Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги 9
1.1.1. Метаболизм пуринов. Сравнительная характеристика метаболизма пуринов у Е. coli и S. cerevisiae 10
1.1.1.1.Биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo 13
1.1.1.2.Утилизация и взаимопревращение пуринов 20
1.1.2. Мутагенные аналоги пуринов. Механизм действия мутагенных предшественников ДНК 24
1.1.3. 6-гидроксиламинопурин 31
1.2. Использование функциональной геномики для масштабного поиска генов, контролирующих чувствительность модельных микроорганизмов Е. coli и S. cerevisiae к различным мутагенам 37
1.3.Постановка задачи 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе 45
2.1.1. Штаммы бактерий... 45
2.1.2. Штаммы дрожжей 46
2.1.3. Плазмиды 47
2.2. Среды и условия культивирования 47
2.3. Реактивы 49
2.4. Методы генетики микроорганизмов 49
2.4.1. Бактерии 49
2.4.1.1. Стандартные генетические методы 49
2.4.1.2. Качественный тест на токсичное и мутагенное действие аналогов 49
2.4.1.3. Количественный тест на индукцию прямых мутаций в гене Rif. 50
2.4.1.4. Тестирование штаммов на чувствительность к хлорату калия 50
2.4.1.5. Создание геномной библиотеки инсерционных мутантов Е. coli 51
2.4.1.6. Анализ бактериальных геномных библиотек с целью выявления генов, контролирующих чувствительность к ГАП 52
2.4.2. Дрожжи 54
2.4.2.1. Стандартные генетические методы 54
2.4.2.2. Получение штаммов дрожжей 54
2.4.2.3. Тестирование мутагенной активности аналогов оснований 56
2.4.2.4. Тестирование чувствительности клеток дрожжей к токсичному действию ЭМС и УФ-света 57
2.4.2.5. Геномный скрининг с использованием дрожжевой библиотеки делеционных мутантов для поиска штаммов, чувствительных к ГАП 58
2.5. Молекулярно-генетические методы 60
2.5.1. Стандартные молекулярно-генетические методы 60
2.5.2. Идентификация места инсерции транспозона EZ-Tn5
2.6. Статистические методы 61
ГЛАВА 3. Результаты 62
3.1. Поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у бактерий Е. coli 62
3.1.1. Создание и анализ случайных геномных библиотек инсерционных мутантов Е. coli 62
3.1.2. Результаты скрининга геномных библиотек случайных инсерционных мутантов у бактерий 63
3.1.2.1. Гены, инактивация которых приводит к повышению чувствиельности клеток к ГАП 66
3.1.2.2. Ген YhhP принадлежит МоКо-зависимому пути детоксикации
3.1.2.3. Ген Fre контролирует новый МоКо-независимый путь детоксиеации ГАП 73
3.1.2.4. Анализ ауксотрофов 77
3.1.2.5. Гены, инактивация которых приводит к супрессии ГАП8-фенотипа у мутантов усЪХ. 79
3.2. Геномный скрининг с целью выявления генов, контролирующих чувствительность дрожжей S. cerevisiae к ГАП 81
3.2.1. Подбор условий для скрининга дрожжевой делеционной библиотеки 81
3.2.2. Результаты скрининга дрожжевой библиотеки делеционных мутантов 83
3.2.3. Проверка чувствительности ГАП , мутантов идентифицированных в геномном скрининге, к действию других мутагенов 87
3.3. Изучение влияния мутаций в генах ade4, adel6, adel7u adel3 на чувствительность клеток дрожжей к ГАП 89
3.4. Идентификация генов, отвечающих за активацию ГАП у дрожжей...92
ГЛАВА 4. Обсуждение 96
4.1. Генетический контроль чувствительности Е. coli к мутагенному и токсичному действию ГАП 96
4. 2. Генетический контроль чувствительности дрожжей S. cerevisiae к мутагенному и токсичному действию ГАП 107
4. 3. Сравнение генетического контроля ГАП-индуцированного мутагенеза у бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae 115
Выводы 119
Список литературы
- Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги
- Штаммы и плазмиды, использованные в работе
- Поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у бактерий Е. coli
- Генетический контроль чувствительности Е. coli к мутагенному и токсичному действию ГАП
Введение к работе
Среди химических мутагенов особое положение занимают аналоги природных азотистых оснований, мутагенные свойства которых обусловлены способностью включаться в ДНК и провоцировать ошибки ДНК-полимераз в последующих раундах репликации. Впервые репликативный механизм действия аналогов оснований был предложен Фризом в 1959 году (Freese, 1959). В более поздних работах данная модель получила экспериментальное подтверждение, а отдельные этапы мутагенеза, индуцированного аналогами, были детально исследованы. Так, была показана возможность эндогенной генерации ряда аналогов, что является существенным источником спонтанных мутаций. Для некоторых аналогов были идентифицированы ферменты, контролирующие превращение этих соединений в их истинную мутагенную форму - соответствующие дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (дНТФ), и участвующие таким образом в активации аналога как мутагена. Репликативные ДНК-полимеразы в значительной мере определяют степень мутагенной активности аналогов оснований. Повреждения ДНК, вызванные включением аналогов, могут быть репарированы как общими, так и специфичными для каждого аналога системами репарации (Negishi et al., 1994).
Аналог аденина 6-гидроксиламинопурин (ГАП), впервые синтезированный как потенциальный противоопухолевый агент (Giner-Sorolla and Bendich, 1958), оказался сильным мутагеном для широкого круга живых организмов - вирусов, бактерий, грибов и млекопитающих. Современные данные указывают на то, что ГАП действует по репликативному механизму, как классический аналог оснований. Включаясь в клеточный метаболизм ферментами утилизации пуринов, ГАП превращается в соответствующий дНТФ и участвует в репликации.
ДНК-полимеразы могут ошибочно встраивать ГАП напротив цитозина, что приводит к возникновению транзиций в последующих раундах репликации.
Наиболее хорошо генетический контроль ГАП-индуцированного мутагенеза изучен у бактерий Escherichia coli и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что у бактерий к сверхчувствительности клеток к ГАП приводит нарушение биосинтеза молибденового кофактора (МоКо) (Kozmin et al., 2000). Однако молибдофермент, переводящий ГАП в нетоксичную форму, пока не обнаружен. У дрожжей повышенной чувствительностью к ГАП обладают штаммы, несущие мутации в гене НАМ1. Ген НАМ1 кодирует фермент нуклеотидпирофосфорилазу, который удаляет ГАП из пула предшественников ДНК. Гомологи гена НАМ1 обнаружены практически у всех организмов (Noskov et al., 1996). Однако бактериальный гомолог гена НАМ1, ген RdgB не оказывает существенного влияния на чувствительность клеток Е. coli к ГАП (Burgis et al., 2003).
Для того чтобы понять, насколько универсальны механизмы мутагенного действия ГАП у разных представителей про- и эукариотических организмов мы предприняли глобальный поиск генов, контролирующих чувствительность к этому аналогу у бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae. Для этого использовали созданную нами геномную библиотеку инсерционных мутантов Е. coli и делеционную библиотеку дрожжей. В результате проведенного геномного скрининга были идентифицированы десятки генов, инактивация которых приводит к изменению чувствительности клеток дрожжей и бактерий к ГАП. Мы показали, что как бактерии, так и дрожжи имеют развитые системы защиты от мутагенного и токсичного действия ГАП, но эти системы значительно отличаются. У бактерий основной вклад в детоксикацию ГАП вносит МоКо-зависимая система, в то время как у дрожжей ключевая роль в этом процессе принадлежит ферментам метаболизма пуринов. У дрожжей мы не обнаружили влияния общих систем репарации на уровень ГАП-индуцированного мутагенеза. У бактерий ГАП узнается специфической эндонуклеазой, что индуцирует возникновение двойных разрывов при репликации, которые репарируются системой рекомбинационной репарации. Общей чертой у исследованных микроорганизмов является способность ГАП включаться в клеточный метаболизм ферментами утилизации пуринов и участвовать в реакциях, характерных для аденина.
Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют значение для более полного понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Данные, представленные в работе, могут быть полезны при создании новых тест-систем для выявления факторов, нарушающих пул предшественников ДНК и являющихся источником спонтанных и индуцированных мутаций. У человека известны наследственные заболевания, вызванные мутациями в генах, гомологичных некоторым из идентифицированных нами в этой работе. Штаммы бактерий и дрожжей, несущие мутации соответствующих генов, могли бы стать моделями для изучения этих заболеваний.
Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги
Точность и эффективность синтеза ДНК во многом зависит от количественного и качественного состава предшественников ДНК -дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ) аденина, гуанина, тимина и цитозина. В клетке Е. coli содержание указанных предшественников ДНК в любой момент времени не превышает 1 % от количества, необходимого для репликации всей геномной ДНК. В клетках млекопитающих пул дНТФ еще ниже (табл. 1). Поэтому синтез предшественников ДНК происходит постоянно.
Отклонение соотношения предшественников ДНК от оптимального приводит к нарушениям репликации и остановке клеточного деления, а модифицированные дНТФ могут служить источником возникновения спонтанных и индуцированных мутаций, поскольку ДНК полимеразы часто совершают ошибки при включении модифицированных нуклеотидов во вновь синтезированную цепь или при репликации на матрице, содержащей аналог (Negishi et al., 1994; Inoue et al., 1998). Такие побочные продукты метаболизма, как дНТФ урацила, гипоксантина или ксантина, постоянно присутствуют в клетке и потенциально способны индуцировать мутации. Также, внутриклеточное образование мутагенных аналогов, например, дНТФ 8-оксогуанина или 2-оксоаденина, может происходить под действием окислительного стресса (Kamiya, 2003). Экзогенные аналоги оснований, обладающие мутагенными свойствами, могут поступать в клетку из окружающей среды в составе лекарственных противоопухолевых и противовирусных препаратов.
В клетке существует тонкая регуляция процессов биосинтеза и утилизации нуклеотидов, направленная на поддержание оптимального состава предшественников ДНК. Поскольку данное исследование посвящено изучению механизмов действия мутагенных аналогов пуринов, кратко рассмотрим метаболизм пуриновых предшественников ДНК, который наиболее хорошо изучен у модельных микроорганимов бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae.
Для синтеза пуриновых нуклеотидов используются два принципиально различных пути. Один из них - биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo (БПН), который осуществляется на уровне нуклеотидов без образования свободных оснований или нуклеозидов. Второй путь - использование для синтеза пуриновых нуклеотидов свободных экзогенных, а также эндогенных оснований и нуклеозидов пуринов, образующихся при распаде нуклеиновых кислот. Совокупность этих реакций принято называть - путь утилизации и взаимопревращения пуринов (УВП). Нуклеозидмонофосфаты аденина (АМФ) и гуанина (ГМФ), синтезированные de novo или образовавшиеся из готовых пуриновых оснований и нуклеозидов, используются для биосинтеза дНТФ, являющихся субстратами ДНК-полимераз при репликации ДНК. Из пуриновых нуклеозидмонофосфатов под действием нуклеозидмонофосфаткиназ синтезируются соответствующие дифосфаты. Различные нуклеозидмонофосфаткиназы специфичны к структуре пуринового гетероцикла, но не различают рибо- и дезоксинуклеотиды (см. Komberg and Baker, 1992). Неспецифичная нуклеозиддифосфаткиназа способна фосфорилировать пуриновые и пиримидиновые рибонуклеозиддифосфаты (рНДФ) и дезоксирибонуклеозиддифосфаты (дНДФ) с образованием соответствующих трифосфатов. У бактерий Е. coli дезоксинуклеотиды синтезируются в аэробных условиях из рНДФ, а в анаэробных условиях - из рибонуклеозидтрифосфатов (рНТФ). У дрожжей биоснтез дезоксинуклеотидов осуществляется только из соответствующих рНДФ посредством единственного фермента - рибонуклеозиддифосфат-редуктазы (РНР).
Бактериальная и дрожжевая РНР состоят из двух субъединиц В1 и В2 (см. Neuhard and Nygaard, 1987; Huang and Elledge, 1997). Большая субъединица Bl бактериальной PHP состоит из двух полипептидов равного размера (а и а ). Оба мономера а и а , имеющие одинаковую последовательность С-концевого участка и отличающиеся последовательностью N-конца, кодируются геном NrdB. Матричные РНК для синтеза полипептидов а и а являются таким образом продуктами процессинга одной мРНК. Субъединица В2 состоит из двух идентичных [}-полипептидов, кодируемых геном NrdB. Активный сайт фермента РНР включает ионы железа и тирозильные радикалы, связанные с субъединицей В2, а также тиольные группы субъединицы В1.
Штаммы и плазмиды, использованные в работе
Клетки Е. coli выращивали на полной среде LB (триптон - 10 г/л, NaCl - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л) (Миллер, 1976) и минимальной среде VB (MgS04 7H20 - 0,2 г/л, лимонная кислота - 2 г/л, К2НР04 - 10 г/л и NaNH4P04"4H20 - 3,5 г/л, глюкоза - 0,2 %) (Vogel and Bonner, 1956). Для поддержания роста ауксотрофных штаммов в минимальную среду VB добавляли необходимые L-аминокислоты и азотистые основания в концентрации 50 мг/л, а также витамины в концентрации 1 мг/л. Для селекции на устойчивость к антибиотикам в среды добавляли ампицилин (100 мг/л), канамицин (50 мг/л), рифампицин (100 мг/л), хлорамфеникол (30 мг/л). Для селекции Lac+ ревертантов по появлению голубой окраски использовали среду XPG. Среду XPG готовили на основе минимальной среды VB, добавляя P-Gal (500 мг/л) и X-Gal (40 мг/л) (Nghiem et al., 1988). Для приготовления лизатов фага Р1 использовали среду LB с добавлением 2 мМ СаСЬ- Тестирование на устойчивость к хлорату проводили на среде NB фирмы «Difco» (США) (пептон - 5 г/л, мясной экстракт - 3 г/л), содержащей 0,2 % КСЮз. Для приготовления твердых сред использовали агар фирм «Sigma» и «Difco» в концентрации 15 г/л. Для приготовления разведений бактериальных культур использовали 0,9 % раствор NaCl. Бактерии культивировали при температуре 37С.
Дрожжи выращивали на полных средах YEPD и YAPD (Инге-Вечтомов, 1971; Rose et al., 1990) и минимальной среде МД, содержащей необходимые аминокислоты, азотистые основания, витамины и микроэлементы в стандартных концентрациях (Rose et al., 1990). Штаммы, несущие кассету капМХ4, растили на среде, содержащей генетицин (200 мг/л). Для отбора мутантов, устойчивых к канаванину, готовили среду на основе МД с добавлением L-канаванина в концентрации 40 мг/л и всех необходимых для роста аминокислот и азотистых оснований. Для индукции споруляции использовали преспоруляционную и споруляционную среды (Инге-Вечтомов, 1971). Для приготовления твердых сред использовали агар фирм «Sigma» или «Difco» в концентрации 20 г/л. Дрожжи культивировали при температуре 30С.
В работе использовали 6-гидроксиламинопурин фирмы «MP Biomedicals» (США). 2-амино-6-гидроксиламинопурин синтезирован И. Д. Кучуком (Department of Chemistry of Indiana University, Bloomington, Indiana, USA) по методу Янион (Janion С, 1976), гипоксантин фирмы «Sigma» (США), ДМСО и хлороформ фирмы «Fisher» (США), люмихром фирмы «Sigma» (США), антибиотики ампицилин, канамицин, рифампицин, хлорамфеникол, канаванин фирмы «Sigma» (США) и генетицин фирмы «Promega» (США). Фенил-Р-Б-галактозид (P-Gal) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-О-галактозид (X-Gal) любезно предоставлены доктором Томасом Кункелем (NIEHS/NIH, США).
В работе использовали стандартные методы генетики микроорганизмов, такие как получение индивидуальных клонов, приготовления и титрования фаговых лизатов (Миллер, 1976). Трансформацию Е. coli проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984) или с использованием электропоратора фирмы «BioRad» (США) согласно рекомендациям фирмы-производителя прибора.
Для тестирования токсичного действия аналогов 500 мкл ночной культуры бактерий ( 109 кл/мл) ресуспендировали в 10 мл 0,9 % раствора NaCl и высевали на чашки со средой VB с помощью репликатора Хромова-Борисова с 151 штырем (Khromov-Borisov et al., 2002). В центр чашки помещали фильтровальную бумагу, на которую наносили 10 мкл раствора
ГАП или АГАП в ДМСО (10 мг/мл). Чашки инкубировали 16 часов при 37С в течение суток и оценивали токсичный эффект. Затем выросшие бактерии перепечатывали на среду LB с рифампицином для качественной оценки мутагенного действия аналогов в тесте на индукцию прямых мутаций устойчивости к рифампицину.
Поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у бактерий Е. coli
В рамках данной работы нами были получены три случайные геномные библиотеки инсерционных мутантов Е. coli с использованием транспозона EZn5 oriV/KAN-2 . Две из этих библиотек были получены на основе штаммов MG1655 и NR10836, третья библиотека получена на основе бактериального штамма NR15627, несущего мутацию усЪХ и изогенного штамму NR10836. По данным С. Г. Козьмина, инактивация гена YcbX, функция которого неизвестна, приводит к значительному увеличению чувствительности бактерий к ГАП. Анализ мутантов с измененной чувствительностью к ГАП на фоне мутации усЪХ мог способствовать выявлению мутантов, которые не имеют фенотипического проявления у штаммов дикого типа, а также помочь выяснению функции гена YcbX.
Для создания геномных библиотек инсерционных мутантов компетентную культуру бактерий трансформировали транспозоном EZn5 oriV/KAN-2 методом электропорации. Трансформантов, несущих инсерцию транспозона, отбирали на среде LB с канамицином. Частота трансформации составляла 10"6-10"7 на один мкг ДНК. Объем каждой библиотеки составил 10000 независимых инсерционных мутантов. Нами разработаны методы скрининга библиотек мутантов, которые отличались для трех исходных штаммов (в зависимости от генотипа, см. «Материалы и методы»).
Все три библиотеки были использованы для поиска ГАП5 мутантов. Кроме того, геномную библиотеку на основе штамма NR15627 (усЬХ) использовали для поиска мутантов, обладающих повышенной устойчивостью к действию ГАП (ГАПК). Ранее в лаборатории Р. Шаапера (NIEHS/NIH, США) С. Г. Козьминым с соавторами была получена геномная библиотека на основе бактериального штамма КА796 {ага thiAipro-lac)) с использованием транспозона гтт-ТпЮсат. Объем библиотеки составил 6000 инсерционных мутантов. С использованием этой библиотеки было изолировано несколько мутантов, характеризующихся повышенной чувствительностью к ГАП, в том числе усЪХ, dam и тоеА. Функция гена YcbX пока остается неизвестной. Мутанты усЪХ несколько менее чувствительны к ГАП, чем тої мутанты, но по ряду критериев ген YcbX принадлежит к МоКо-зависимому пути детоксикации ГАП. Так, мутанты усЪХ устойчивы к хлорату, а чувствительность одиночных мутантов тої и двойных мутантов усЪХ тої к ГАП примерно одинакова.
Отобранных в результате скрининга ГАП51 и ГАПК мутантов высевали истощающим штрихом на среду LB с канамицином. Затем отбирали по одной колонии каждого мутанта для дальнейших тестов. Все отобранные мутанты были проверены в качественном спот-тесте на чувствительность к ГАП. У тех ГАПБ и ГАПК мутантов, фенотип которых был подтвержден в повторных тестах, место инсерции определяли секвенированием участков бактериальной хромосомы, как описано в главе «Материалы и методы».
Наши результаты показали, что использованный в данной работе подход оказался весьма эффективным и позволил идентифицировать более 40 генов, инактивация которых приводит к ГАП - или ГАП -фенотипу (см. табл. 6, 7). В общей сложности нами было проанализировано 30000 инсерционных мутантов бактерий. Поскольку степень случайности встраивания использованного нами транспозона неизвестна, представляется довольно затруднительным предсказать минимальное количество независимых инсерционных мутантов, необходимое для перекрывания всего генома Е. coli. По-видимому, дальнейшее увеличение объема библиотеки не имело большого смысла, поскольку среди проверенных 30000 мутантов было обнаружено 7 мутантов тоеА и 4 мутанта fre, что указывает на многократное встраивание транспозона в небольшие фрагменты ДНК, содержащие гены МоеА и Fre. Однако следует отметить, что, по-видимому, транспозон EZn5 oriV/KAN-2 обладает некоторой специфичностью встраивания в бактериальную хромосому. На это указывает тот факт, что среди 20000 мутантов, полученных на штаммах MG1655 и NR10836, мы не обнаружили мутантов усЪХ, которые были многократно изолированы ранее, но при использовании другого транспозона rmninlOcam. Также на неслучайный характер встраивания транспозона указывает неравное количество полученных нами мутантов для различных генов. Так, было изолировано 7 мутантов тоеА, по 2 мутанта moaA, moaC, mogA, modA и modC и только по одному мутанту moaD и тоеВ. Однако общее количество идентифицированных нами ГАП8 и ГАПК мутантов, для большинства из которых указанный фенотип установлен впервые, указывает на то, что использованный подход эффективен для поиска генов бактерий, контролирующих чувствительность к аналогам оснований. Возможно, анализ геномных библиотек, полученных с использованием различных транспозонов, позволит повысить вероятность перекрывания всего генома Е. coli при проведении подобных скринингов.
Генетический контроль чувствительности Е. coli к мутагенному и токсичному действию ГАП
Основываясь на результатах нашей работы, а также на литературных данных, мы попытались представить многоэтапный процесс активации и детоксикации ГАП в клетках бактерий на рисунке 22. Остановимся на этой схеме подробнее.
Экзогенный ГАП может попадать в клетку посредством активного и пассивного транспорта. Кандидатом на роль активного транспортера ГАП может быть белок, кодируемый геном YjcD. Белок YjcD - мембранный белок с неизвестной функцией, близкий по структуре урацил-пермеазе. В данной работе мы показали, что инактивация гена YjcD значительно повышает устойчивость клеток бактерий к ГАП. Видимо, белок YjcD обладает широкой субстратной специфичностью и способен, наряду с урацилом, транспортировать ГАП. Однако это предположение требует дополнительных биохимических доказательств. Мы идентифицировали также некоторые другие гены, которые, вероятно, также контролируют проницаемость бактериальной клетки для мутагенного аналога. Это гены, кодирующие транспортные белки (PstA, PstB и PstS), и гены, контролирующие организацию клеточной стенки (RfaG) (табл. 7). Инактивация перечисленных выше генов повышает устойчивость клеток бактерий к ГАП, но в несколько меньшей степени, чем инактивация гена YjcD. Видимо, эти гены каким-то образом влияют на пассивный или активный транспорт ГАП в клетку.
Внутриклеточный ГАП может быть превращен в нетоксичное соединение под действием не идентифицированного пока молибдофермента или нескольких молибдоферментов, поскольку мутанты с дефектами на различных этапах биосинтеза МоКо сверхчувствительны к ГАП (Kozmin et al., 2000). MutL
Пояснения: посредством активного или пассивного транспорта экзогенный ГАП попадает в клетку. Некоторые из обнаруженных нами генов (PstA.B.S и YjcD) кодируют мембранные белки, которые, видимо, изменяют проницаемость бактериальной клетки и отвечают за активный или пассивный транспорт ГАП в клетку. Далее неизвестный молибдофермент или несколько молибдоферментов превращают ГАП в нетоксичное азотистое основание, возможно, аденин. Молибденовый фермент (ы) вносит наибольший вклад в детоксикацию ГАП у бактерий. Под действием различных ферментов утилизации и взаимопревращения пуринов (кодируемых генами Apt, Hpt, Gpt, DeoD, Add), ГАП попадает в пул предшественников ДНК. Пирофосфорилаза, кодируемая геном RdgB, ортологом дрожжевого гена НАМ1, «очищает пул» предшественников ДНК от дГАПТФ, превращая его в дГАПМФ. дГАПТФ встраивается в ДНК при репликации и вызывает транзиции в следующем раунде репликации. ГАП в ДНК может узнаваться ферментами репарации неспаренных оснований (гены MutL, Dam). Также, ГАП, находящийся в матрице ДНК, инициирует появление двунитевых разрывов, репарируемых системой рекомбинационной репарации (гены: RecA.B.C, RuvA.B.C,). Причиной двунитевых разрывов служит разрушение вилки репликации из-за присутствия на матричной цепи однонитевых брешей, вносимых эндонуклеазой V, кодируемой геном Nfi. К разрушению вилки репликации также может приводить ее «столкновение» с транскрипционным комплексом. В регуляции транскрипции в стрессовых условиях и в ее координации с репликацией участвуют ген DksA и ген RelA, контролирующий биосинтез сигнальной молекулы 3 -пирофосфат-гуанозин-5 -пирофосфат (ффГфф).
В данной работе мы идентифицировали несколько новых генов, контролирующих биосинтез молибденового кофактора, мутации в которых приводят к сверхчувствительности к ГАП (табл. 6). Роль некоторых из этих генов в контроле чувствительности бактерий к ГАП была известна ранее (Kozmin et al., 2000; Burgis et al., 2003). Мы впервые обнаружили сверхчувствительность к ГАП у ряда других мутантов тої, таких как MogA и ModA.C.
Также мы идентифицировали новые гены YhhP и CysJ, по-видимому, участвующие в биосинтезе МоКо, что не было известно ранее. Функция гена YhhP оставалась неизвестной до последнего времени. Инактивация гена YhhP приводит к нарушению деления клетки и снижению жизнеспособности бактерий на полной, но не на минимальной среде, что указывает на участие белка YhhP в фундаментальных процессах жизнедеятельности бактериальной клетки (Ishii et al., 2000). Ранее С. Г. Козьминым и Р. Шаапером было сделано предположение о том, что YhhP совместно с белком IscS может участвовать в биосинтезе молибденового кофактора в качестве переносчика серы (С. Г. Козьмин, личное сообщение). На это указывали устойчивость мутанта yhhP к хлорату и обнаружение физического взаимодействия между белками YhhP и IscS (Butland et al., 2005). Недавно было показано, что YhhP действительно является переносчиком серы в таком важном процессе, как 2-тиомодификация ряда тРНК, в результате которого образуется 5-метиламинометил-2-тиоуридин-тРНК (Ikeuchi et al., 2006). Вероятно, функция белка YhhP, как переносчика серы, более универсальна. По-видимому, белок YhhP участвует в биосинтезе молибденового кофактора, а также в других физиологических процессах, с чем, вероятно, и связана низкая жизнеспособность мутантов yhhP.
Похожие диссертации на Генетический контроль чувствительности про- и эукариотических микроорганизмов к мутагенным аналогам пуринов
