации побегов из вторичных корневых каллусов дикого типа на среде с 0.5 мг/л НУК (15±4.2%) была примерно такой же, как и у первичных корневых каллусов на среде с 1 мг/л НУК (17±5.1%). Способность к морфогенезу показали также вторичные корневые каллусы из мутантных растений (5% каллусов с побегами). Еще выше она была на среде регенерации, содержащей 1 мг/л БАП и 0.05 мг/л НУК (18±4.6% и 48±7.3% для каллусов мутантного и нормального генотипа, соответственно). Эти различия по частоте побегообразования вторичных корневых каллусов из нормальных и мутантных растений также достоверны.
Каллусы A. thaliana активно формировали корни и корневые волоски даже при концентрации НУК 0.1 мг/л. Доля каллусов с корнями у мутантов (100%) была выше, чем у растений исходной расы (77±7, Рис. 59в). Еще четче различие между двумя генотипами по способности к ризогенезу оказалось при расчете средней массы корней на эксплант (77±7мг у мутанта и 2.5±2.1мг у дикого типа, Рис. 59в).
Таким образом, исследования in vitro выявили существенные различия процессов роста и морфогенеза растений дикого типа и мутантов аЪг на уровне культивируемых клеток. В первичных каллусах из мутантов аЪг наблюдали признаки "гиперауксинезации", то есть признаки, которые обычно наблюдаются при внесении в среду высоких концентрации ауксина: более высокая масса каллуса, снижение частоты побегообразования и усиление процессов ризогенеза. Подобные признаки наблюдали при изучении в культуре in vitro мутанта superroot (sur) A. thaliana, характеризующегося 2-3-кратным увеличением содержания эндогенного ауксина (см. обзор литературы). Такие эффекты, по-видимому, следовало ожидать и при увеличении чувствительности растительных клеток к ауксину. В случае мутанта abr наблюдаемые признаки гиперауксинезации, скорее всего имеют другую причину. При увеличении чувствительности к ауксину или его эндогенного содержания можно было ожидать увеличения способности к каллусогенезу у мутантов и более высокой скорости прироста каллуссной массы. В нашем случае прирост вторичных каллусов у мутантов оставался почти тем же, что и у каллусов из нормальных растений в течение 24 дней культивирования, но перестал снижаться и даже слегка увеличился после 30 и 37 дней. Следовательно, чувствительность клеток мутанта abr к ауксину и его эндогенное содержание в первые недели культивирования не отличались существенно от контрольного уровня. Можно предполагать, что увеличение скорости прироста мутантных каллусов после нескольких недель культивирования, а также более высокий вес первичных каллусов после 40 дней культивирования связаны с накоплением ауксина в культивируемых клетках вследствие нарушения полярного транспорта ауксина, продемонстрированного при исследовании растений (см главу 2).
Для проверки этого предположения был проведен анализ содержания ИУК в каллусах, полученных из разных органов мутантных растений и растений дикого типа. Анализ содержания ауксина в каллуо ных культурах полученных из семядолей, листьев и корней показал 2-6 кратное увеличение его содержания в клетках мутанта abr по сравнению с клетками дикого типа (Табл. 22).
Примечание: приведены средние значения величин уровня ИУК и погрешности их измерения. Биологическая повторность 3-кратная. Достоверность полученных значений проверяли методом однофакторного дисперсионного анализа. В работе обсуждаются только те результаты, которые показывали достоверные различия в ходе однофакторного дисперсионного анализа при уровне значимости не менее 95%.
Обнаруженное нами накопление ауксина клетками мутанта in vitro хорошо объясняет особенности роста и морфогенеза мутанта abr в культуре тканей: увеличение скорости роста каллусов, интенсивное образование корней и отсутствие побегообразования. Увеличенное содержание ауксина в клетках может объясняться увеличением уровня синтеза ИУК, снижением процессов ее катаболизма или нарушением оттока ИУК из клеток, который осуществляется с участием белков системы полярного транспорта ауксина (ПТА). Инверсия градиента ИУК в цветоносе мутанта abr вместе с данными о снижении у него уровня ПТА указывают на связь увеличенного содержания ИУК с нарушением оттока ИУК из клеток.
Проявление функции гена LEPIDA в системе in vitro. Исследования в культуре in vitro показали, что мутация по гену LE также приводит к изменению роста и морфогенеза первичных и вторичных каллусных культур. Первичные и перевиваемые каллусы мутанта 1е-2 характеризуются низким приростом. Кроме того, в отличие от мутанта abr, у мутанта к-2 обнаружена высокая способность к формированию побегов не только из корневого (как у дикого типа), но и из листового каллуса, причем в последнем случае побеги формировались даже на средах без цитокинина (Рис.61а,б).
Механизмы устойчивости к окислительному стрессу карликовых мутантов
Карликовые мутанты, проявляющие повышенную устойчивость к ОС, были получены с помощью селекции на среде, содержащей гербицид НФ. НФ блокирует синтез каротиноидов из геранилгеранилпирофосфата, который является общим предшественником как для синтеза АБК, так и для синтеза ГК. При выращивании растений в присутствии НФ или при экзогенной обработке растений этим агентом наблюдается снижение содержания каротиноидов в растениях и, как следствие, уменьшение содержания образующейся из каротиноидов АБК (Zivanovic et al., 1995). Дефицит каротиноидов приводит также к быстрой деструкции хлоропластов, которые являются главным местом биосинтеза и метаболизма ГА (Hilton, Smith, 1980). Это может приводить к дефициту ГА. По-видимому, изменение содержания этих важных для прорастания и развития проростков гормонов при выращивании проростков в присутствии НФ приводит к отбору мутантов, которые имеют либо измененный уровень ГА и АБК, либо измененную чувствительность к ним.
Действительно, проведенные нами физиологические исследования обнаружили корреляцию увеличения толерантности к НФ с увеличением содержания АБК или чувствительности к ней. Аллельные мутации ег-3, ег-4 и ег-5, вызывающие более высокий уровень НФ-толерантности, имеют более высокое содержание АБК по сравнению с аллелью ег-1, вызывающей низкий уровень устойчивости и ег-2, чувствительной к НФ (Табл 27). Мутация /е-2 приводит к увеличению чувствительности к АБК на стадии прорастания семян (Рис. 72). Раса Enkheim, характеризующаяся большей устойчивостью к НФ, содержит на 70% больше активной формы АБК, чем менее устойчивая раса Dijon (Табл.27). Лишь в случае мутации па не было обнаружено ни увеличения содержания АБК, ни изменения чувствительности семян к данному гормону.
Проведенное нами изучение влияния экзогенного гиббереллина (ГА3) на карликовые мутанты A.thaliana (глава 2) показало, что мутанты по локусу ER полностью или частично восстанавливали рост цветоносов под влиянием ГА3. Мутант па не реагировал на обработку ГА3 (Ежова и др., 19976). Эти данные позволили предположить, что уменьшение длины цветоносов у мутантов может быть связано с ГА-дефицитностью (у мутанты по локусу ER) или нечувствительностью к данному фитогормону (мутант па). Это предположение не противоречит приведенным выше данным об изменениях содержания и чувствительности к АБК, поскольку ГА и АБК, образующиеся из общего предшественника геранилгеранилпирофосфата являются гормонами антогонистами (Finkeistein, Zeevaart, 1994). В исследованиях на горохе показано, что мутации, блокирующие синтез ГК, могут приводить к увеличению содержания АБК (Коф, 1991). Возможно, наблюдаемое у мутантов ег-3, ег-4 и ег-5 увеличение содержания АБК, также является следствием снижения биосинтеза гиббереллина. Увеличение чувствительности к АБК на стадии прорастания семян также является известной характеристикой ГА-дефицитных мутантов, которая, по-видимому, связана с увеличением относительного содержания АБК у мутантов. Именно по неспособности семян к прорастанию были выделены ГА-дефицитные мутанты Arabidopsis gal, ga2, ga3 (Koornneef, van der Veen, 1980).
Таким образом, проведенные исследования карликовых мутантов показали, что их устойчивость к НФ коррелирует с изменением гормонального статуса -содержания или чувствительности к гиббереллину и АБК. АБК является важнейшим "стрессовым гормоном", и его содержание увеличивается под действием стрессов самой разной природы (Zeevaart, Creelman, 1988). Добавление экзогенной АБК к среде с НФ полностью снимает обесцвечивающее действие гербицида (Солдатова и др., 1996), что может быть связано как со снижением активности фотосинтеза в результате смыкания устьиц, так и с активацией под действием АБК защитных антиоксидантных систем. В пользу участия АБК в регуляции экспрессии генов адаптивного ответа свидетельствуют ранее проведенные исследования, показавшие влияние АБК на экспрессию генов, контролирующих образование каталаз (Williamson, Scandalios, 1992), пероксидаз (Roberts, Kolattukudy, 1989; Chaloupkova, Smart, 1994) и СОД (Tanaka, 1998). В промоторах генов СїьТлСОД риса выявлены регуляторные цис-элементы (abscisic acid responsive elements - ABRE), отвечающие на воздействие АБК (Tanaka, 1998). Ген sodCcl содержит 2 таких элемента и характеризуется конститутивной экспрессией в нормальных условиях. Ген sodCcl экспрессируется при воздействии экстремальных стрессовых условий и содержит 4 повтора ABRE.
Экзогенная обработка растений ингибитором биосинтеза ГА - паклобутразолом приводит не только к снижению содержания ГА, но и к увеличению экспрессии генов «классической» пероксидазы и аскорбатпероксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионредуктазы (Pinhero et al., 1997). Мутанты гороха la crys с изменённым ответом на действие гибберелинов, имеющие более длинные междоузлия, характеризуются пониженным содержанием пероксидаз (Jones, 1985). Эти данные свидетельствуют о том, что ГА может негативно регулировать уровень активности антиоксидантных ферментов в клетках растений. Поскольку ГА и АБК - гормоны антогонисты, в настоящее время еще не ясно, регулирует ли экспрессию генов антиоксидантной системы непосредственно ГА или действие этого гормона опосредовано через АБК.
Проведенные нами исследования показали, что из двух карликовых ГА-дефицитных мутантов лишь один ga5 обладает повышенной устойчивостью к НФ. О различии реакции на стрессовые воздействия Г А-дефицитных мутантов и высоком уровне устойчивости к засухе мутанта ga5 сообщалось и в работе (Vartanian et al., 1994). По-видимому, для проявления адаптивного ответа важен не столько уровень гормона, сколько уровень гормонального сигнала. Можно предполагать, что сопряженность адаптивного ответа и морфогенеза связана с тем, что оба этих ответа контролируются одной гормональной сигнальной системой. В пользу этого свидетельствуют данные об изменении чувствительности к НФ у мутантов с нарушениями передачи ГА-сигнала (па и gai).
Участие в регуляции сигналов двух типов (стрессовых и морфогенети-ческих) показано для ПК томата Pto (Martin et al., 1993), отвечающей за развитие реакции гиперчувствительности и устойчивости к Pseudomonas syringae (Zhou et al., 1995). ПК Pto не имеет LRR домена, но относится к тому же подсемейству серин-треониновых ПК, что и гены CLV1, BR11, Ха21 (Рис. 81). Показано, что эта киназа способна связываться с продуктами генов Ptil, Pti2, PU3, Pti4, Pti5, PU6 и морфологических признаков, характерные для растений, обработанных экзогенным этиленом (Wu et al., 2002). Таким образом, ген Pto томата, так же как и ген ER резушки контролируют одновременно процессы морфогенеза и адаптивного ответа на действие патогена (Рис. 82а). Активирование ПК Pto происходит после ее связывания с белком AvrPto патогена Pseudomonas syringae. Активность ПК ER, как уже отмечалось в главе 2, может предположительно регулироваться синим светом.
