Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Анализ роли участия системы гемостаза в исходах экстракорпорального оплодотворения (обзор литературы) 13
1.1 Роль тромбофилии в неудачах репродуктивных технологий у человека 13
1.2 Классификация основных видов гематогенных тромбофилии 14
1.3 Данные о влиянии нарушений гемостаза на результаты экстракорпорального оплодотворения 19
1.4 Потенциальные методы коррекции нарушений гемостаза и фибринолиза при проведении экстракорпорального оплодотворения 24
Глава 2 Общая характеристика пациенток, методов исследования, контрольные показатели 28
2.1 Общая характеристика женщин, включенных в исследование 28
2.2 Методы исследования системы гемостаза и фибринолиза 32
2.3 Показатели гемокоагуляции в контрольной группе практически здоровых женщин 37
2.4 Статистическая обработка данных 38
Глава 3. Изучение информативности различных методов исследования системы гемостаза в цикле экстракорпорального оплодотворения 39
3.1 Изменения параметров системы гемостаза и фибринолиза в стандартном цикле экстракорпорального оплодотворения 39
3.2 Отбор информативных лабораторных маркеров нарушений гемокоагуляции и фибринолиза, отражающих неудачи в исходах экстракорпорального оплодотворения 40
3.3 Сверхпороговые значения теста генерации тромбина для отбора группы женщин, нуждающихся в гепаринопрофилактике 41
3.4 Определение порогового значения индекса активирующей фибринолиз способности эндотелия для отбора группы женщин, нуждающихся в активации системы фибринолиза 42
3.5 Корреляционная связь избыточной генерации тромбина и низкой фибринолитической активности сосудистой стенки с неудачными исходами экстракорпорального оплодотворения 43
Глава 4 Результаты терапевтической коррекции повышенной генерации тромбина и гипофибринолиза в цикле экстракорпорального оплодотворения 50
4.1. Показатели системы гемостаза и фибринолиза у женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения до и после проведения гепаринопрофилактики 56
4.2. Показатели системы гемостаза и фибринолиза / у пациенток до и после проведения курса перемежающей пневматической компрессии 57
Заключение 63
Выводы 69
Практические рекомендации 70
Перечень условных обозначений 71
Список литературы 73
Приложение 90
- Классификация основных видов гематогенных тромбофилии
- Методы исследования системы гемостаза и фибринолиза
- Показатели системы гемостаза и фибринолиза у женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения до и после проведения гепаринопрофилактики
- Показатели системы гемостаза и фибринолиза / у пациенток до и после проведения курса перемежающей пневматической компрессии
Введение к работе
Актуальность темы.
Нарушения в системе гемостаза (антифосфолипидный синдром, гипергомоцистеинемия, носительство протромбогенных мутаций фактор V Лейден, протромбина и ряда других полиморфизмов) считаются не только факторами тромбогенного риска, но и причинами неудач наступления беременности в естественном цикле и при вспомогательных репродуктивных технологиях (Баркаган З.С., 2005, Макацария А.Д. и соавт., 2007, 2008; Папаян Л.П., 2003; Сидельникова В.М., Кирющенков П.А., 2004) . Соответственно принято считать, что тромбозу и синдрому потери плода предшествует и сопутствует тромбофилия (Bonnar J., 1996; Braekkan S. et al., 2010; Christiansen S. et al., 2005; Geerts W. et al., 2004). Согласно описанию профессора З.С. Баркагана (1996, 2005) под этим состоянием могут пониматься все наследственные (генетически обусловленные) и приобретенные (вторичные, симптоматические) нарушения гемостаза, которым свойственна предрасположенность к раннему появлению и рецидивированию тромбозов, тромбоэмболий, ишемий и инфарктов органов.
Неудачи экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) ряд авторов связывает с повышенной склонностью к свертыванию крови (Макацария и соавт, 2008; Охтырская Т.А. и соавт., 2010; et al., 2011; Westerlund E. et al., 2012). Последняя обуславливается рядом причин – ятрогенной (тромбогенностью самой медицинской технологии), частым наличием у женщин, нуждающихся в ЭКО, тех или иных факторов тромбогенного риска, склонности к внутрисосудистому свертыванию крови, а также нарушениями в системе фибринолиза ( et al., 2011; Westerlund E. et al., 2012). Однако, до настоящего времени не определены информативные методы исследования системы гемостаза, выявляющие нарушения гемокоагуляции и фибринолитической активности крови, сопутствующие или предшествующие проведению ЭКО и влияющие на его результаты.
Для снижения тромбогенности крови в цикле ЭКО описано применение низкомолекулярных гепаринов - НМГ (Nelson S., Greer I., 2008; Urman B. et al., 2009). Однако показания для их назначения четко не описаны, в связи с чем, гепаринопрофилактика при гормональной нагрузке в ходе ЭКО, как правило, проводится без объективного обоснования. Для этого в настоящей работе изучена возможность использования теста генерации тромбина (ТГТ), отражающего динамику и интенсивность образования тромбина - ключевого фермента системы свертывания крови (Наместников Ю.А. и совт., 2010, 2011; Hemker H. et al., 2000, 2006).
Имеются данные о связи снижения фибринолитической активности крови с неудачными исходами репродуктивных технологий (Вартанян Э.В. и соавт., 2010; Westerlund E. et al., 2012). Тем не менее, коррекция низкой фибринолитической активности представляет определенные трудности, поскольку в литературе нет описаний успешного применения соответствующей лекарственной терапии. В течение примерно 50 лет известно, что некоторые стимулы (венозная окклюзия, физическая нагрузка, десмопрессин) вызывают ускорение фибринолитических реакций, обусловленное быстрым увеличением тканевого активатора плазминогена (t-PA) в крови в связи с его усиленной секрецией эндотелием кровеносных сосудов. Наше внимание привлекли эффекты перемежающей пневматической компрессии - ППК, используемые для интра- и послеоперационной тромбопрофилактики. О повышении фибринолитической активности крови и t-PA после механического воздействия на сосуды свидетельствуют результаты ряда авторов (Christen Y. et al., 1997; Salzman E. et al., 1987). Между тем данных о динамике активности ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) при этом в публикациях мы не нашли. В представленной работе ППК была использована для активации фибринолитических реакций при наличии соответствующих показаний.
Данным проблемным вопросам и была посвящена настоящая работа.
Степень разработанности темы исследования.
До настоящего времени отсутствуют данные о возможных изменениях в системе гемостаза в цикле экстракорпорального оплодотворения, не определены наиболее информативные методы исследования гемостаза при этом виде высокотехнологичной медицинской помощи. Не известна связь результатов таких методов с исходами ЭКО. Научно и практически не обоснованы показания для использования лечебных подходов, призванных корригировать нарушения системы гемостаза и снижать частоту неудачных попыток ЭКО.
Цель исследования
Определить значение диагностики и коррекции нарушений в системе гемостаза для снижения частоты неудачных исходов в стандартном протоколе экстракорпорального оплодотворения.
Задачи исследования
1. Выявить наличие и варианты изменений параметров системы гемостаза в стандартном цикле экстракорпорального оплодотворения.
2. Определить наиболее информативные лабораторные маркеры типовых нарушений гемокоагуляции, предшествующих или возникающих в цикле экстракорпорального оплодотворения.
3. Установить корреляционную связь избыточной генерации тромбина и низкой фибринолитической активности сосудистой стенки с неудачными исходами экстракорпорального оплодотворения.
4. Изучить значение проведения коррекции нарушений в системе гемостаза и фибринолитической активности крови для исходов экстракорпорального оплодотворения.
Научная новизна
Впервые определены типовые сдвиги в системе гемостаза – сопутствующие и развивающиеся в цикле экстракорпорального оплодотворения. Выявлено, что традиционные методы лабораторного исследования системы гемостаза являются малоинформативными (агрегация тромбоцитов, скрининговые тесты коагулограммы, уровень D-димеров, активность физиологических антикоагулянтов). Установлено, что наибольшей диагностической ценностью обладают методы оценки избыточного образования тромбина в плазме крови (по тесту генерации тромбина) и учета фибринолитической активности сосудистой стенки (по индексу АФСЭ). Высокая генерация тромбина проявляет себя в цикле экстракорпорального оплодотворения в 31,2% наблюдений (подана заявка на изобретение «Способ определения у беременных высокого тромбогенного риска при проведении процедуры экстракорпорального оплодотворения» № 2012109534/15, приоритет от 13.03.2012 г.).
Низкая фибринолитическая активность предшествует гормональной нагрузке и определяется в 21,7% наблюдений. Сочетанные нарушения, отмеченные выше, выявляются в 24,2% случаев.
Установлена связь между избыточной генерацией тромбина, низкой фибринолитической активностью сосудистой стенки крови и неудачными исходами экстракорпорального оплодотворения. В частности, коэффициент корреляции (Спирмена) не наступления беременности с высокой пиковой концентрацией тромбина (свыше 360 ммоль/л) составил 0,88 (p<0,002), а с индексом АФСЭ (менее 11%) был равен 0,67 (P<0,02).
Найдено, что перемежающая пневматическая компрессия способствует не только увеличению активности в крови тканевого активатора плазминогена (t-PA), но и снижению активности ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) .
Определена возможность не медикаментозной коррекции низкой фибринолитической активности сосудистой стенки в цикле экстракорпорального оплодотворения путем воздействия аппаратной перемежающей компрессии верхних конечностей (положительное решение на выдачу патента «Способ повышения эффективности наступления беременности» по заявке № 2012109294, приоритет от 12.03.2012 г.).
Теоретическая значимость работы
Доказана высокая значимость избыточной генерации тромбина и низкой фибринолитической активности крови и сосудистой стенки для неудачных исходов экстракорпорального оплодотворения.
Практическая значимость
Предложены новые методические подходы для лабораторного исследования системы гемостаза в цикле экстракорпорального оплодотворения, предусматривающие динамическую оценку способности плазмы к генерации тромбина и фибринолитического потенциала крови и сосудистой стенки.
Определены пограничные значения теста генерации тромбина в цикле ЭКО и индекса активирующей фибринолиз способности эндотелия (индекса АФСЭ) для отбора женщин, нуждающихся в гепаринопрофилактике и/или активации системы фибринолиза с целью коррекции ятрогенных и сопутствующих нарушений гемостаза.
Разработана и апробирована методика не медикаментозной коррекции снижения фибринолитической активности крови в цикле ЭКО.
Применение по соответствующим показаниям профилактических доз низкомолекулярного гепарина и/или перемежающей пневматической компрессии способствовало уменьшению числа неудач этой репродуктивной технологии, в среднем, на 33,8% (P=0,00001).
Методология и методы исследования
Для решения поставленных задач проведено лабораторное исследование системы гемостаза и фибринолиза 327 женщин, направленных врачами акушерами-гинекологами Центра сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ «Краевой клинической больницы» г. Барнаула для прохождения программы ЭКО в связи с бесплодием в период с 2011 по 2012 год. Предмет исследования – нарушения в системе гемостаза и фибринолитической активности крови при различных исходах вспомогательных репродуктивных технологий и методы их коррекции. В число методов исследования системы гемостаза включены традиционные и современные интегральные методы, позволившие достичь решения поставленных задач.
Положения, выносимые на защиту
Выявлены типовые динамические изменения ряда параметров системы гемостаза и фибринолиза в цикле экстракорпорального оплодотворения.
Отобраны информативные методы исследования системы гемостаза и фибринолитической активности сосудистой стенки, результаты которых соотносились с исходами ЭКО. Коэффициент корреляции (Спирмена) не наступления беременности с высокой пиковой концентрацией тромбина (свыше 360 ммоль/л) составил 0,88 (p<0,002), а с индексом АФСЭ (менее 11%) был равен 0,67 (P<0,02).
Избыточная генерация тромбина развивается на фоне гормональной нагрузки в цикле ЭКО в 31,2% наблюдений, проявления же низкой фибринолитической активности, встречаются в 21,7% наблюдений и предшествуют проведению данной репродуктивной технологии. Одновременное наличие названных выше нарушений со стороны системы гемостаза и фибринолиза определено у 24,2% пациенток.
Коррекция избыточной генерации тромбина профилактическими дозами низкомолекулярного гепарина и/или низкой фибринолитической активности сосудистой стенки путем пневматической перемежающей компрессии, при наличии показаний, приводит к снижению частоты неудачных исходов ЭКО соответственно на 33,3%, 38,9% и 28,9% (P<0,01).
Степень достоверности результатов
Статистическая обработка полученных данных осуществлена с использованием программ Microsoft Offis Exel 2003, Statistica 6.1 и Medcalc 12.2.1. Достоверность различий между средними величинами определяли с помощью критерия значимости Стьюдента (t). Нормальность распределений в группах оценивали по критерию Шапиро-Уилка. В том случае, когда распределение отклонялось от нормального, использовался непараметрический критерий Манна-Уитни для двух независимых групп, а также ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Когда экспериментальные данные были представлены в виде процентов или частот, использовался точный критерий Фишера. Для характеристики точности полученных значений определяли 95% доверительный интервал. Статистически значимыми принимались различия P<0,05.
Апробация материалов диссертации.
Положения диссертационной работы были представлены на XIII научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь – Барнаулу» (г. Барнаул, 2011 г.); Дне российской науки в «Алтайском государственном медицинском университете» (г. Барнаул, 2012 г.); V Научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (г. Москва, 2011 г.); VI Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Москва 2012 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (г. Санкт-Петербург, 2012 г.); Дне российской науки в «Алтайском государственном медицинском университете» (г. Барнаул, 2013 г.); VI Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» им. А.Н. Бакулева (г. Москва, 2013 г.); XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2013 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 6 в журналах из списка ВАК, одна – в рецензированной коллективной монографии, изданной в России и одна – в международном рецензируемом издании.
Внедрение результатов исследования
Научные положения и практические рекомендации, приведенные в диссертации, используются при обучении врачей на тематических циклах повышения квалификации «Гематология с курсом физиологии и патологии гемостаза» ФПК и ППС ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава РФ и внедрены в практику работы краевой лаборатории патологии гемостаза и Центра сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ «Краевой клинической больницы» г. Барнаула.
Личный вклад автора
Материал, представленный в работе, получен и проанализирован лично автором. Лабораторное исследование крови пациенток проводилось на базе краевой лаборатории патологии гемостаза (заведующий – д.м.н. А.Н. Мамаев) и лаборатории гематологии ЦНИЛ АГМУ (научный руководитель – д.м.н., проф. А.П. Момот) с личным участием автора. Отбор, направление и ведение женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения проводилось акушерами-гинекологами - заведующей отделением сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ «Краевая клиническая больница», к.м.н. О.Г. Борисовой и консультантом акушером-гинекологом Главного управления Алтайского края по здравоохранению и фармацевтической деятельности, к.м.н. И.В. Молчановой. Написан аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Проведено обобщение полученных данных, формулировка выводов, практических рекомендаций, написание рукописей к публикациям, оформлена диссертация и автореферат.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 3 рисунков, 12 таблиц, три клинических примера. Состоит из введения, обзора литературы, одной главы с описанием материалов и методов, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Библиография включает 153 источника, из них 51 - отечественных и 102 - зарубежных.
Классификация основных видов гематогенных тромбофилии
I. Гемореологические формы
1.1. Полицитемии и полиглобулии
1.1.1. Идиопатические, семейные
1.1.2. Лейкемические
- с гипертромбоцитозом
- без гипертромбоцитоза
1.1.3. Симптоматические (нефрогенные, гипоксические, при артериовеноз-ных шунтах)
1.1.4. Дегидратационные
1.1.5. При нарушениях физиологической гемодилюции (в т.ч. при беременности)
1.2. Нарушения объема, формы эритроцитов
1.3. Формы, связанные с гипервискозностью плазмы (парапротеинемии, ги-перфибриногенемия и др.)
II. Формы, обусловленные нарушениями сосудисто-тромбоцитарного гемостаза
2.1. Тромбоцитемии и гипертромбоцитозы (первичные, симптоматические, в т.ч. неопластические)
2.2. Формы с повышенной спонтанной агрегацией и адгезивностью тромбоцитов и/или с повышенной чувствительностью к агонистам агрегации (коллагену, АДФ, адреналину, арахидоновой кислоте)
2.2.1. Генетически обусловленные (синдром вязких тромбоцитов и др.)
2.2.2. Симптоматические формы (при гиперлипидемиях, диабете и др.)
2.2.3. Формы, связанные с дефицитом плазменных ингибиторов агрегации или появлением в крови патологических стимуляторов агглютинации тромбоцитов (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и др.)
2.3. Формы, связанные с повышенной продукцией и/или активностью фактора Виллебранда
2.3.1. Наследственные (семейные)
2.3.2. Вторичные (симптоматические)
2.3.3. Другие неидентичные формы
III. Формы, обусловленные дефицитом или дисфункцией первичных физиологических антикоагулянтов
3.1. Дефицит и аномалии антитромбина-Ш (1,11,111 типа)
3.1.1. Генетически обусловленные формы
3.1.2. Вторичные симптоматические формы
3.2. Дефицит и аномалия протеина С
3.3. Резистентность к протеину С (а)
3.3.1. Наследственная форма (фактор V, Лейден)
3.3.2. Приобретенные формы (при антифосфолипидном синдроме)
3.3.3. Избыток ингибитора протеина С
3.4. Дефицит и аномалия протеина S (I и II типа) - общего и свободного
3.5. Дефицит кофактора II гепарина
3.6. Формы, связанные с недостаточной активацией или ингибицией фибринолиза из-за аномалий протеинов С и S или высокой активности их ингибиторов
3.7. Гиперпродукция богатого гистидином гликопротеина (БГГП)
3.8. Смешанные формы антикоагулянтной недостаточности (3.1+3.5;3.2+3.3; 3.3+3.4)
IV. Формы, связанные с дефицитом или аномалиями плазменных факторов свертывания крови и фибринолиза
4.1. Дисфибриногемии
4.1.1. Наследственные
4.1.2. Вторичные (симптоматические)
4.2. Аномалия фактора V (Лейден)
4.3. Дефицит, аномалии или ингибиция фактора XII
4.4. Дефицит плазменного прекалликреина и/или высокомолекулярного кининогена
4.4.1. Наследственные формы (дефект Флетчера и Фицжеральда-Фложак)
4.4.2. Вторичные (приобретенные) формы
4.5. Дефицит и/или аномалии плазминогена
4.5.1. Наследственные формы
4.5.2. Приобретенные формы
4.6. Дефицит и нарушения высвобождения из эндотелия тканевого активатора плазминогена (ТПА)
4.6.1. Наследственные формы
4.6.2. Приобретенные формы
4.7. Повышенное содержание в плазме ингибиторов ТПА (PAI- 1 и PAI-2) или а2-антиплазмина
4.8. Нарушение активации фибринолиза, в т.ч. при избытке его ингибитора
4.9. Истощение фибринолиза при ДВС-синдроме
4.10. Истощение или депрессия фибринолиза лекарственного генеза (лечение тромболитиками, ингибиторами фибринолиза и др.)
V. Формы, связанные с повышением содержания и активацией факторов свертывания
5.1. Гиперфибриногенемия
5.1.1. Стабильная
5.1.2. Преходящая
5.2. Повышение уровня и активации фактора VII
5.2.1. При гиперлипидемии (в т.ч. в третьем триместре беременности)
5.2.2. При гипертромбопластинемии
5.2.3. При диабете и атеросклерозе
5.3. Повышение уровня фактора VIII (более 170%)
VI. Формы аутоиммунного и инфекционно-иммунного генеза
6.1. Антифосфолипидный синдром (формы с волчаночным антикоагулянтом в плазме)
6.1.1. Первичный АФС
6.1.2. Вторичный АФС при системных иммунных заболеваниях и опухолях - формы с антителами к В2ГП1, анексину, протромбину и др. - формы с резистентностью к протеину С
6.2. При болезни и синдроме Бехчета
6.3. При аллергических и других иммунных заболеваниях
6.3.1. При иммунных тромбоваскулитах
6.3.2. Лекарственная форма
6.4. При инфекционно-иммунных заболеваниях
6.4.1. Тромбогеморрагическая лихорадка
6.4.2. Гемолитико-уремический синдром
6.4.3. При бактериальном эндокардите и других видах сепсиса
VII. Паранеопластические тромботические синдромы (синдром Труссо и другие)
VIII. При обменных заболеваниях
8.1. Диабет, диабетическая ангиопатия
8.2. Гомоцистеинемия (гомоцистеинурия)
8.3. Ожирение
Методы исследования системы гемостаза и фибринолиза
Получение образцов плазмы крови для исследования. Взятие венозной крови осуществлялось из локтевой вены в пробирки VACUETTE, рассчитанные на 9 мл крови (9NC Coagulation sodium citrate 3,2%). При значительных отклонениях гематокрита от средних значений (менее 35% или более 70%) кровь забирали широкой иглой в пластиковые пробирки в соответствии с рекомендациями руководства З.С. Баркагана и А.П. Момота [6]. Кровь немедленно смешивали с 3,2% раствором цитрата натрия в расчетном соотношении. Стабилизированную кровь центрифугировали при 3000-4000 об/мин (1200-1400g) в течение 15 мин при комнатной температуре (+18...+25 С). Полученную бедную тромбоцитами плазму (БТП) использовали в исследованиях в течение первых 2-х часов.
Для проведения ряда иммуноферментных анализов, а также при оценке теста генерации тромбина, пробы БТП замораживали в низкотемпературном холодильнике MDF-192 Ultra low temperature freezer фирмы «Sanyo» (Япония) при температуре минус 40 С на срок до одного месяца.
При исследовании системы гемостаза использовались следующие методы:
А. Скрининговые коагуляционные тесты и определение активности факторов свертывания крови:
- Активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) по Caen et al. (1968), с использованием набора реагентов «Тех-АПТВ-Эл-тест», преду сматривающего использование для активации контактной фазы солей эллаговой кислоты .
Протромбиновое время (ПВ) по Quick (1935) с тромбопластином, стандартизированным по международному индексу чувствительности (МИЧ 1,1-1,3) -набор реагентов «Техпластин-тест» .
- Тромбиновое время (ТВ) по Biggs, Macfarlane (1962) - набор реагентов «Тромбо-тест» .
- Определение концентрации фибриногена (фактор I, по современной но I I менклатуре) в плазме крови по Clauss (1957) - с помощью набора реагентов «Тех Фибриноген-тест» .
Б. Показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза:
- Оценка агрегации тромбоцитов проводилась на агрегометре Chronolog 490-4D (США) с использованием в качестве индукторов агрегации АДФ (10 мкМ и 1,25 мкМ).
В. Определение маркеров тромбинемии и состоявшегося фибринолиза:
- Оценка уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов - РФМК (синоним - растворимого фибрина) в плазме - ортофенантролиновым методом (О-ФТ) по Елыкомову В.А. и Момоту А.П. (1987) - набор реагентов «РФМК-тест» .
- Определение концентрации D-димеров в плазме крови проводилось с помощью набора реагентов «D-dimer Red-700» фирмы «Helena Bioscience» (Великобритания) и коагулометра «SYSMEX СА-1500» фирмы «Sysmex» (Япония). Этот показатель рассматривался нами в соответствие с общепринятыми представлениями, в качестве «глобального» маркера состоявшегося фибринообразования и фибринолиза стабилизированного фибрина.
Г. Определение активности физиологических и патологических антикоагулянтов:
- Оценка активности антитромбина III, амидолитически - набор реагентов «ХромоТех-Антитромбин» .
Д. Изучение фибринолитических реакций:
- Определение уровня плазминогена, амидолитически - набор реагентов «ХромоТех-Плазминоген» .
- Определение времени[лизиса сгустка (ВЛС). Данный метод многие авторы относят к глобальным тестам для оценки фибринолиза, и он имеет ряд вариантов своего выполнения [ПО, 115, 150]. Способ оценки времени спонтанного лизиса фибринового сгустка, полученного из эуглобулинов плазмы, был описан еще Ко-warzyk et Buluk [109]. В его основе лежит осаждение эуглобулиновой фракции стабилизированной цитратом натрия в кислой среде, в ходе которой удаляются ингибиторы фибринолиза. Далее, при выполнении методики, путем рекальцификации восстановленного раствора эуглобулинов вызывают образование сгустка и отмечают время его полного растворения при фиксированной температуре (+37 С). В нашей работе использовалась модификация метода Kowarzyk et Buluk, где в качестве активатора фибринолиза применялся каолин, активирующий контактную фазу свертывания и запускающий цепочку активации: «фактор ХПа - калликреин - плазмин». Описание данного метода было приведено ранее Баркаганом З.С. ,[6].
- Определение активности t-PA и PAI-1 осуществлялось методом иммунофер ментного анализа с использованием наборов реагентов «t-PA Combi Actibind ELISA Kit» и «Actibind PAI-1 ELISA» (фирмы Technoclone, Австрия), а полученные данные оценивались в сопоставлении между собой. Учитывая, что эти важные участники фибринолитических реакций являются антагонистами по отношению друг к другу и имеют общее происхождение (эндотелий кровеносных сосудов), в настоящей работе рассчитывался индекс активирующей фибринолиз способности эндотелия (индекс АФСЭ). Тест генерации тромбина (ТГТ), позволяющий с высокой точностью измерять динамику образования и инактивации тромбина [30, 86, 97, 99]. Принцип этого сравнительно нового и высокоточного теста заключается в измерении количества тромбина, который образуется при рекальцификации цитратной плазмы в присутствии фиксированной концентрации тканевого фактора и флюорогенного субстрата [33, 139, 147]. С помощью флюориметра и компьютерной обработки данных за определенный отрезок времени измеряют площадь кривой генерации тромбина, имеющей восходящую часть, участок достижения максимума и нисходящую часть, характеризующую инактивацию этого фермента. Данная методика имеет известное сходство с ранее описанным двухступенчатым аутокоагуляцион-ным тестом по Berkarda et al. [24], предложенным еще в 1965 г. В наших исследованиях для выполнения ТГТ применялся планшетный флюориметр Fluoroskan Ascent фирмы «ThermoFisher SCIENTIFIC» (Финляндия), с программным обеспечением «Thrombinoscope 3.0.0.26». Коагуляция исследуемой плазмы крови осуществлялась в присутствии 5 пмоль тканевого фактора и 4 мкмоль фосфолипидов, генерация тромбина регистрировалась посредством измерения сигнала флуоро-генного субстрата Z-Gly-Gly-Arg-AMC. Учитывались два основных показателя данного теста: ЭТП (эндогенный тромбиновый потенциал, нмоль/мин), рассчитывающий площадь под кривой генерации тромбина, учитывающей особенности инактивации этого фермента, и ПКТ (пиковая концентрация тромбина, нмоль/л), учитывающая максимальную концентрацию тромбина в единицу времени измерения.
Показатели системы гемостаза и фибринолиза у женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения до и после проведения гепаринопрофилактики
Мы сделали также отдельные расчеты лабораторных параметров у женщин с высокой генерацией тромбина, отнесенных в группу пациенток, нуждающихся в гепаринопрофилактике (таблица 10). В итоге было определено, что применение низкомолекулярного гепарина, начиная с середины цикла экстракорпорального оплодотворения (за 2-3 дня до пункции фолликулов), приводит к закономерному снижению интенсивности изученных параметров генерации тромбина. В частности, на фоне назначения гепаринов показатель эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) между 2-й и 3-й точками наблюдений снизился на 18,1%, по сравнению со снижением на 3,6% у женщин, не получавших эти антикоагулянты. Похожую динамику имела и пиковая концентрация тромбина (ПКТ), которая уменьшилась соответственно на 13,2% и 1,8%.
Следует отметить, что показатели, характеризующие фибринолитическую активность плазмы крови, при этом не менялись и оставались стабильными вне зависимости от приема гепарина и сроков проведения исследования.
В качестве иллюстрации к изложенному выше материалу приводится характерный клинический пример:
Пациентка В.О., 31 год, жительница г. Барнаула, обратилась в 2011 году в Центр восстановления и сохранения репродуктивной функции Краевой клинической больницы г. Барнаула по направлению акушера-гинеколога из-за отсутствия беременности в течение последних двух лет в связи с мужским фактором (олигозооспермией). При сборе анамнеза исключены хронические гинекологические заболевания. Беременностей, абортов у пациентки в прошлом не было.
Пациентке было проведено исследование системы гемостаза и фибриноли-за. По показателям теста калиброванной тромбографии выявлена избыточная генерация тромбина. В частности, эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП) составил 1549,2 нмольхмин (при допустимом диапазоне значений M±SD 1618,5-1730,9 нмольхмин), а пиковая концентрация тромбина (ПКТ) была равна 309,1 нмоль/л (при допустимом диапазоне значений M±SD 297,1-348,5 нмоль/л).
Индекс АФСЭ имел допустимую величину - 13,2% (при норме не менее 11%). Женщина была взята в цикл экстракорпорального оплодотворения по стандартному протоколу. На 2-й точке исследований (за 2 дня до пункции яйцеклеток яичников) вновь были определены показатели теста генерации тромбина - ЭТП и ПКТ. Их значения составили соответственно 1989,2 нмольхмин и 394,4 нмоль/л, что превышало допустимые значения, определенные в нашей работе. В связи с этим предпринята фармакологическая коррекция в виде назначения курса низкомолекулярного гепарина в повышенной профилактической дозе - надропарин кальция по 0,3 мл подкожно в область живота два раза в день.
На 3-й точке исследований ЭТП заметно снизился и составил уже 1487,2 нмольхмин, а ПКТ уменьшилась до 331,1 нмоль/л. В эти же сроки по биохимическим критериям установлено успешное наступление беременности.
Показатели системы гемостаза и фибринолиза / у пациенток до и после проведения курса перемежающей пневматической компрессии
Аналогичные расчеты были проведены у женщин с гипофибринолизом и в случаях сочетания низкой фибринолитической активности плазмы крови с избыточной генерацией тромбина (таблицы 11 и 12). Было установлено, что при изолированном воздействии ППК у женщин с исходным - до вхождения в цикл экстракорпорального оплодотворения гипофибринолизом - имелось резкое нарастаниє индекса АФСЭ и укорочение времени лизиса эуглобулинового сгустка. Вазо-компрессионная терапия к концу процедуры ЭКО приводила не только к достоверно выраженному повышению активности t-PA (Р 0,05), но и к снижению активности PAI-1 в конце цикла ЭКО в 1,75 раза (Р 0,05).
Полученные результаты иллюстрируются следующим клиническим примером:
Пациентка З.С., 31 год, жительница Алтайского края, обратилась в 2011 г. в Центр сохранения и восстановления репродуктивной функции Краевой клинической больницы г. Барнаула по поводу трубного бесплодия для прохождения программы ЭКО.
В рамках исследования, системы гемостаза перед вхождением в цикл ЭКО изучались показания теста генерации тромбина, время лизиса сгустка эуглобулинов, а также активность t-PA и PAI-1. В итоге получены следующие данные: до вхождения в цикл ЭКО индекс АФСЭ был снижен до 9% (в норме - не менее 11%), ВЛС зарегистрировано на уровне 16 мин (норма - до 12 мин), показатель ЭТП в тесте генерации тромбина составил 1645,3 нмольхмин (при допустимом диапазоне значений M±SD 1618,5-1730,9 нмольхмин), а ПКТ - 310,4 нмоль/л (при допустимом диапазоне значений M±SD 297,1-348,5 нмоль/л).
С учетом низкой фибринолитической активности сосудистой стенки пациентке был назначен курс ППК - 2 раза в неделю с интервалом в 2-3 дня. В результате предпринятого лечения, предусматривающего нефармакологическое воздействие, на 2-й точке обследования индекс АФСЭ увеличился в 2,23 раза и оказался равным 20,1%, в то же время лизиса сгустка эуглобулинов сократилось до 10 мин. Далее, в конце цикла ЭКО, на 3-й точке наблюдений индекс АФСЭ составил 21,3%, а ВЛС - 11 мин, что сопутствовало успешному наступлению беременности.
Далее мы проанализировали результаты сочетанного применения перемежающей пневматической компрессии и низкомолекулярного гепарина. Данное воздействие оказывало наиболее благоприятное влияние на показатели гемостаза и фибринолиза, что соответствовало максимальному снижению числа неудачных исходов ЭКО (таблица 12).
Данные таблицы 12 наглядно свидетельствуют, что у женщин, прошедших такую терапию нормализовались показатели, отражающие как скорость образования фибрина, так и фибринолитическую активность плазмы крови и сосудистой стенки.
Среди всех обследованных было выявлено только 6 женщин из 327 (1,8%), имеющих редкие мутации - F5 Leiden (G1691— А) и FII (G20210— А), ассоциирующиеся с тромбозами и неудачами беременности. Поэтому в настоящем исследовании мы не смогли определить их роль для исходов ЭКО. Более часто встречающиеся в группе обследованных нами женщин полиморфизмы гена MTHFR (С677— Т) и гена PAI 1 (5G— 4G) по сравнению с результатами исследования Coulam С. et Jeyendran D. (2009) не показали своей значимости.
Представленные в данной главе данные указывают на возможность фармакологической и нефармакологической коррекции нарушений в системе гемостаза и фибринолиза. Использование таких воздействий существенно уменьшает число неудачных исходов экстракорпорального оплодотворения.
