Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. История знаний о МДС 12
1.2. Классификация МДС 13
1.3. Цитогенетические исследования при МДС 18
1.4. Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС 20
1.4.1. Аномалии хромосомы 5 21
1.4.2. Аномалии хромосомы 7 22
1.4.3. Аномалии хромосомы 8 23
1.4.4. Комплексный кариотип и клональная эволюция 24
1.5. МДС – клональное заболевание стволовой кроветворной клетки 25
1.5.1. Цитогенетические исследования кроветворных клеток-предшественниц 29
1.6. Роль стромального микроокружения 30
1.6.1. Строма костного мозга. Мезенхимальные стромальные клетки 30
1.6.2. Функциональные особенности стромы при МДС 33
1.6.3. Цитогенетические исследования клеток стромы 35
2. Материалы и методы 40
2.1. Дизайн исследования 40
2.2. Характеристика больных 41
2.3. Лабораторные исследования 42
2.3.1. Получение фракции мононуклеаров 42
2.3.2. Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови 43
2.3.3. Получение культуры МСК 44
2.3.4. Стандартное цитогенетическое исследование 46
2.3.5. Флюоресцентная in situ гибридизация 46
2.4. Статистический анализ 49
3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга 50
3.2. Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R 52
3.3. Результаты динамического наблюдения за больными МДС 56
3.4. Характеристика CD34+ клеток-предшественниц, полученных из костного мозга и периферической крови 60
3.4.1. Содержание CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови 60
3.4.2. Исследование цитогенетических аномалий в CD34+ клетках 63
3.4.3. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клинического варианта заболевания 68
3.4.4. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от их прогностической значимости 69
3.4.5. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клеточности костного мозга 70
3.4.6. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге 71
3.5. Характеристика МСК костного мозга 72
3.5.1. Темпы роста культуры МСК у больных и здоровых лиц 72
3.5.2. Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза 75
3.5.3. Стандартное цитогенетическое исследование МСК 78
3.5.4. Цитогенетическое исследование МСК методом FISH 80
3.5.5. Клиническое наблюдение пациента с клональными нарушениями кариотипа МСК 83
Заключение 87
Выводы 90
Библиографический список
- Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС
- Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови
- Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R
- Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге
Введение к работе
Актуальность проблемы Миелодиспластические синдромы (МДС) – группа клональных заболеваний системы крови, характеризующихся дисплазией одного или нескольких ростков миелопоэза, неэффективным кроветворением, которое проявляется цитопеническим синдромом, а также повышенным риском развития острого миелоидного лейкоза. Несмотря на определенные успехи в лечении МДС, достигнутые за последнее время, проблема наличия рефрактерных форм и быстрой прогрессии в острый лейкоз остается крайне актуальной (Савченко В.Г., 1996; Hofman W.K., 2004; Warlick E.D., 2007; Swerdlow S.H., 2008; Кохно А.В., 2009; Steensma D.P., 2012). В настоящее время единственным методом биологического излечения является трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, однако ее эффективность ограничена как возможностью выполнения (отсутствие HLA-совместимого донора, пожилой возраст и тяжелый соматический статус больного), так и частотой рецидивов заболевания. Результаты химиотерапевтического лечения остаются неутешительными, что делает необходимым проведение дальнейших исследований в этой области гематологии с целью получения более глубокого понимания патогенетических путей развития заболевания и разработки принципиально новых подходов к терапии.
Известно, что развитие клональных нарушений, приводящих к диспластическим изменениям в костном мозге, изначально происходит в стволовой кроветворной клетке (СКК) и ранних гемопоэтических (кроветворных) клетках-предшественницах (Prchal J.T., 1978; Janssen J.W., 1989; Haase D., 1996; Nimer S.D., 2008). В то же время функционирование, деление и дифференцировка незрелых кроветворных клеток обеспечивается их взаимодействием с компонентами стромального микроокружения, которое строит «дом» для гемопоэтических клеток и во многом определяет их дальнейшую судьбу (Чертков И.Л., 1984; Watt F.M., 2000). Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – важный клеточный компонент стромы, они представляют собой фракцию прилипающих к пластику фибробластоподобных клеток-предшественниц, образующих колонии in vitro. Они ответственны за поддержание и регуляцию кроветворения в костном мозге (Deans R.J., 2000). Согласно литературным данным, функционирование стромы костного мозга при МДС нарушено (Манакова Т.Е., 2000; Varga G., 2007; Schroeder T.M., 2012). Изменение функции компонентов стромального микроокружения при МДС важно, так как наряду с клонально-измененными кроветворными клетками строма является участником развития заболевания в костном мозге.
Исследование кариотипа клеток костного мозга входит в перечень обязательного обследования на этапе установления диагноза МДС. Хромосомные аномалии выявляют примерно у половины больных, они являются критерием подтверждения диагноза, фактором прогноза ответа на лечение и продолжительности жизни (Swerdlow S.H., 2008). Вместе с тем изучение цитогенетических особенностей как кроветворных, так и стромальных клеточных компонентов костного мозга имеет важное теоретическое значение для более глубокого понимания биологических процессов, лежащих в основе заболевания. Имеющиеся в литературе данные цитогенетических исследований клеток стромы костного мозга противоречивы (Soenen-Cornu, V. 2005; Flores-Figueroa E., 2008; Klaus, M., 2010; Blau O., 2011; Song L.-X., 2012). В связи с чем представляется важным изучение хромосомных аномалий не только в зрелых кроветворных клетках костного мозга, но и прицельно в популяциях ранних клеток-предшественниц, принимающих непосредственное участие в патогенезе МДС, – CD34+ гемопоэтических клетках и мезенхимальных стромальных клетках.
Цель исследования – охарактеризовать цитогенетические особенности CD34+ гемопоэтических клеток-предшественниц костного мозга и периферической крови и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных миелодиспластическими синдромами.
Задачи исследования
-
Оценить частоту и спектр хромосомных аномалий у больных МДС в момент диагностики
-
Сопоставить эффективность выявления хромосомных аномалий в клетках костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и флюоресцентной in situ гибридизации (FISH)
3. Охарактеризовать и сравнить изменения кариотипа в CD34+ гемопоэтических клетках-предшественницах костного мозга и периферической крови с помощью метода FISH. Охарактеризовать изменения кариотипа в CD34+ клетках в зависимости от клиникo-лабораторных данных
4. Оценить свойства мезенхимальных стромальных клеток костного мозга по их росту в культуре и исследовать наличие связи с клиническим вариантом заболевания, группой риска IPSS-R и морфологическими особенностями МДС
5. Изучить и сравнить цитогенетические изменения в МСК костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и FISH у больных МДС и здоровых лиц
Научная новизна
Впервые в России проведен комплексный анализ цитогенетических аномалий в изолированных популяциях кроветворных и стромальных клеток-предшественниц у больных МДС.
Научно-практическая ценность исследования
Полученные в исследовании результаты показали, что CD34+ клетки-предшественницы содержат хромосомные аномалии, определяемые в общей популяции клеток костного мозга. Размер патологического клона в общей популяции клеток костного мозга и CD34+ клетках одинаков. Выраженность клональных изменений в циркулирующих клетках-предшественницах коррелирует с их выраженностью в клетках-предшественницах костного мозга. Это имеет практическое значение, так как использование клеток периферической крови для проведения цитогенетических исследований у больных может уменьшить кратность пункций костного мозга.
Установлено, что мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга больных МДС, обнаруживают сниженную пролиферативную способность по сравнению с их аналогами у здоровых доноров костного мозга и проявляют генетическую нестабильность. Определяемые в МСК аномалии кариотипа отличны от аберраций в кроветворных клетках. Данные результаты имеют большое теоретическое значение и могут служить заделом для последующих исследований.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Клональные нарушения кариотипа CD34+ клеток-предшественниц, полученных как из костного мозга, так и из периферической крови, соответствуют аномалиям кариотипа общей популяции клеток костного мозга при МДС.
2. Хромосомные аберрации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга выявлены у 9,5% больных МДС; они отличны от аномалий кариотипа кроветворных клеток.
Апробация диссертации
Основные положения, материалы и результаты диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах:
– Конгресс гематологов России (Москва, 2012).
Международная гематологическая школа «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2012).
Научно-практическая конференция «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013).
– 12-й Международный симпозиум по миелодиспластическим синдромам (Германия, Берлин, 2013).
– 18-й Конгресс Европейской гематологической ассоциации (Швеция, Стокгольм, 2013).
По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисных сообщений. Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии “Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)” ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ 06 ноября 2013 года.
Объем и структура диссертации
Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС
Необходимо отметить, что выше приведены не все существующие варианты стратификации риска у больных МДС. Их многочисленность обусловлена разнообразием клинических вариантов заболевания, однако ни одна шкала в полной мере не отражает всех особенностей МДС. В частности, в классификации ВОЗ не отражено значение гистологической картины костного мозга, вместе с тем показано, что увеличение клеточности и наличие фиброза являются важными факторами, ухудшающими прогноз у больных МДС. Более того, показана необходимость двустороннего исследования трепанобиоптатов подвздошных костей, по крайней мере, в дебюте заболевания [4]. Следует также подчеркнуть, что прогностические шкалы определяют прогноз естественного течения заболевания у больных, не получающих специфическое лечение. А, следовательно, благодаря применению эффективных методов терапии, прогноз у пациентов с МДС может и должен быть изменен.
Анализ прогностической значимости новых исследований – проточной цитометрии [165] и исследования профиля генетических мутаций [24] – у пациентов с МДС продолжен, и, возможно, в скором времени будут предложены новые подходы к классификации и определению прогноза.
Цитогенетические исследования при МДС
В 1956 году двумя группами исследователей независимо друг от друга было установлено, что нормальный кариотип человека состоит из 23 пар хромосом: 22 пар аутосом и 1 пары половых хромосом [57, 152]. Началась эра клинической цитогенетики. Появление метода дифференциального окрашивания хромосом сделало возможным выделение и исследование каждой хромосомы в отдельности [38, 138]. Обработанные трипсином и далее окрашенные хромосомы приобретали специфическую для каждой пары исчерченность, обусловленную чередованием темных полос (G-полосы), содержащих интерстициальный гетерохроматин, и светлых участков. Метод стал стандартом цитогенетического исследования. В дальнейшем появление новых методик, в частности, флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), позволило проводить хромосомный анализ в интерфазных (не делящихся) ядрах. Впервые методика была описана в начале 1980х годов [94]. Наряду с возможностью изучения аномалий морфологии хромосом методом стандартного цитогенетического исследования, метод FISH позволил проводить анализ конкретных специфических последовательностей ДНК и РНК. Методика представляет собой использование флюоресцентных проб (зондов), которые связываются с комплементарными участками ДНК при помощи реакции гибридизации. Метод позволяет более точно определить локализацию и выявлять малые клоны с хромосомными аномалиями. Идеи о преимущественно клональной природе МДС возникли уже в 1960е годы. J.Grouchy с соавт. [46] описали аномалии хромосом F-группы (19-20 пары) у 5 из 6 пациентов с сидеробластной анемией (частичные делеции и перицентрические инверсии). Предполагалось, что гены, контролирующие процессы кроветворения, расположены в хромосомах указанной группы. R.E.Millard с соавт. [107] определили те же аномалии у больных истинной полицитемией, а R.M.Goodman [66] – у 79-летнего пациента с миелофиброзом. Однако позже стало очевидно, что эти соматические хромосомные аномалии могут быть определены в лимфоцитах периферической крови у лиц, не страдающих гематологическими заболеваниями, и ассоциированы с тяжелыми ментальными расстройствами [60, 51].
В середине 1970х годов были описаны клональные изменения в костном мозге у больных «предлейкозом» – трисомия 8, -7/del(7q), -5/del(5q) [124, 139]. Было подтверждено наличие клональных цитогенетических аномалий у пациентов с рефрактерной анемией, описаны аномалии 1 (дубликация 1q), 2 (t(2;7), t(2;21)), 3 (del(3p)), 5 (del(5q)), 20 (del(20q)), 7, 8, 9, 19 и 21 хромосом (трисомии) [22].
Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС
При цитогенетическом исследовании клеток костного мозга у больных МДС на момент установления диагноза клональные изменения кариотипа выявляют в 40-70% случаев в зависимости от варианта заболевания, при прогрессировании заболевания или развитии вторичной миелодисплазии они встречаются чаще – у 70-90% больных [68, 83, 106, 114, 134, 147, 164].
Сбалансированные хромосомные аберрации встречаются при МДС крайне редко; наиболее характерными являются аномалии с потерей (делеции, моносомии) или добавлением генетического материала (трисомии, изохромосомы, инсерции). Хромосомные аномалии, описанные при МДС, встречаются также и при ОМЛ de novo. Исключением является del(20q), характерная для категории МДС низкого риска, которая описана также у больных ХМПЗ. При МДС не встречаются характерные хромосомные аномалии, соответствующие специфическому варианту ОМЛ – t(15;17), inv(16), t(8;21), t(9;11). Аномалии кариотипа чаще определяют у пациентов с МДС категории высокого риска (РАИБ) в сравнении с категорией низкого риска (РЦ, РЦМД, РАКС). Однако за исключением del(5q), не выявлено связи конкретной хромосомной аномалии с клиническим вариантом МДС [83]. При МДС могут быть выявлены одновременно несколько патологических клонов, определяющихся в разных клетках [83]. Это явление не характерно для ОМЛ de novo. Показана роль кариотипа как независимого фактора прогноза при МДС [83, 168]. Не всегда присутствие клональных нарушений ассоциировано с быстрой трансформацией в острый лейкоз. Согласно прогностической шкале IPSS кариотип клеток костного мозга распределен на 3 категории: благоприятный (нормальный кариотип, изолированные del(5q), del(20q), -Y), неблагоприятный (-7/del(7q), комплексный кариотип) и промежуточный (+8 и другие аномалии) [68]. Наиболее распространенными аномалиями кариотипа являются аномалии с вовлечением хромосом 5, 7 и 8, каждая из которых изолированно или в составе множесcтвенных нарушений кариотипа встречается примерно у 10% больных МДС.
Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови
В исследование включены 43 больных, 20 мужчин и 23 женщины. Медиана возраста составила 59 лет (от 19 до 77 лет). Распределение по вариантам заболевания следующее: МДС – 36 больных (РA – 2, РАКС – 3, МДС с del(5q) – 3, РЦМД – 14, РАИБ1 – 5, РАИБ2 – 9), ОМЛ из предшествующей миелодисплазии – 7 больных. У двух из указанных больных (РАИБ-2 и ОМЛ) был онкологический анамнез и проводилась химиотерапия по поводу второй опухоли (вторичный МДС и ОМЛ).
Контрольную группу составили 7 здоровых доноров костного мозга и 4 больных лимфопролиферативными заболеваниями (диффузная В крупноклеточная лимфома – 2, лимфогранулематоз – 2). Обследование и клиническое ведение большинства больных осуществлено в научно-клиническом отделе высокодозной химиотерапии, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга (руководитель д. м. н. Е.Н. Паровичникова) и в поликлиническом отделении (заведующая д. м. н. А.Л. Меликян) ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Разработка дизайна исследования, научная и клиническая часть работы выполнена совместно с ведущим научным сотрудником отделения химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения к. м. н. А.В. Кохно.
Вариант заболевания устанавливали на основании критериев классификации ВОЗ [146]. Пациентам проводился анализ показателей гемограммы, цитологическое, цитохимическое и цитогенетическое исследования пунктата костного мозга и гистологическое исследование трепанобиоптата подвздошной кости. Характеристика включенных больных представлена в таблице 6: Фракцию мононуклеаров получали из аспирата костного мозга и периферической крови перед селекцией CD34+ кроветворных клеток-предшественниц и культивированием МСК. Клетки выделяли в градиенте 1,077 г/см3 плотности фиколла (Lympho Separation Medium - LSM, ICN Biomedicals, USA) при 1500 об/мин в течение 35 минут. Пипеткой собирали кольцо из мононуклеаров и отмывали от фиколла добавлением среды RPMI 1640 (Sigma, USA) или осМЕМ (HyСlone, USA). Клетки осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут, процедуру повторяли 3 раза.
Получение CD34+ клеток проводили методом позитивной иммуномагнитной селекции с использованием моноклонального антитела к CD34 (MicroBead kit, Miltenyi Biotec, Germany).
Фракция мононуклеарных клеток из костного мозга и периферической крови была пропущена через пресепарационный фильтр для устранения склеивания и закупорки магнитной колонки. Выполняли подсчет количества клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь пропускали через помещенную в магнитное поле и предварительно смоченную буферным раствором колонку. После удаления негативной немеченой антителом фракции клеток в эпендорф собирали позитивную фракцию.
Для пробы с количеством мононуклеаров до 2х108 использовали колонку MS MACS Column с соответствующим количеством буфера. Буферный раствор готовили из фосфатно-солевого буфера с pH=7,2, 0,5% бычьего альбумина, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), разведенной в основном растворе (MACS BSA Stock Solution) 1:20 с раствором auto MACS Rinsing Solution. Использовали дегазированный буферный раствор.
Контроль чистоты полученной фракции клеток был выполнен методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител анти-CD34-PE и анти-CD45-FITS (BD, USA). Чистота полученной фракции составила 94,5%. Результат представлен на рисунке 3:
Полученную суспензию клеток осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили фиксацию с использованием смеси ледяной уксусной кислоты с метиловым (96) спиртом в соотношении 1:3, клетки ресуспендировали в фиксаторе и затем осаждали, процедуру проводили трехкратно. Фиксированный клеточный осадок распыляли на поверхность адгезивного стекла с помощью цитоспина Shandon Cytospin 4 (Thermo scientific, USA) со скоростью 1000 об/мин в течение 8 минут. Далее выполняли исследование методом FISH.
Для получения МСК использовали аспират костного мозга. Мононуклеарную фракцию ресуспендировали в стандартной среде для культивирования, состоящей из среды ос-МЕМ (HyClone, USA), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, USA), 2 мМ L-глутамина (BioWest)), 100 ед/мл пенициллина (Ферейн, Россия) и 50 ед/мл стрептомицина (Ферейн, Россия). Клетки рассаживали в концентрации 1-8х106 клеток во флаконы для культивирования с площадью дна 25 и 75 см2 (Costar) и культивировали в 5% С02 в воздухе при т=37С. После образования конфлюэнтного монослоя клетки промывали раствором версена (0,02% раствор ЭДТА в физиологическом растворе (Sigma)), а затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина (ICN) и пассировали в концентрации 4x103 клеток на 1 см2 поверхности дна флакона. В работе использовали клетки после 2-3 пассажей (в двух случаях - после 4 и в двух случаях - после 5 пассажей), за которые происходило истощение кроветворных клеточных элементов, и достигалась чистая культура фибробластов. За 16-24 часа до снятия клеток во флакон добавляли колхицин или колцемид в количестве, необходимом для достижения конечной концентрации в среде 1 цг/мл. МСК снимали с флаконов 0,05% трипсином. Количество снятых со дна флакона клеток подсчитывали в камере Горяева, их жизнеспособность определяли по отсутствию окраски трипановым синим.
Следующим этапом готовили цитогенетический осадок. Клетки осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут и проводили гипотоническую обработку 0,55% (0,07М) раствором калия хлорида в инкубаторе при t=37С в течение 20 минут. Гипотонию прерывали добавлением 0,5 мл 5% уксусной кислоты и осаждали клетки при 1000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили фиксацию с использованием смеси ледяной уксусной кислоты с метиловым (96) спиртом в соотношении 1:3, клетки ресуспендировали в фиксаторе и затем осаждали, процедуру проводили трехкратно. Взвесь клеток с небольшом количеством фиксатора хранили в холодильнике при t=-18С до проведения цитогенетических исследований.
Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R
Достоверное различие темпов роста культуры МСК у больных МДС и здоровых доноров не получено (p=0,14). Несмотря на статистически не значимые отличия показателей динамики роста МСК, нельзя утверждать, что кинетика роста МСК больных МДС и здоровых лиц одинакова, так как проанализировано небольшое количество случаев, а также не были учтены больные, у которых клеточный монослой не сформировался (n=4).
Как представлено также в таблице 15, вследствие снижения пролиферативной способности МСК больных МДС в некоторых случаях не были получены митотически делящиеся клетки. Было проведено сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК в случаях получения достаточного количества анализируемых митозов и в случаях их отсутствия. Результаты представлены на рисунке 13: p=0,33
Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в культурах, в которых были получены и в которых отсутствовали митозы
Примечание: больные группа 1 - митозы получены; больные группа 2 - митозы отсутствовали
Время получения культуры МСК в группе 1 (n=18, митозы получены) и группе 2 (n=6, митозы не получены) не различалось и составило 45,1+15,3 и 51,3+13,6 дней, соответственно (p=0,33). Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза
В анализ включены больные, у которых формирование конфлюэнтного монослоя достигнуто на втором пассаже (n=24). Распределение клинических вариантов заболевания было следующим: 1 больной РА, 2 больных РАКС, 2 больных МДС с del(5q), 11 больных РЦМД, 2 больных РАИБ-1, 2 больных РАИБ-2 и 4 больных ОМЛ. Для сравнительного анализа больные с отсутствием бластоза в костном мозге (РА, РАКС, МДС с del(5q) и РЦМД) были объединены в одну группу, а больные с избытком бластных клеток (РАИБ-1 и РАИБ-2) и в стадии трансформации – в другую. Сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК у пациентов с разными вариантами заболевания представлено в таблице 16:
Вариант заболевания (без бластоза, с бластозом и ОМЛ) не влиял на время роста МСК в культуре. Среднее время формирования монослоя МСК на втором пассаже было одинаковым (p=0,39).
Распределение по группам риска согласно шкале IPSS-R было следующим: 10 больных группы низкого риска, 6 больных группы промежуточного риска, 3 больных высокого и 1 больной – очень высокого риска. Мы сравнили среднее время получения культуры МСК у больных их разных групп риска. Больные с высоким и очень высоким риском были объединены:
Как видно из таблицы, время роста МСК не зависело от группы риска. Далее проведен анализ связи между кинетикой роста МСК и морфологическими особенностями костного мозга.
При анализе гистологических препаратов костного мозга клеточность была снижена у 6 больных, соответствовала возрастной норме у 4 больных и превышала ее у 13 больных. Одному больному гистологическое исследование костного мозга не проводили. Было проанализировано время получения культуры МСК в зависимости от клеточности костного мозга. Для получения сопоставимых по количеству больных групп больные с гипо- и нормоклеточным костным мозгом были объединены. Результаты представлены в таблице 18:
Клеточность костного мозга достоверно влияла на активность роста МСК в культуре. Выявлено, что у больных с гиперклеточным костным мозгом время получения конфлюэнтного монослоя было значимо меньше, чем у больных со сниженной и нормальной клеточностью (p 0,05).
Наличие признаков коллагенового фиброза в трепанобиоптатах костного мозга в этой группе наблюдалось у 5 (21,7%) из 23 больных. В таблице 19 представлены показатели времени получения культуры МСК у больных с и без признаков фиброза в костном мозге: Таблица 19
Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных с наличием и отсутствием фиброза в костном мозге
Наличие морфологических признаков фиброза не влияло на показатели роста МСК в культуре. Среднее время формирования монослоя МСК у больных с фиброзом и без фиброза в костном мозге было одинаковым (p=0,86).
Известно, что МСК больных МДС имеют функциональные отличия от МСК, полученных у здоровых лиц [7-9, 63, 100, 137, 158]. В нашем исследовании показано, что МСК костного мозга больных МДС проявляли сниженную пролиферативную способность в культуре по сравнению с МСК, полученными в контрольной группе: конфлюэнтность менее 100%, увеличение времени формирования монослоя или его отсутствие, однако значимые различия в культурах МСК больных и здоровых лиц не получены. Выявлена обратная зависимость времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК от клеточности костного мозга. Клинический вариант МДС и наличие фиброза в костном мозге не влияли на темп роста культуры клеток.
Таким образом, рост МСК костного мозга больных был снижен в сравнении с контрольной группой здоровых доноров. На скорость формирования конфлюэнтного подслоя МСК влияла клеточность костного мозга и не влияли клинический вариант заболевания и наличие фиброза
Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге
У обоих пациентов с выявленной в клетках костного мозга и МСК инверсией хромосомы 9 ее конституциональный характер был подтвержден исследованием кариотипа культуры ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови.
В МСК, полученных от здоровых доноров костного мозга, хромосомные аномалии не выявлены.
Таким образом, клональные аномалии кариотипа МСК выявлены всего у одного больного: структурная перестройка с вовлечением хромосомы 2. Хромосомные нарушения МСК у этого больного были отличны от аномалий кариотипа кроветворных клеток костного мозга. 3.5.4. Цитогенетическое исследование МСК методом FISH
Исследование выполнено у 11 больных: 2 – МДС с del(5q), 3 – РЦМД, 2 – РАИБ-1, 2 – РАИБ-2 и 2 – ОМЛ. У всех этих больных в клетках костного мозга были выявлены хромосомные аномалии: у 5 больных – изолированные del(5q), моносомия 7 и inv(3), у 2 больных – сочетание 2 аномалий (моносомия 7 и трисомия X, del(5q) и del(7q)) и у 4 больных – комплексные нарушения кариотипа. Размер клонов, исследованных в клетках костного мозга с использованием соответствующих ДНК-зондов, составил 20-85%.
При стандартном цитогенетическом исследовании МСК у 9 из 11 больных определен нормальный кариотип (у 1 из них выявлена конституциональная инверсия хромосомы 9), у 1 больного – клональные аномалии кариотипа и у 1 больного исследование не выполнено вследствие отсутствия митозов. При FISH-анализе МСК были применены ДНК-зонды к выявленным в кроветворных клетках цитогенетическим маркерам. Ни в одном случае в МСК не были определены искомые хромосомные аномалии. Исключение составила пациентка 032, у которой в МСК было обнаружено 4% клеток с трисомией X. Как было указано выше, у данной пациентки в общей популяции клеток костного мозга выявлено 2 клона клеток – с моносомией 7 (в 23% ядер) и с трисомией Х (в 20% ядер); при исследовании CD34+ клеток-предшественниц клон с моносомией 7 определен в 26% ядер, а клон с трисомией Х отсутствовал; при исследовании ФГА-стимулированных лимфоцитов крови определен нормальный кариотип. Таким образом, учитывая отсутствие хромосомной аномалии (трисомии Х) в лимфоцитах периферической крови, ее конституциональный характер не был подтвержден. Оставалось неясным отсутствие клона с трисомией Х на уровне ранних кроветворных предшественниц, а также его наличие в культуре МСК. По всей видимости, у пациентки с моносомией 7 появление второго патологического клона (трисомии Х) произошло на уровне более зрелых клеток, на поверхности которых утрачен антиген CD34. В этом случае отсутствие трисомии Х в CD34+ клетках объяснимо. Вопрос о том, чем может быть обусловлен факт наличия трисомии Х в клетках стромы, оставался открытым, так как в литературе нам не встретились описания совпадения клональных нарушений в кроветворных и стромальных клетках при МДС [90, 129, 142]. Представляется возможным, что небольшой процент позитивных ядер (4%) в данном случае был обусловлен наличием примеси кроветворных клеток (макрофагов) в культуре МСК.
В нашем исследовании показано, что в МСК костного мозга не определяются хромосомные поломки, характерные для МДС. Это не противоречит данным литературы [129, 90]. Наряду с отсутствием специфических для кроветворных клеток аномалий, МСК проявляют генетическую нестабильность, выявляя другие аберрации [33, 34, 54, 55, 36, 100, 143]. В нашей работе в МСК у 2 (9,5%) из исследованных больных МДС выявлены структурные аномалии кариотипа (неклональная и клональная). Мы не наблюдали аномалии кариотипа МСК у больных в стадии трансформации в ОМЛ. В большинстве исследований описано преобладание потери генетического материала МСК (гипоплоидия, делеции, дериваты хромосом), тогда как методом сравнительной геномной гибридизации выявлено преимущественно увеличение генетического материала на различных хромосомах [100]. В нашем исследовании потери генетического материала МСК не были выявлены: у первого пациента определена неклональная (в одной метафазе) транслокация t(2;22), у второго – появление дополнительного участка на длинном плече хромосомы 2 (клональная аномалия).
В литературе есть свидетельства о появлении в культурах МСК у здоровых лиц хромосомных аберраций в процессе культивирования in vitro, которые проявляются как на ранних (1-5-й), так и на более поздних пассажах [1, 14]. Тогда как в работах других исследователей продемонстрирована генетическая стабильность МСК при довольно длительном культивировании [15, 28]. Нельзя полностью исключить, что выявленные нами аномалии кариотипа у 2 больных не являются результатом трансформации in vitro, так как мы не исследовали кариотип МСК у этих больных на других пассажах. У первого больного кариотип оценивался после трех пассажей, а у второго – после двух, таким образом, культуры клеток не подвергались длительному культивированию.
Несовпадение хромосомных аномалий в популяциях кроветворных и стромальных клеток свидетельствует о том, что МСК не являются частью опухолевого клона при МДС. Этот факт не вызывает сомнение, учитывая отсутствие общей клетки-предшественницы кроветворной и мезенхимальной клеточных линий. В то же время клетки стромы костного мозга проявляют функциональную неполноценность у больных МДС (снижение пролиферативной активности, нарушение пластичности, аномальная экспрессия поверхностных маркеров и др.). Следовательно, наличие хромосомных аберраций наряду с нарушением процессов клеточного деления и дифференцировки подтверждают функциональную патологию стромы при МДС, что может иметь важное значение в патогенезе заболевания.
