Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Семейство протоонкогенов ras 10
2.1.1. Функциональная значимость белков семейства Ras 10
2.1.2. Структура Ras белков 14
2.1.3. Ген K-Ras и канцерогенез лёгких 16
2.2. Единичные нуклеотидные замены 21
2.3. Транскрипционные факторы 31
2.3.1. Транскрипционный фактор NF-Y 32
2.3.2. Транскрипционный фактор GATA-6 37
3. Материалы и методы 44
3.1. Материалы, использованные в работе 44
3.2. Олигонуклеотиды 45
3.3. Животные 46
3.4. Выделение геномной ДНК из лёгких мыши 47
3.5. Получение препаратов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПНР) 48
3.6. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 49
3.7. Получение экстракта ядер лёгких мышей 49
3.8. Введение метки в ДНК с помощью фрагмента Клёнова 51
3.9. Введение концевой метки в ДНК 51
3.10. Метод задержки ДНК-зонда в ПААГ белками ядерного экстракта 52
3.11. Вестерн-блот анализ 5З
3.12. Поиск сайтов гиперчувствительности К ДНК-азе I 54
3.12.1. Обработка ядер клеток легкого ДНК-азой I 54
3.12.2. Гибридизация по Саузерну 55
4. Результаты и обсуждение 58
4.1. Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-Ras мыши 58
4.2. Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с областью 12-ого кодона гта. K-Ras мыши
4.3. Влияние легочных канцерогенов 3-метил хол антрена и нитрозоэтилмочевины на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов GATA-6 И NF-Y
5. Заключение 87
6. Выводы 89
7. Список цитированной литературы
- Семейство протоонкогенов ras
- Ген K-Ras и канцерогенез лёгких
- Выделение геномной ДНК из лёгких мыши
- Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-Ras мыши
Введение к работе
Актуальность темы.
Ген K-ras является одной из наиболее перспективных моделей для изучения механизмов наследственной предрасположенности к развитию опухолей легких, поскольку он идентифицирован как ген, детерминирующий чувствительность к пульмоноканцерогенезу, и у человека и у экспериментальных животных. У мышей получено множество инбредных линий, различающихся по чувствительности к спонтанному и химически индуцированному раку легких. В результате генотипирования большого числа таких линий была установлена связь между единичными нуклеотидными заменами (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) в интроне 2 гена K-ras и предрасположенностью к развитию опухолей легких [Chen et al.,1994а]. Показано, что у чувствительных к пульмоноканцерогенезу линий (А/Не, GR, ICR) в позициях 288 и 296 п.н. относительно старта трансляции располагаются нуклеотиды С и А, у резистентных линий (AKR, DD, РТ, UT, СЗН/А, C57BL) - G и С, а у линии с промежуточным фенотипом (СВА)- С и С [Chen et al.,1994a; Тимофеева и др.,2002].
Стремительно возрастающий в последние годы интерес к выявлению и исследованию SNPs в различных генах вызван тем, что они часто оказываются связанными с разнообразными фенотипическими проявлениями, включающими предрасположенность ко многим заболеваниям. При этом наиболее интенсивно изучаются SNPs, расположенные в кодирующих районах генов, что обусловлено относительной простотой их интерпретации, в особенности, в тех случаях, когда SNPs приводят к заменам аминокислот. Начинают развиваться и работы по исследованию потенциально регуляторных SNP, расположенных в
промоторных районах генов. Среди SNPs, расположенных в интронах генов, наиболее изученными являются варианты, влияющие на сплайсинг мРНК. Расположенные в интронах SNPs, способные хотя бы потенциально влиять на интенсивность экспрессии генов, остаются почти не исследованными.
;. Поскольку имеются уже достаточно много данных об энхансерах,
саиленсерах и отдельных регуляторних элементах, расположенных в
интронах генов, логично предполагать, что SNPs в интронах также могут
затрагивать регуляторные районы. В связи с этим изучение молекулярных
механизмов, посредством которых SNPs в интроне могут оказывать влияние
на фенотипические признаки, представляется весьма актуальным и
перспективным направлением.
Ген K-ras является одним из наиболее известных протоонкогенов,
^ мутации в котором (как спонтанные, так и индуцированные химическими
канцерогенами) локализованы почти исключительно в трех «горячих» точках - ко донах 12, 13 и 61 [Minamoto et al., 2000]. В настоящее время подобную направленность мутагенеза связывают, главным образом, с особенностями локальной структуры ДНК в местах предпочтительного возникновения мутаций [Kiawczak, Cooper, 1996; Krawczak et al.,2000; Loechler, 1996]. Однако такое объяснение является далеко не всеобъемлющим. Например,
У^ при анализе мутаций, затрагивающих ко доны 12, 13 и 61 гена K-ras, в
опухолях легких у гибридных мышей, полученных скрещиванием чувствительных и резистентных линий, было показано, что мутация происходит только в «чувствительном» аллеле этого гена, несмотря на полную идентичность нуклеотидной последовательности обоих аллелей в местах образования мутаций [Chen et al, 1994а]. Известен также феномен
/ тканевой специфичности направленного мутагенеза. Например, под
действием канцерогена уретана в печени и коже возникают мутации в 61-м
ко доне гена H-ras, а в легких - в 61-м ко доне гена K-ras [Barbin, 2000]. Такие
закономерности дают основание думать об участии еще каких-то механизмов
в обеспечении избирательности мутационного процесса. В частности,
поскольку для гена K-ras установлено, что чувствительность мышей разных
линий к развитию рака легких коррелирует с SNP в его втором интроне,
л можно предполагать, что эти нуклеотидные замены могут приводить к
специфическим, характерным только для чувствительного аллеля изменениям в структуре хроматина и/или конформации ДНК в районе 12-го и 13-го кодонов (экзон 1), что может способствать образованию аддуктов ДНК-канцероген и в последующем мутаций именно в этих позициях. Так как известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК,
^ можно думать, что сопряженные с чувствительностью к
пульмоноканцерогенезу SNP затрагивают сайты связывания таких белков. Цель и задачи исследования
Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне гена K-ras могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей, а также выяснение механизма
Cfc высокой избирательности возникновения мутаций в 12-м кодоне
протоонкогена K-ras.
Задачи работы включали:
1. Изучение влияния сопряженных с развитием рака легких мононуклеотдных замен в позициях 288 и 296 п.н. интрона 2 K-ras у М. musculus на связывание с ядерными белками. Идентификация
,, транскрипционных факторов, взаимодействующих с полиморфным районом.
Изучение влияния замены в позиции 311 п.н. интрона 2 K-ras, отличающей мышей устойчивого к пульмоноканцерогенезу вида М. spretus от чувствительных линий М. Musculus, на связывание с транскрипционными факторами и их идентификация.
Изучение влияния различных вариантов SNP на картину связывания ядерных белков с потенциальным композиционным элементом в начале интрона 2 гена K-ras, охватывающим область расположения всех трех сопряженных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен.
4. Идентификация белков экстракта ядер клеток легких,
взаимодействующих с областью первого кодирующего экзона гена K-ras
мыши, включающей ко доны 12 и 13, которые являются «горячими» точками
возникновения мутаций в гене K-ras.
5. После того как нами были получены данные о том, что с областью
локализации кодонов 12 и 13 гена K-ras мыши и с районом расположения
связанных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен
взаимодействуют транскрипционные факторы NF-Y и GATA-6, была
поставлена также задача определения влияния пульмоноканцерогенов на
активность этих факторов.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые показано, что сопряженные с предрасположенностью к развитию рака легких у мышей SNPs во втором интроне гена K-ras являются потенциально регул яторными. Установлено, что С А вариант полиморфизма в позициях 288 и 296 п.н., характерный для чувствительных линий мышей вида M.musculus, соответствует комплексному сайту связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6, а в случае "устойчивого" GC и "промежуточного" СС вариантов этот сайт оказывается разрушенным. Показано также, что в результате замены С—>Т в позиции 311 п.н. у мышей
M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, происходит повреждение
сайта связывания NF-Y и это отличает их от мышей чувствительных линий
M.musculus. Полученные данные предполагают существование трех
гаплотипов, определяющих предрасположенность к пульмоноканцерогенезу:
, двух устойчивых - GCC и CAT и одного чувствительного - САС.
Впервые продемонстрировано, что горячая точка мутагенеза в
протоонкогене K-ras - область 12-го ко дона - является сложным сайтом связывания белков NF-Y и GATA-6. Получены оригинальные данные о том, что под действием пульмоноканцерогенов 3-метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) происходит усиление связывания факторов NF-Y и GATA-6 с районом 12 ко дона и областью полиморфизма в начале интрона 2 гена K-ras, что является новым свидетельством вовлеченности
Т регуляторных систем клетки в механизм действия химических канцерогенов.
Полученные результаты открывают новые перспективы для изучения
молекулярных механизмов сайт-направленных генных мутаций, а также для
развития представлений о роли регуляторных систем клетки в инициации и
развитии канцерогенного процесса. Полученные данные также имеют
значение для выяснения молекулярных основ генетической
предрасположенности к пульмоноканцерогенезу.
j^ Апробация работы.
Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИЦиГ, на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003) и на международных конференциях: "Физико-химическая биология" (Новосибирск, 2006); "Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine" (Novosibirsk, 2006); "Genome Sequencing &
,, Biology" (New York, 2001); "Mathematics and Engineering Techniques in
^ Medicine and Biological Sciences" (Las Vegas, 2001).
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Семейство протоонкогенов ras
Ген K-Ras принадлежит небольшому семейству генов ras, кодирующих близко родственные белки, которые обладают сильным трансформирующим потенциалом [Ellis, Clark, 2000].
Продукты генов ras относятся к группе повсеместно встречающихся (вездесущих) белков у эукариот. Они были обнаружены в различных типах клеток млекопитающих, птиц, моллюсков, рыб и растений, а также у грибов и дрожжей. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей ras выявил высокую степень консервативности, что уже может свидетельствовать о фундаментальной роли белков семейства Ras в клеточной пролиферации [Barbacid, 1987].
Семейство белков Ras описывают, как состоящее из трёх членов: Н-Ras, N-Ras и K-Ras. Причём K-Ras существует в двух альтернативно сплайсирующихся вариантах: мажорном (4В) и минорном (4А) [Ellis, Clark, 2000].
Ras белки представляют собой низкомолекулярные (весом около 21 кДа) ГТФ-азы, иначе называемые р21, вовлеченные в процессы роста и дифференцировки клеток. Они существуют в двух чередующихся состояниях: активном и неактивном; и располагаются на внутренней поверхности плазматической мембраны (Рис. 1). Цикл образования активного, ГТФ-связанного состояния Ras и неактивного, ГДФ-связанного регулируется набором различных факторов: GEFs (Guanine nucleotide exchange factors), управляющих формированием ГТФ-связанного состояния Ras, и GAPs (GTPase activating proteins), которые способствуют образованию ГДФ-связанного состояния Ras. В свою очередь, данные факторы находятся под прямым или опосредованным влиянием ряда поверхностных клеточных рецепторов, таких как рецептор эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), рецептор фактора роста тромбоцитов (Platelet Derived Growth Factor Receptor, PDGF), рецептор интегринов в совокупности с гетеротримерным G-белоком и рецепторы цитокинов, таких как интерлейкин-2 (1L-2) [Ellis, Clark, 2000; Plowman et at. 2003]. Различные члены семейства Ras регулируются различными наборами GEFs и GAPs белков, в зависимости от конкретной клеточной ситуации, и сигналы от Ras направляются к различным эффекторным белкам [Масага et al., 1996; Wennerberg et al., 2005]. Среди наиболее хорошо охарактеризованных эффекторов: Raf семейство серин/треониновых киназ, регулирующих каскад MAP киназы, а следовательно играющих важную роль в митогенном действии Ras; фосфатидилинозитол-З-киназа, активация которой запускает программу анти-апоптоза; AF-6, модулирующий межклеточные взаимодействия; МЕКК1- потенциальный активатор JNK, сигнал от которой воспринимается MAP киназой [Ellis, Clark, 2000; Pruitt, Der, 2001] (Рис. 2).
Таким образом, ряд поверхностных стимулов преобразуется в клеточные сигналы, исходящие от Ras и вызывающие так называемые киназные каскады, которые играют важную роль в весьма сложных механизмах регуляции экспрессии генов [Ellis, Clark, 2000; Macara et al., 1996].
Однако имеются данные о том, что ГДФ-связанная "неактивная" форма Ras в ряде случаев также может участвовать в регуляторных процессах [Romero et al, 1999]. Было показано, что в "неактивном" состоянии Ras успешно связывается с транскрипционным фактором Aiolos, играющим важную роль в дифференцировке, пролиферации и созревании В-клеток. Связывание происходит только при отсутствии IL-2, при стимуляции клеток IL-2 у фактора Aiolos происходит фосфорилирование тирозина, вследствие чего комплекс диссоциирует и фактор перемещается в ядро где способен предотвращать апоптоз через индукцию экспрессии гена Вс1-2. При отсутствии стимуляции Aiolos возвращается в цитоплазму, где «заякоривается» ГДФ-связанной формой Ras, и процесс апоптоза индуцируется. Следует заметить, что ГТФ-связанная и свободная от нуклеотида формы Ras не способны взаимодействовать с Aiolos [Romero et al., 1999].
Таким образом, Ras белки выполняют диспетчерскую функцию на путях сигнальной трансдукции, доставляя информацию из внешней среды во внутриклеточное пространство.
Ген K-Ras и канцерогенез лёгких
В последние 10-15 лет, благодаря развитию молекулярно-генетичиских подходов к исследованию опухолеобразования, накопилось множество доказательств тому, что рак - это генетическое заболевание. Появляется всё больше свидетельств тому, что гены, играющие ключевую роль в регуляции клеточного роста, дифференцировке и апоптозе, подвергаясь мутационным изменениям, приводят к злокачественному перерождению [Minamoto et al., 2000]. Было установлено, что примерно 30 % опухолей человека несут мутации в генах семейства ras, причем наибольшее их количество по сравнению с другими членами семейства приходится на ген K-Ras в 12, 13 и 61 ко донах. У человека мутации в этом гене встречаются преимущественно в опухолях поджелудочной железы 70-90 %, толстой кишки - 50 % и лёгкого - 25-50 % [Johnson et al., 2001]. По данным разных авторов эти значения могут несколько варьировать, но тенденция к такому распределению по тканям сохраняется [Minamoto et al., 2000; Bos, 1989; Adjei et al., 2001].
Тканеспецифичность наблюдается и при анализе распределения мутаций у других представителей семейства генов ras. Так мутации в гене Н-ras характерны для мочевого пузыря ( 10 %), почек (-10 %) и щитовидной железы (50-60 %). Мутантные формы N-ras обычно обнаруживаются в меланомах (-13 %), гепатокарциномах (-30 %) и лейкемиях (-30 %) [Adjei et al., 2001].
Мутантный Ras постоянно находится в активном, ГТФ-связанном состоянии, в результате того, что мутация либо снижает ГТФазную активность (мутации в позициях 12, 13, 59, 61 и 63) и делает белок нечувствительным к действию GAP, либо способствует ГДФ/ГТФ обмену (мутации в позициях 16, 17, 116, 117, 119, 144 и 146) [Malumbres, Pellicer, 1998]. Все эти мутации повреждают один из четырех участков, ответственных за связывание Ras с нуклеотидом гуанина (рис. 3). В любом случае такое повреждение белка приводит к тому, что сигналы от Ras постоянно идут в ядро клетки, и процессы клеточного роста, дифференцировки и апоптоза выходят из-под внешнего контроля.
Механизмы, обеспечивающие высокую частоту встречаемости мутаций в кодоне 12 гена K-ras в опухолях, пока не ясны. С одной стороны, можно предполагать, что наличие измененного Ras дает селективные преимущества клеткам, усиливая их способность к пролиферации и устойчивость к апоптозу [Koera et al., 1997]. С другой стороны, показано, что ко дон 12 гена K-ras является местом преимущественного образования аддуктов при обработке различными канцерогенами [Feng et al., 2002; Ни et al., 2003; Ziegel et al., 2003]. Предполагается, что избирательность образования аддуктов в кодоне 12 может быть связана как с особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона и/или ее модификациями, так и с особенностями локальной структуры хроматина в этом районе, которая обеспечивается ДНК-белковыми взаимодействиями [Ни et al., 2003]. Необходимо заметить, что при введении животным канцерогенов одни предпочтительно образуют аддукты в кодоне 12, а другие в кодоне 61 [Gray et al., 2001].
Интерес к изучению гена K-Ras у мышей вызван тем, что, также как и у человека, мутации в нем наблюдаются в тех же кодонах в различных спонтанных и химически индуцированных опухолях [Tuveson, Jacks, 1999; Ramakrishna et al., 2000]. В частности, показано, что мутации в кодоне 12 гена K-ras встречаются в 60-95% опухолей лёгких мышей, индуцированных различными химическими канцерогенами [Matzinger et al., 1997; Ramakrishna et al., 2000].
Вероятно, данные мутации являются если не единственной, то весьма значимой причиной для возникновения опухолей. Так, например, с использованием Cre/lox контролируемого включения активированного K-ras у трансгенных мышей было показано, что мутации в кодоне 12 этого гена достаточно для развития аденокарцином легких у 100% животных [Meuwissen et al., 2001]. Однако, экспрессия мутантного гена K-ras, не имеет каких-либо последствий для большинства типов тканей и клеток, следовательно развитие опухоли все-таки сильно зависит от так называемой клеточной ситуации [Guerra et al., 2003]. Инфицирование же раковых клеточных линий несущих мутации в ко донах 12 (линия Н322а) и 61 (линия Н460а) шт-K-ras аденовирусом, снижает уровень белка K-Ras на 70 %, ингибирует рост монослоя на 47-59 % и уменьшает формирование колоний на 90 % [Alemany et al., 1996].
Выделение геномной ДНК из лёгких мыши
Лёгкие мыши немедленно после забоя животного замораживали в жидком азоте. Кусочки ткани переносили в фарфоровую ступку и растирали под слоем жидкого азота до состояния однородного порошка. 0,5-1 г порошка осторожно и равномерно высыпали в коническую колбу объёмом 50 мл, содержавшую 5 мл лизирующего буфера (ЮОмМ ЭДТА:№ рН=7-8; 0,5% SDS; 20-40 мкг/мл протеиназы К, добавленной непосредственно перед использованием). Раствор осторожно перемешивали (вязкость раствора после лизиса ядер сильно повышается) и инкубировали 2-3 часа при 50С или 16-18 часов при 37С.
Пептиды экстрагировали 5 мл фенола, насыщенного ЮмМ Трис-НС1 рН=8,0, затем 5 мл смеси фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (25:24:1 по объему), и 5 мл смеси хлороформ / изоамиловый спирт (24:1). Экстракцию вели в конической колбе объёмом 50 мл осторожным покачиванием. Фазы разделяли центрифугированием в пробирках объёмом 10 мл (центрифуга ф 5804R Eppendorf, Германия) при 4000 оборотов/мин. в течение 5 мин. при 17С. Основную часть водной фазы переносили в коническую колбу пипеткой на 1000 мкл с использованием обрезанного ножницами наконечника.
После экстракции смесью хлороформ / изоамиловый спирт водную фазу помещали в стакан объёмом 200 мл и охлаждали на льду. При # медленном помешивании тонкой стеклянной палочкой к водной фазе добавляли по каплям охлаждённый до 0С изопропанол. В момент резкого уменьшения вязкости раствора добавление изопропанола прекращали.
Вязкие нити геномной ДНК наматывали на стеклянную палочку, осторожно промывали 70% этанолом и подсушивали в слабом токе стерильного воздуха 3-6 мин. при 50С, не допуская полного высыхания (потери прозрачности). После подсушивания палочку в стерильных условиях помещали в 1-1,5 мл буфера для растворения ДНК (1мМ Трис-HCl рН=7,0; ОДмМ ЭДТА) в микропробирку объёмом 1,5 мл. Растворение проводили при 0-4С в течение 1 суток.
Для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) использовали амплификатор Termocycler (Perkin Elmer, США).
ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 200 мкМ dNTP; буфер для ПЦР (75мМ Трис-HCl рН 8,8; 20мМ (NH4)2S04; 0,01% Tween, ЗмМ MgCl2); 7пМоль прямого и обратного праймеров; 0,25 мкг ДНК; 1 единицу активности Taq полимеразы; 10% глицерина. Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР были использованы концентрации глицерина от 5% до 10% и концентрации MgCl2 от 1,5мМ до 4мМ.
После ПЦР проводили очистку ДНК целевого продукта реакции от неспецифических фрагментов ДНК в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ при напряжении 5 В/см.
Для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля использовали сорбцию ДНК на поверхности стекла в концентрированном растворе NaC104 [Морозов, 1998]. В данной методике в качестве сорбента использовали мелковолокнистую стекловату из легкоплавкого натриевого стекла, ёмкость которой составляла до 2 мкг ДНК на 1 мг стекловаты. Стекловату упаковывали в наконечники на 200 мкл по 10 или 20 мг.
Фрагмент геля, содержащий амплифицированный фрагмент ДНК, помещали в пробирку 1,5 мл и уплотняли ценрифугированием 5-Ю сек. Добавляли равный объем раствора (8М NaC104; 20мМ Tris-ЕДТА, рН=6,0) и инкубировали при 65С, периодически перемешивая переворачиванием пробирки до полного расплавления геля. Затем раствор медленно пропускали через стекловату, используя вакуум, создаваемый водоструйным насосом, после чего промывали два раза 200 мкл 4М раствор перхлората. После этого стекловату аналогично промывали два раза 200 мкл 70% этанола, слегка подсушивали центрифугированием в микроцентрифуге Eppendorf и смачивали 20 мкл бидистиллированной воды. Раствор ДНК собирали в пробирку 1,5 мл ценрифугированием в течении 1 мин., процедуру элюции повторяли и оба раствора объединяли.
Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-Ras мыши
Предрасположенность мышей к раку легких определяется тремя генетическими локусами, имеющими общее название Pas (pulmonary adenoma susceptibility) [Malkinson et al., 1985]. Известно, что локус Pasl расположен на хромосоме 6 и включает ген K-ras [Gariboldi et al., 1993; Manenti et al., 1995]. Исследования на трансгенных мышах показали, что наличие мутаций в ко донах 12, 13 и 61 протоонкогена K-ras приводит к трансформации клеток и развитию различных опухолей, включая опухоли легких [You et al., 1992; Ф Meuwissen et al, 2001]. Кроме того, была выявлена связь между различной чувствительностью инбредных линий мышей к развитию аденом легкого и полиморфизмом длины ЕсоШ рестрикционных фрагментов в самом начале интрона 2 гена K-ras [Malkinson et al., 1985; 1985; Ryan et al, 1987]. Область полиморфизма представлена тандемным повтором 37-нуклеотидной последовательности в геноме мышей устойчивых линий (Рис. 4). У чувствительных линий одна копия 37-нуклеотидной последовательности делегирована [Chen et al., 1994а]. Помимо этого, внутри самой 37-нуклеотидной единицы обнаружены однонуклеотидные замены (SNP), коррелирующие с различной чувствительностью к развитию рака легких. Так, Чен и соавт. показали, что у чувствительных к пульмоноканцерогенезу линий мышей ген K-ras в позициях 288 и 296 п.н. относительно старта трансляции имеет нуклеотиды С и А, соответственно, у резистентных линий -G и С, а у линий с промежуточным фенотипом - С и С [Chen et al., 1994а].
Развитие работ по генотипированию показало, что чувствительность к канцерогенезу легких у мышей скорее связана с SNPs во втором интроне гена K-ras, чем с наличием или отсутствием в нем 37 п.н. тандємного повтора. Было обнаружено, что у устойчивой к индукции опухолей мышей линии DD в гене K-ras имеется делеция, характерная для чувствительных линий, но ,4 оставшаяся 37 п.н. единица содержит GC вариант SNP, характерный для других резистентных линий [Тимофеева и др., 1999].
Мы предположили, что наблюдаемые нуклеотидные замены могут затрагивать участок связывания какого-либо регуляторного белка. Для проверки этого предположения, олигонуклеотиды, соответствующие трём аллельным состояниям участка от 278 до 307 п.н. относительно стартового кодона гена K-ras мыши (СА, СС и GC олигонуклеотиды, Рис. 7А), были , л использованы в экспериментах по задержке в геле белками ядерного экстракта легких мыши. При проведении этого эксперимента мы использовали белковые экстракты легких взятых от мышей вида M.musculus как чувствительных линий (А/Не, ICR, GR), так и устойчивых (СЗН/А, C57BL/6J, AKR, DD). Результаты, полученные с использованием экстрактов из легких мышей линий ICR и DD, приведены на рис. 7Б. Оказалось, что картина связывания в случае СА варианта SNP существенно отличается от таковой для GC и СС вариантов наличием мощной полосы задержки, w соответствующей комплексу С А олигонуклеотида с неким белком/белками.
При этом источник экстракта не имеет значения. Такие же результаты были получены на других линиях мышей (данные не приводятся). Таким образом, мы показали, что образование малоподвижного комплекса с исследуемым районом в случае чувствительного аллеля не является следствием межлинейных различий в спектре ядерных белков. СО РАН Пономаренко М.П. было сделано предположение, что СА вариант SNP приводит к образованию сайта связывания транскрипционного фактора семейства GATA [Levashova et al., 2000]. В результате экспериментов по задержке ДНК-пробы в геле в присутствии конкурентных олигонуклеотидов, соответствующих природным сайтам связывания белков GATA и Ets (контроль), а также антител против GATA-6 (основного представителя семейства GATA в легких [Keijzer et al., 2001; Molkentin, 2000]) мы полностью подтвердили данное предположение (Рис. 8). Таким образом, впервые нами было показано, что "чувствительный" СА-вариант SNP интрона 2 гена K-ras соответствует сайту связывания фактора транскрипции GATA-6, а в случае "устойчивого" GC и "промежуточного" СС вариантов этот сайт разрушен.
Поскольку GATA-6 является ключевым фактором в дифференцировке легочной ткани и тканеспецифической регуляции экспрессии генов в легких можно думать, что наблюдаемые различия в связывании этого фактора с разными аллельными состояниями интрона 2 гена K-ras имеют отношение к формированию чувствительного или устойчивого к пульмоноканцерогенезу фенотипа. Однако, обнаружение "чувствительного" СА варианта SNP в интроне 2 гена K-ras у мышей другого вида - M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, поставило под сомнение саму мысль об участии этого полиморфизма в формировании предрасположенности к канцерогенезу в легких [Manenti et al., 1995]. Но мы обратили внимание, что у M.spretus в непосредственной близости от уже известных SNPs в позициях 288 п.н. и 296 п.н., приводящих к появлению или исчезновению сайта связывания фактора GATA6, имеется ещё одна мононуклеотидная замена С (M.musculus) —» Т (M.spretus) в позиции 311 п.н., характерная для этого вида (Рис. 9).
