Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время во всем мире активно изучаются возможности терапевтического применения различных клеточных популяций для лечения ряда заболевании. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которая применяется с конца 1960-х годов (Gatti R., 1968; Bach F., 1968) для лечения больных с различными заболеваниями системы крови, является в настоящее время одним из общепринятых методов лечения различных заболеваний (Афанасьев Е.В.1994; Румянцев А.Г 1996; Thomas E.D., 2000).
Существование в костном мозге (КМ), наряду со стволовыми кроветворными клетками, стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток, было впервые доказано в А.Я.Фриденштейном и соавт., 1970. Способность стволовых клеток стромы к самообновлению и дифференцировке в различные мезенхимальные элементы была подтверждена в многочисленных исследованиях (Фридешнтейн А.Я., 1970; Owen М., 1988; Владимирская Е.Б., 1990; Jones ЕА., 2002; Gronthos S., 2003).
В дальнейших исследованиях, в основном экспериментальных, была продемонстрирована зависимость кроветворения от стромального микроокружения (Фридснштейн А.Я., 1980; Owen М., 1988; К. Le Blanc, 2007). Продемонстрирована преимущественная связь отдельных элементов стромы (жировые клетки и остеобласты) с ростками кроветворения (Pittenger М., 1999; Bianco Р., 2000; Muraglia А., 2000).
На основании изучения возможностей влияния элементов стромы на кроветворение, трансплантация МСК рассматривается как один из возможных методов лечения гематологических и онкологических заболеваний. В основе этих работ лежит возможность МСК улучшать приживление трансплантата при ко-трансплантациях; снижать частоту и тяжесть иммунных реакций (РТПХ), особенно при неродственной трансплантации; замещать и восстанавливать функции поврежденных негемопоэтических тканей. (Minguell J J., 2000; Stenderup К. 2003; Miura M. 2005; К. Le Blanc. 2007; Alma J., 2007).
Однако, в связи с противоречивыми результатами исследований, трудностями оценки МСК, выращенных in vitro для клинических целей (Tai М.- Н. 2004; Rubio D. 2005; Kassem М. 2005; Muira М.,2006), а также оценки терапевтического эффекта МСК (Brtholomew А. 2002, Zhang J.2005, Ball LM.2006)! Проблема использования МСК в клинической практике остается открытой. Изучение биологических свойств и возможностей трансалантации МСК полученных в результате длительного
культивирования у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями является актуальной для гематологи и педиатрии.
Цель работы:
Изучить биологические свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга in vitro в процессе длительного культивировании и обосновать возможности использования клеточных препаратов МСК для применения в клинической практике у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
-
Отработать и внедрить методику получения достаточного количества МСК из КМ человека для трансплантации детям с гематологическими и онкологическими заболеваниями.
-
Оценить дифференцированный потенциал МСК на ранних и поздних пассажах культивирования in vitro.
-
Разработать иммунофенотипическую панель для определения поверхностного иммунофенотипаМСК в трансплантационном материале.
-
Оценить динамику роста, изменение иммунофенотипа и генетическую стабильность МСК при культивировании in vitro на ранних и поздних пассажах.
-
Оценить инфузионную безопасность применения культивируемых МСК у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.
-
Изучить возможность определения донорского химеризма МСК в оценке приживления донорского МСК у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.
Научнав новизна
Полученные при помощи разработанной и хорошо воспроизводимой методики выделения и культивирования МСК КМ демонстрируют высокую функциональную активность и сохраняют способность к дифференцировке в адипоциты и остеоциты. Показано, что при длительном культивировании in vitro МСК КМ человека клетки 3-4 пассажа обладают максимальной пролиферативной активностью, которая снижается при дальнейшем культивировании. Предложенная для оценки чистоты клеточного препарата иммунофенотипическая панель показала высокую чистоту МСК и отсутствие клеток с эндотелиальным и гемопоэтического рядов. Продемонстрирована генетическая
стабильность МСК. Впервые при оценке донорского химеризма была показана возможность приживления донорских МСК у детей.
Практическое значение
Практическое значение работы заключается в том, что используемая нами методика легко воспроизводима, доступна и позволят получить достаточное для клинического применения количество хорошо охарактеризованных мезенхимальньгх стволовых клеток.
Предложенная система контроля биологической и бактериологической безопасности может быть использована при приготовлении клеточных препратов МСК для клинического использования у детей.
Использованная при определении донорского химеризма методика продемонстрировала высокую эффективность при определении приживления МСК у детей при трансплантации костного мозга.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, октябрь 2008 г.), на VI Международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, январь 2009 г). 35th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation ( Goteborg, Sweden, April 2009 )
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава , ГУЗ «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г.Москвы» и отделения трансплантации костного мозга Российской детской клинической больницы Росздрава Объем и структура работы:
Материал диссертации изложен в одном томе на 100 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и проиллюстрирован 18 рисунками. Указатель литературы включает 12 источников отечественной и 212 зарубежной литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.
Работа выполнена в ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ -член - корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев), лаборатории регуляции кроветворения (зав.-д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель-д.м.н. Румянцев С.А.), на базе клинического отделения
трансплантации костного мозга (зав.- д.м.н. Скоробогатова Е.В.) Российской детской клинической больницы Росздрава (гл.врач - д.м.н., профессор Ваганов Н.Н.)
