Эффективность кожного теста с аллергеном туберкулезным, содержащим рекомбинантный белок CFP10-ESAТ6, в диагностике, выявлении и определении активности туберкулезной инфекции. Слогоцкая, Людмила Владимировна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Слогоцкая, Людмила Владимировна. Эффективность кожного теста с аллергеном туберкулезным, содержащим рекомбинантный белок CFP10-ESAТ6, в диагностике, выявлении и определении активности туберкулезной инфекции. : диссертация ... доктора медицинских наук : 14.01.16 / Слогоцкая Людмила Владимировна; [Место защиты: ГУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН"].- Москва, 2012.- 210 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 13

1.1. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в мире 13

1.2. Туберкулинодиагностик а 14

1.2.1. Туберкулиновая кожная проба, туберкулиновые продукты и их стандартизация

1.2.2. Повышенная чувствительность замедленного типа (ПЧЗТ)

1.2.3. Чувствительность туберкулиновой кожной пробычастота положительных реакций у лиц с активным заболеванием и латентной туберкулезной инфекцией

1.2.3.1. Чувствительность туберкулиновой пробы (частота положительных реакций) у больных туберкулезом

1.2.3.2. Чувствительность туберкулиновой пробы (частота положительных реакций) при латентной туберкулезной инфекции

1.2.4. Специфичность туберкулиновых тестов (частота отрицательных реакций) у неинфицированных лиц

1.2.4.1. Сравнительные кожные пробы с различными сенситинами

1.2.4.2. Ложноотрицателъныереакции 28

1.2.5. Факторы, влияющие на результаты туберкулино- 29

вой кожной пробы

1.2.6. Повторные тесты. «Бустер-эффект» 33

1.2.7. Связь протективного иммунитета против туберкулеза с реакцией на туберкулиновую кожную пробу

1.2.7.1. Связь риска заболевания туберкулезом среди невакцинированных лиц с результатами туберкулиновых проб

1.2.7.2. Протективный иммунитет против реинфекции микобактериями туберкулеза

1.2.8. Чувствительность и специфичность туберкулиновой пробы у больных ВИЧ-инфекцией

1.3. Геном М. tuberculosis, специфичные антигены для диагнос- 38

тики туберкулёзной инфекции

1.3.1. Применение лабораторных тестов анализа 39 продукции IFN-y, использующих специфичные антигены М. tuberculosis

1.3.2. Влияние иммуносупрессии на результаты тестов 47 IGRA

1.4. Применение кожных тестов на основе новых антигенов для 47

выявления туберкулезной инфекции

ГЛАВА 2. Характеристика методов исследования и клинических наблюдений

2.1. Характеристика препарата ДИАСКИНТЕСТ (ДСТ) 52

2.2. Туберкулин (PPD-L) 54

2.3. Методы обследования 55

2.4. Состав и численность контингентов 61

ГЛАВА 3. Изучение безопасности кожной пробы препаратом диаскинтест (дст) в различных дозах в клинических исследованиях

3.1. Результаты испытания безопасности Диаскинтеста у здоро- 65 вых добровольцев

3.2. Изучение безопасности и чувствительности пробы с ДСТ у 70 взрослых, больных туберкулезом легких в сравнении с пробой Манту с 2 ТЕ PPD-L

3.3. Изучение безопасности пробы с ДСТ у взрослых, больных 77 туберкулёзом органов дыхания без рентгенологической динамики с сохранением бактериовыделения

3.4. Изучение безопасности и чувствительности пробы с ДСТ у 80 детей и подростков а) с локальными формами туберкулёза,

б) впервые инфицированных (вираж туберкулиновых реакций, в) получивших превентивную химиотерапию не менее

года назад по поводу инфицирования

ГЛАВА 4. Чувствительность и специфичность пробы с дст у взрослых, больных туберкулезом и нетуберкулезными заболеваниями лёгких

4.1. Больные активным туберкулёзом 93

4.2. Лица с сомнительной активностью туберкулезного процесса 99

4.3. Больные с неспецифическими заболеваниями легких 100

ГЛАВА 5. Чувствительность и специфичность пробы с дст при туберкулёзе и латентной туберкулёзной инфекции у детей и подростков, каналы выявления больных туберкулёзом

5.1. Дети и подростки, больные туберкулёзом органов дыхания. 104

5.2. Дети и подростки с виражом туберкулиновых реакций из семейного контакта с бактериовыделителями

5.3. Дети с виражом туберкулиновых реакций и неустановленным контактом

5.4. Дети и подростки с гиперергической реакцией на пробу Манту

5.5. Дети и подростки с усиливающейся туберкулиновой чувствительностью

5.6. Дети и подростки, длительно имевшие положительные 112

туберкулиновые реакции

5.7. Дети и подростки из семейного контакта с больными туберкулёзом без бактериовыделения

5.8. Подростки, наблюдаемые по контакту в учебном заведении с больными туберкулёзом-бактериовыделителями

5.9. Дети и подростки из контакта по учебному заведению с лицами больными туберкулёзом без бактериовыделения

5.10. Дети и подростки с нетуберкулёзными заболеваниями 121

5.11. Дети и подростки, вакцинированные (ревакцинированные) BCG

5.12. Дети и подростки, у которых после пробы с ДСТ диагностированы локальные формы туберкулёза

5.13. Результаты повторной постановки пробы с ДСТ у детей и подростков

ГЛАВА 6. Чувствительность пробы с дст у больных туберкулезом и вич-инфекцией

ГЛАВА 7. Чувствительность и специфичность пробы 153 с дст при вне легочной локализации туберкулеза

7.1. Больные с туберкулезными поражениями без ВИЧ-инфек- 153 ции

7.2. Больные с туберкулезными поражениями и ВИЧ-инфекцией 163

7.3. Больные с нетуберкулёзными заболеваниями внелегочных 166 локализаций

Заключение 168

Выводы 185

Практические рекомендации 188

Список литературы

Туберкулинодиагностик
Связь риска заболевания туберкулезом среди невакцинированных лиц с результатами туберкулиновых проб
Изучение безопасности и чувствительности пробы с ДСТ у 70 взрослых, больных туберкулезом легких в сравнении с пробой Манту с 2 ТЕ PPD-L
Дети и подростки с усиливающейся туберкулиновой чувствительностью

Введение к работе

Актуальность исследования

Туберкулез остается наиболее распространенной инфекцией, ежегодно поражающей свыше 9 миллионов человек и вызывающей около 1,8 миллионов смертей [WHO,2009]. В течение века во всем мире для диагностики туберкулеза и выявления скрытой туберкулезной инфекции используется туберкулин [von Pirquet C., 1907; Mantoux M., 1912]. Основным недостатком туберкулиновой пробы является большое число ложноположительных реакций, в связи с перекрестными реакциями антигенов PPD, содержащихся во многих видах микобактерий и в штаммах бациллы Кальметта-Герена (BCG) [Маркузон В.Д. 1958; Похитонова М.П., 1965; Farhat M. et al., 2006]. Ограниченная специфичность туберкулиновой кожной пробы особенно актуальна при широком использовании вакцинации BCG и при высоком содержании микобактерий в окружающей среде, т.е. для большинства стран с повышенной заболеваемостью туберкулезом [Menzies R., Vissandjee B., 1992; Wang L. et al., 2002].

Открытие антигенов, специфичных для Mycobacterium tuberculosis и отсутствующих в Mycobacterium bovis BCG и большинстве микобактерий окружающей среды, привело к разработке тестов in vitro, основанных на измерении продукции гамма-интерферона (ИНФ) (Interferon –Gamma Release Assays или IGRA), в ответ на стимуляцию этими антигенами [Andersen P. et al., 2000; Mazurek G. et al. 2007; . et al., 2009]. Гены, кодирующие эти белки, находятся в регионе RDI (region of difference) генома, отсутствующем в геноме Mycobacterium bovis BCG и большинства нетуберкулезных микобактерий [Cole S. et al., 1998; Behr M. et al., 1999]. Эти тесты показали высокую чувствительность и почти абсолютную специфичность [Pai M. et al., 2004; Menzies D. et al., 2007; Steingart К. et al., 2009; ., et al., 2009].

В течение последних лет исследования, связанные с продукцией ИНФ (IGRA), стали использоваться в различных клинико-эпидемиологических исследованиях для выявления заболевания туберкулезом или скрытой (так называемой латентной) туберкулезной инфекции, а также для замены или дополнения к туберкулиновой кожной пробе [Baker C. et al., 2009; van Zyl-Smit R. et al., 2009; Pai M. et al., 2010]. Распространению применения IGRA во многих странах препятствует недостаточное финансирование, необходимость лабораторного оборудования и квалифицированного персонала [Ewer K. et al., 2006; ., 2006; Dheda K. et al. 2009; et al., 2009; . et al., 2009].

Для проведения кожной пробы не требуется специального лабораторного оборудования, необходим только холодильник для хранения реактивов. Сведения об использовании специфических антигенов in vivo ограничены. Внутрикожные инъекции ESAT6 позволили достоверно выявить скот, инфицированный Mycobacterium bovis. С помощью рекомбинантного ESAT6 были установлены выраженные кожные реакции повышенной чувствительности замедленного типа у морских свинок, инфицированных M. tuberculosis, и отсутствие реакции у инфицированных Mycobacterium avium или вакцинированных BCG [Elhay M. et al., 1998; Weldingh K., Andersen P., 2008]. Недавно был получен рекомбинантный димер ESAT6, синтезированный в Lactococcus (rdESAT-6) [Wu X. et al., 2008]. В доклинических исследованиях на морских свинках, мышах, крысах и собаках внутрикожное или внутривенное введение одной или нескольких доз rdESAT6 животным с сохранным иммунитетом не привело к побочным реакциям.

Впервые в мире в России был получен препарат ДИАСКИНТЕСТ(ДСТ), представляющий собой рекомбинантный белок CFP10-ESAТ6, продуцируемый Escherichia coli BL21(DE3)/pCFP-ESAT [Киселев В.И.и соавт., 2008]. До того времени никто не использовал в кожных пробах 2 наиболее специфичных белка ESAT-6 и CFP-10, которые показали себя как наиболее приемлемые диагностические препараты в исследованиях IGRA.

Цель исследования

Определить эффективность кожной пробы с аллергеном туберкулёзным рекомбинантным, представляющим собой белок CFP10-ESAТ6 (ДИАСКИНТЕСТ), в диагностике туберкулезной инфекции и разработать показания к его применению

Задачи исследования

Определить безопасность применения препарата ДИАСКИНТЕСТ (ДСТ) в кожной пробе у здоровых добровольцев, больных туберкулезом и инфицированных микобактериями туберкулёза (взрослых и детей).
Определить чувствительность пробы с ДСТ у больных туберкулезом органов дыхания и внелегочных локализаций.
Определить чувствительность пробы с ДСТ у больных с сочетанием туберкулеза и ВИЧ-инфекции (взрослых).
Определить специфичность пробы с ДСТ у больных нетуберкулезными заболеваниями органов дыхания и внелегочной локализации.
Определить специфичность пробы с ДСТ у здоровых детей, вакцинированных BCG.
Определить частоту положительной реакции в разных группах лиц с латентной туберкулезной инфекцией (ЛТИ), оценить использование пробы с ДСТ в качестве маркёра активности и сравнить с пробой Манту.
Определить безопасность повторных проб с ДСТ и оценить динамику кожных реакций в процессе лечения больных туберкулезом органов дыхания и лиц с латентной туберкулёзной инфекцией.

Научная новизна исследования

Впервые в мировой практике доказана высокая эффективность кожной пробы с рекомбинантным белком CFP10-ESAТ6 (препарат ДИАСКИНТЕСТ) для выявления и диагностики туберкулёзной инфекции, обладающая высокой (почти 100%) специфичностью и высокой чувствительностью. Установлена её безопасность у здоровых добровольцев, больных туберкулёзом и лиц с латентной туберкулёзной инфекцией. Установлено, что повторные пробы с ДСТ не вызывают сенсибилизации на препарат, что позволяет использовать их в скрининговых ежегодных обследованиях для выявления туберкулеза.

Установлена высокая специфичность пробы с ДСТ: у детей, вакцинированных BCG – 100,0%, при нетуберкулёзных заболеваниях: лёгких – 94,6%, внелегочных локализациях – 98,5%; при неактивных посттуберкулёзных изменениях – 100,0%.

Определена чувствительность (частота положительных реакций) пробы с ДСТ у больных туберкулёзом: у детей и подростков, больных ТОД – 97,3%, у взрослых при туберкулёзе внелёгочных локализаций – 89,7%, у взрослых с туберкулезом органов дыхания – 84,2%. Установлено, что частота положительных реакций достоверно выше у нелеченных больных туберкулезом, по сравнению с лицами, закончившими химиотерапию.

Установлено, что частота положительных реакций на пробу с ДСТ в группах риска лиц с латентной туберкулёзной инфекцией соответствует степени риска развития заболевания: самая высокая частота (94,9%) у детей и подростков с виражом реакций на пробу Манту из семейного контакта с больным туберкулёзом – бактериовыделителем.

Установлено, что положительная реакция на пробу с ДСТ является маркером активности туберкулёзной инфекции как латентной, так и имеющей рентгенологические признаки болезни.

Показано, что динамика выраженности реакций на пробу с ДСТ позволяет судить о течении туберкулёзной инфекции как в сторону её прогрессирования, так и в сторону регрессии при положительных результатах лечения.

Установлена прямая зависимость между частотой положительных реакций на пробу с ДСТ и количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов у больных с сочетанием туберкулёза и ВИЧ-инфекции.

Практическая значимость

Доказана в широкой клинической практике возможность использования препарата ДИАСКИНТЕСТ в кожной пробе для диагностики активной туберкулезной инфекции.

Практическое здравоохранение получило принципиально новый, по сравнению с туберкулинодиагностикой, инструмент выявления активной туберкулёзной инфекции. Проба с ДСТ позволяет выявлять туберкулёз на ранних стадиях, дифференцировать поствакцинальную аллергию от туберкулёзной инфекции с высоким риском развития заболевания. Проба с ДСТ является маркером активной туберкулёзной инфекции и положительная реакция служит показанием для проведения превентивной химиотерапии. С её помощью появилась возможность проследить динамику туберкулёзного процесса с момента развития до потери активности. Проба позволяет провести дифференциальную диагностику туберкулёза и нетуберкулёзных заболеваний, поскольку обладает почти 100% специфичностью.

Положения, выносимые на защиту

Кожная проба с препаратом ДИАСКИНТЕСТ (ДСТ) (аллерген туберкулёзный рекомбинантный, содержащий белок CFP10-ESAТ6) представляет собой принципиально новый, по сравнению с туберкулиновыми пробами, тест, обладающий высокой (почти 100.0%) специфичностью, поскольку реагирует на белки, специфичные для Mycobacterium tuberculosis при метаболической активности последних.
Кожная проба с ДСТ может быть использована для скрининговых ежегодных обследований на туберкулёз, поскольку она безопасна, не вызывает необычных общих, неспецифических местных реакций, и повторные пробы не вызывают сенсибилизации на препарат. Она обладает высокой чувствительностью – у детей с впервые выявленным туберкулёзом положительные реакции отмечались в 97,3% случаев.
Кожная проба с ДСТ может быть использована для дифференциальной диагностики туберкулёза с неспецифическими заболеваниями, а также латентной туберкулёзной инфекции с поствакцинальной аллергией, поскольку обладает почти 100.0% специфичностью: частота отрицательных реакций у детей после вакцинации BCG составила 100.0%; при нетуберкулёзных заболеваниях лёгких у взрослых – 94,6%, у детей – 100.0%; при внелегочных нетуберкулёзных заболеваниях – 98,5%; у лиц, излеченных от внелегочных форм туберкулёза – 100,0%.
Кожная проба с ДСТ, в отличие от пробы Манту, является маркером активности туберкулёзной инфекции, и положительная реакция свидетельствует о наличии либо туберкулёза, либо латентной туберкулёзной инфекции (ЛТИ) с высоким риском развития заболевания, последнее является показанием для проведения превентивной химиотерапии.
Динамика реакций на пробу с ДСТ позволяет судить о развитии туберкулёзной инфекции. Уменьшение интенсивности реакций, вплоть до отрицательных значений, наблюдается при эффективной химиотерапии как активного туберкулёза, так и латентной туберкулёзной инфекции, появление положительных реакций свидетельствует о начавшемся развитии заболевания.
Кожная проба с ДСТ может быть использована для выявления и диагностики туберкулёза у больных ВИЧ-инфекцией – положительная реакция встречается достоверно чаще у больных с числом CD4⁺ Т-лимфоцитов более 200 в 1 мкл, чем у больных с наличием CD4⁺ менее 200 клеток: 55,3% и 22,0% соответственно.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертации отражены в следующих документах:

Инструкция по применению ДИАСКИНТЕСТ (Аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении) раствор для внутрикожного введения
Пособие для врачей «Кожная проба с препаратом ДИАСКИНТЕСТ (аллерген туберкулезный рекомбинантный 0,2 мкг в 0,1 мл раствор для внутрикожного введения) для идентификации туберкулезной инфекции» (составители Б.Л. Медников, Л.В. Слогоцкая).- М.- 2009.-32с.
Методические рекомендации Департамента здравоохранения города Москвы «Рекомендации по применению кожной пробы с препаратом аллерген туберкулезный рекомбинантный 0,2 мгк в 0,1 мл раствор для внутрикожного введения (ДИАСКИНТЕСТ) для идентификации туберкулезной инфекции у детей из диспансерного наблюдения в противотуберкулезных учреждениях» (составители Овсянкина Е.С., Слогоцкая Л.В., Губкина М.Ф.) // М.:МНПЦБТ. – 2010. – 29 с.
Приказ Минздравсоцразвития РФ №855 от 29 октября 2009 года «О внесении изменения в приложение №4 к приказу Минздрава России от 21 марта 2003 г. №109»
Приказ Департамента здравоохранения города Москвы №173 от 10.02.2010 «О внедрении кожного теста с аллергеном туберкулёзным рекомбинантным (препаратом Диаскинтест)»

Апробация диссертации

Апробация работы проведена на научной конференции совместного заседания Ученого совета, сотрудников клинических и научных отделов Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулёзом, сотрудников кафедры фтизиатрии ГОУ ДПО РМАПО.

Материалы диссертации изложены автором в 14 докладах на Российских съездах, конгрессах, научно-практических конференциях, 10 докладах на международных конгрессах: ХV1 Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» 2009 г.; XIX Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания, 2009 г.; IX съезде фтизиатров России, 2011 г., VII - XI Московских ассамблеях «Здоровье столицы» (2008-2011гг); II и III Ежегодном Всероссийском ежегодном конгрессе по инфекционным болезням (2010, 2011гг.); совещании «Туберкулез и ВИЧ-инфекция. Вопросы эпидемиологического надзора, организации, проведения и оценки эффективности противоэпидемических мероприятий» (2011 г.,); Всерос. научно-практ. конф. с межд. участием (2010 г., СПб); Всероссийской науч.-практ. конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом»(2011,СПб.); Научно-практической конференции с международным участием «Туберкулез у детей и подростков», 2009 г.; 5th Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (Dubrovnik, Groatia, 2009); European Respiratory Society Annual Congress (Vienna Austria, 2009; Amsterdam Netherlands, 2011- 3 доклада); 29th, 30-th EAACI Congress European Academy of Allergy and Clinical Immunology (London, UK, 2010; Istanbul,Turkey, 2011 - 2 доклада); 9th , 10th International Congress on Pediatric Pulmonology (Vienna, Austria, 2010;Versailles, 2011)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 86 работ, 24 из них в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками, 38 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Список литературы включает 390 источников отечественных и зарубежных авторов.

Туберкулинодиагностик

После открытия Mycobacterium tuberculosis в 1882 году немецкий микробиолог Роберт Кох выделил жидкость из фильтрата культуры Mycobacterium tuberculosis и использовал ее для лечения туберкулеза путем подкожных инъекций [Koch R., 1890]. Однако использование препарата, названного туберкулином, в диагностических целях было обнаружено Клеменсом Пирке [von Pirquet С, 1907], и в 1910 году Шарль Манту ввел в практику внутрикожный туберкулиновый тест [Mantoux М., 1912]. С помощью теста можно было определить, инфицирован ли пациент микобактерией туберкулеза.

Старый туберкулин Коха {Alttuberculinum Koch — альттуберкулин Коха, АТК) - представляет собой фильтрат 6-9-недельной культуры микобактерии туберкулеза на мясо-пептонном 5,0% глицериновом бульоне, простерилизованном текучим паром в течение 1 ч и сгущенном до /ю объема при температуре 90 [Koch R., 1890]. Такой туберкулин часто вызывал неспецифические реакции. После использования синтетической питательной среды специфичность препарата повысилась. В 1930-х годах Флоренс Зейберт (F.B. Seibert) разработала технику осаждения с использованием сульфата аммония для выделения протеинов из автоклавированных фильтратов культур микобактерии туберкулеза [Seibert F., 1934]. В результате получился новый тип туберкулина, известный как очищенный дериват протеина (PPD) и показавший лучшую воспроизводимость и специфичность, чем АТК. В 1939г. F.Seibert приготовила значительную партию PPD туберкулина, которая использовалась в качестве стандарта специфической активности. В дальнейшем эта серия была лиофильно высушена и предложена в качестве международного стандарта PPD; он был утвержден в 1952г. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), как международный стандарт сухого очищенного туберкулина, который применяется до настоящего времени. Несмотря на название «очищенный дериват протеина», в препарате присутствовали полисахариды, даже в современных продуктах PPD [Daniel Т., Anderson Р., 1978; Daniel Т. et al., 1982]. Термическая стерилизация коагулирует большинство протеинов культуры, оставляя относительной небольшие протеины с молекулярной массой около 10 kDa [Nagai S. et al., 1974; Daniel Т., Janicki В., 1978; Affronti L. et al., 1986; Affronti L. et al., 1986]. Такой размер протеинов объясняет, почему PPD не является иммуногенным, т.е. туберкулиновая проба не вызывает сенсибилизации к PPD при последующих тестах у лиц, не инфицированных микобактериями [Tukey J. etal., 1950; Daniel Т., 1980].

В зарубежных странах применяется в основном 2 вида туберкулинов, которые считаются эквивалентными - это 2 единицы PPD RT23 (Дания), и 5 единиц PPD-S (США). Сильные реакции наблюдаются чаще при введении 2 единиц PPD RT23, чем 5 единиц PPD-S [Munoz-Barret J. et al., 1996; Teixeira L. et al., 2000].

В нашей стране применяется сухой очищенный туберкулин, на основе полученного в 1939г. М.А.Линниковой- туберкулина PPD-L, представляющий собой фильтрат убитых нагреванием культур Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis [Линникова М.А., 1939].

Одним из способов стандартизации туберкулина PPD является наработка значительной партии порошка-полуфабриката туберкулина, что позволяет работать стандартным препаратом в течение длительного времени. Одной из форм стандартизации туберкулинов является промышленный выпуск очищенного туберкулина в стандартном разведении, то есть в готовой к применению форме, содержащей необходимое количество единиц в 0,1мл - в настоящее время в нашей стране - это 2 ТЕ [Яблокова Т.Б. и др., 1969; Леви Д.Т., 1987].

Повышенная чувствительность замедленного типа (ПЧЗТ) Туберкулиновые пробы основаны на определении туберкулиновой аллергии - повышенной чувствительности организма к туберкулину, возникшей вследствие заражения микобактериями туберкулеза или иммунизации вакциной BCG. Туберкулиновая аллергия является иммунологически специфичной и относится к аллергическим реакциям замедленного типа. Особенно ярко проявляется на коже в месте введения туберкулина. Впервые 24 ч после введения туберкулина развивается отек всех слоев кожи, а в более поздние сроки (через 72 ч) - мононуклеарная реакция с большим числом гистиоцитов. В связи с расширением капилляров, пропотеванием тканевой жидкости, скоплением нейтрофилов и моноцитов образуется инфильтрат (папула). При гиперергических реакциях на туберкулин с выраженным некрозом в месте его введения обнаруживают элементы специфического воспаления с эпителиоидными бугорками.

Вещества, входящие в состав внешней оболочки МБТ, индуцируют специфическую тканевую воспалительную реакцию макроорганизма и образование гранулемы. Одновременно появляется повышенная чувствительность замедленного типа (ПЧЗТ), определяемая по реакции на туберкулиновые пробы, и слабое антителообразование [Авербах М.М. и др., 1974; Литвинов В.И., 1974; Литвинов В.И. и др., 1976].

У зараженных туберкулезом лиц наряду с местной могут наблюдаться очаговая (экссудативно-пролиферативные изменения вокруг очага специфического воспаления) и общая (лихорадка, артралгия, изменение содержания в крови лейкоцитов, белков и др.) реакции. Они наиболее выра 17 жены при подкожном введении туберкулина [Маркузон В.Д., 1934, 1958; Похитонова М.П., 1947; Соркина Э.З., 1960; Мирзоян Э.З., 1970]. Медовиков П.С. (1926) описывает соотношение общей и местной реакции следующим образом: при тяжелых случаях туберкулёза - сильная общая реакция и слабая местная; при благоприятном течении - умеренная общая, более сильная местная; при неактивных процессах общая реакция незначительная, а местная - может быть сильной.

После столкновения антигена с Т-клетками следует быстрая пролиферация и превращение их в клетки-эффекторы [von Andrian U., Mackay С, 2000], которые затем мигрируют к инфицированному участку. Активация Т-клеток в лимфатических узлах обычно происходит в период 3-8 недель после инфицирования. Активированные Т-клетки являются ядром специфического клеточного иммунитета, который, в конечном счете, может ограничить размножение микобактерий и распространение инфекции. Одновременно развиваются кожные реакции замедленного типа на антигены туберкулеза, что показывают положительные кожные тесты [Авербах М.М. и др., 1974; Литвинов В.И., 1974; Авербах М.М. и др., 1976; Литвинов В.И. и др., 1976; Vukmanovic-Stejic М. et al., 2006].

Взгляды на роль ПЧЗТ в устойчивости к заболеванию расходятся. ПЧЗТ - это ответ ТЫ-клеток с вовлечением цитотоксических механизмов, ведущий к ликвидации инфицированных макрофагов [Dannenberg А., 2001]. Неблагоприятный эффект ПЧЗТ в легких наблюдается при большом количестве микобактерий туберкулеза [Dannenberg А., 1989]. Когда внутри макрофагов скапливается много микобактерий, цитотоксический ответ убивает не только инфицированные макрофаги, но и часть окружающей его ткани, формируя, таким образом, казеозный центр гранулемы. Когда микобактерий покидают край казеозного поражения, они поглощаются соседними макрофагами.

Связь риска заболевания туберкулезом среди невакцинированных лиц с результатами туберкулиновых проб

После установления диагноза активного туберкулеза на каждого больного было заполнено извещение (форма № 089 Т/У-2003).

Определение наличия микобактерий проводилось в МНПЦБТ с использованием 3-х питательных сред - плотной яичной Левенштейна-Иенсена, модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (М7Н9) в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 и агаровой Миддлбрука 7Н11 (М7Н11).

Наряду с культуральным, проводилось молекулярно-генетическое исследование клинического материала с помощью биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП».

Все выделенные в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 культуры подвергали микроскопии на наличие кислотоустойчивых микобактерий и корд-фактора «кос». По характеру осадка и результатам микроскопии проводили предварительную дифференциацию МБТ от нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ). Изоляты, содержащие постороннюю микрофлору и более одного вида микобактерий, субкульти-вировали на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11 с целью получения чистой культуры. Окончательное установление вида выделенной культуры микобактерий проводили с помощью тест-системы БИОЧИП «IMS», высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и биохимическими тестами.

БИОЧИП «IMS» предназначен для идентификации микобактерий видов: М. avium, М. intracellulare, М. scrofulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, М. fortuitum, М. chelonae и дифференциации их от М. tuberculosis complex. Метод ВЭЖХ основан на анализе различий в составе миколовых кислот клеточной стенки разных видов микобактерий. Определение лекарственной чувствительности НТМБ к химиопрепаратам проводилось с помощью тест- системы SENSITITRE. Определение лекарственной чувствительности МБТ к основным противотуберкулёзным препаратам проводилось в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960, а штаммов МБТ, устойчивых к основным противотуберкулёзным препаратам, на среде Левенштейна-Йенсена - к резервным препаратам (включая фторхинолоны).

Наряду с культуральным, проводилось молекулярно-генетическое исследование клинического материала с помощью биологических микрочипов: «ТБ-БИОЧИП» для выявления мутаций, обуславливающих множественную лекарственную устойчивость, и «ТБ-БИОЧИП-2» для выявления мутаций, обуславливающих устойчивость к фторхинолонам.

Лечение туберкулёза проводилось также согласно приказу №109 МЗ РФ от 21.03.2003 г. в условиях специализированного противотуберкулёзного стационара.

Диагноз ВИЧ-инфекции установлен на основании всего комплекса клинико-лабораторных данных, все больные консультированы в Московском городском Центе СПИД 2-й инфекционной больницы.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции осуществлялась путем обнаружения антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа с последующим подтверждением специфичности в реакции иммунного блоттинга. Анализ абсолютного и относительного количества CD4-лимфоцитов осуществлялся с использованием моноклональных антител методом проточной цитофлюорометрии. Уровень вирусной нагрузки (содержание РНК-копий ВИЧ в мл плазмы крови) определялось количественным методом ПЦР.

У всех больных туберкулёзом внелегочных локализаций диагноз туберкулёза был верифицирован при цитологическом и гистологическом исследовании, в ряде случаев и бактериологически; нетуберкулёзные заболевания также верифицированы на основании всего комплекса исследований, необходимых для данной патологии. Клинические исследования проведены в соответствии с Национальным стандартом РФ «Надлежащая клиническая практика» (ГОСТ р52 379-2005), Санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» (утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31 октября 1996 г. № 33).

В соответствии с этими документами нами были составлены протоколы клинических исследований, брошюры исследователя, информированное согласие пациентов (взрослых и подростков) и родителей детей и подростков, «Индивидуальная регистрационная карта», заполняемая на каждого пациента.

Разрешение на проведение клинических исследований получены от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития; Комитета по этике при Федеральном органе контроля качества лекарственных средств; Комитета по медицинской этике при Национальном органе контроля Федерального государственного учреждения науки государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича; Комитета медицинских иммунобиологических препаратов; Этического комитета МНПЦБТ.

Исследования начинались с 2 последовательных групп по 5 человек - здоровых добровольцев, первоначально с половинной дозы (0,1 мкг), затем - полной (0,2 мкг). После этого клинические исследования были проведены у взрослых больных туберкулезом органов дыхания, первая группа - с выраженной положительной динамикой процесса (рентгенологической и прекращением бактериовыделения), вторая - с активным туберкулезом органов дыхания с сохраняющимся бактериовыделением.

Дети и подростки обследованы только после получения результатов об отсутствии нежелательных побочных реакций у взрослых. Все взрослые испытуемые подписали информированное согласие на участие в исследовании, а за детей - их родители, подростки и их родители подписывали одновременно.

Отбор обследуемых проводился по протоколу исследования, согласно критериям включения и исключения.

При получении «Информированного согласия» на включение в исследование по изучению безопасности ДСТ добровольцы были госпитализированы в стационар Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом, где им были выделены отдельные палаты, и во избежание контакта с больными туберкулезом, обеспечено питание в палате.

На всех пациентов велась история болезни, параллельно заполнялась «Индивидуальная регистрационная карта». Все пациенты были осмотрены врачом, собран анамнез жизни, аллергологический анамнез, описан соматический статус, данные рентгенологического исследования (табл. 2).

Изучение безопасности и чувствительности пробы с ДСТ у 70 взрослых, больных туберкулезом легких в сравнении с пробой Манту с 2 ТЕ PPD-L

Таким образом, проведенное исследование показало, что чем больше сроки лечения, тем реже частота положительных реакций.

Однако у контингента больных, которые находились на лечении в стационаре длительно - более 100 дней по причине недостаточно эффективной терапии из-за плохой переносимости противотуберкулезных препаратов или распространенных осложненных форм (казеозная пневмония, диссеминированный, цирротический туберкулез и др.) трудно ожидать быстрого снижения частоты положительных реакций или уменьшения интенсивности реакций на пробу с ДСТ.

Хорошо известно по литературным данным, что начало заболевания часто сопровождается угнетением иммунитета и может проявляться в отрицательных кожных пробах. Этим фактом можно объяснить достаточно высокую частоту отрицательных результатов пробы с ДСТ в группе с коротким периодом лечения (до 30 дней).

Отрицательные реакции на пробу с ДСТ среди лиц, лечившихся менее 30 дней, обнаружены у 39 человек (частота ложноотрщательных результатов - 15,8%, 95%ДИ 11,2-20,3%). В данной группе больных отмечались распространенные процессы: диссеминированный - 9, фиброзно-кавернозный - 2, цирротический - 1, инфильтративный - 23, плеврит - 1, множественные туберкулемы - 1.

У больных активным туберкулезом легких отмечена зависимость частоты положительных реакций от сроков лечения и динамики туберкулезного процесса. Подтвердить данное положение стало возможным при проведении повторных проб у одних и тех же больных.

Повторные пробы проведены у 72 взрослых больным туберкулезом органов дыхания, после 3 месяцев лечения. Результаты реакций изменились следующим образом (табл. 21, рис. 9).

У этих больных были следующие клинические формы туберкулёза: 1 - казеозная пневмония, 2 - диссеминированные процессы без распада, (1 -с бактериовыделением), 28 - инфильтративный, в том числе 21 - с распадом, и 24 - с бактериовыделением, 2-е множественными туберку-лемами (у 1 бактериовыделение), по одному больному с очаговым туберкулезом, плевритом, двусторонним туберкулёзом ВГЛУ (с бронхоноду-лярным свищем и бактериовыделением), фиброзно-кавернозным и цирро-тическим туберкулезом.

Увеличение реакции наблюдалось у 8 из 72 больных - от 4 до 10 мм, в среднем с 13,0±2,0 мм до 20,0±2,1 мм (у одного больного произошла конверсия реакции из отрицательной в положительную - папула составила 10 мм). При этом у 6 из 8 пациентов отмечались распространенные инфильтративные процессы с распадом легочной ткани и бактериовыделением, у одного пациента - туберкулез внутригрудных лимфатических узлов с бронхолегочным компонентом и бактериовыделением, и у 1-го пациента - множественные туберкулемы с распадом. Трое больных страдали сопутствующим хроническим вирусным гепатитом С, что препятствовало полноценному лечению, вследствие развития побочных реакций на противотуберкулезные препараты.

Неизменно отрицательными оставались реакции при первой и повторной пробе у 6 (8,3%) из 72 больных. У 4 из 6 больных были тяжелые распространенные процессы с распадом и бактериовыделением (два с диссеминированным туберкулёзом, два - с инфильтративным). Ещё у двух пациентов активность процесса была минимальной или сомнительной (бактериовыделения не было, у одного выявлен очаговый туберкулез, у другого - туберкулема, процессы ограниченные, без рентгенологической динамики).

Неизменно положительными оставались реакции у 26 (36,1%) из 72 больных. При первой и второй пробе папула в среднем составила 14,9 ±1,03 мм. У 7 из 26 пациентов наблюдалось бактериовыделение: на фоне диссеминированного процесса (1 пациент), туберкулёза ВГЛУ с бронхо-легочным компонентом (1 пациент), инфильтративного туберкулеза (6 пациентов).

Таким образом, за 3 месяца лечения динамика в сторону уменьшения интенсивности реакции при постановке пробы с ДСТ и/или ее реверсии из положительной в отрицательную произошла у 44,4% (32 из 72) пациентов (95% ДИ 33-56%). В то же время, очевидно, что 3 месяца лечения -недостаточный срок и требуется длительное наблюдение для того, чтобы получить реверсию положительной реакции в отрицательную.

Таких больных было 37 - все они поступили в стационар с диагнозом очаговый туберкулез «сомнительной активности». Среди них с отрицательной реакцией на пробу с ДСТ было 32 (86,5%) пациента, с положительной - 5 (13,5%).

В процессе наблюдения диагноз активного очагового туберкулеза без бактериовыделения был установлен у 8 больных, у 29 -посттуберкулезные изменения. У 5 из 8 больных с рентгенологически подтвержденным активным очаговым туберкулезом, отмечена положительная реакция на пробу с ДСТ, средний размер папулы составил 15,2±6,8, в последующем отмечена положительная рентгенологическая динамика. У 29 человек пробная терапия не привела к рентгенологической динамике, отсутствовало бактериовыделение, определяемое методом посева, а изменения на рентгенограмме были признаны неактивными. У всех была отрицательная реакция на ДСТ.

Очевидно, что при наличии очаговых изменений в случаях, когда активность процесса сомнительная, проба с ДСТ может служить дополнительным фактором для решения вопроса об активности процесса. При этом следует учитывать, что отрицательные реакции возможны и при активном процессе, а положительные реакции - только при активном. Таким образом, при неактивных посттуберкулезных изменениях очагового характера специфичность пробы с ДСТ составила 100,0% (95% ДИ 99,7%).

Дети и подростки с усиливающейся туберкулиновой чувствительностью

Реакция на пробу Манту была положительной у всех 200 детей этой подгруппы. Средний размер папулы на пробу с ДСТ составил 17,7±8,4 мм, на пробу Манту - 13,9±4,7 мм. Средний возраст больных составил 11,5±3,56лет.

45 человек (средний возраст 11,5±3,58 закончили полный курс химиотерапии (подгруппа 1Б). У 27 (60,0%) из них наблюдалась положительная реакция на пробу с ДСТ {95% ДИ 42,8-83,8%). У них при выявлении были распространённые и осложнённые формы туберкулёза органов дыхания (эмпиема плевры, диссеминированный, инфильтративный с распадом и обсеменением и др.), в том числе, четверо были подвергнуты резекционным оперативным вмешательствам.

У 18 (40,0%) детей была отрицательная реакция на пробу с ДСТ -все они излечены от туберкулёза внутригрудных лимфатических узлов, находились под наблюдением более 18 месяцев от начала лечения, и получили курс противорецидивной терапии. Они длительное время (более года) получали лечение в условиях стационара детского реабилитационного отделения и были разобщены с родственниками, больными туберкулёзом. Реакция на пробу Манту после завершения лечения стала отрицательной лишь у одного ребенка из 1Б подгруппы.

Средний размер папулы у лиц 1Б группы с положительными реакциями составил: на пробу с ДСТ 16,0±4,36 мм, на пробу Манту 14,8±4,7 мм.

Обследовано 74 человека. 39 пациентов этой группы не получали превентивную химиотерапию (2А группа), у 37 (94,9%) из них реакция на пробу с ДСТ была положительной {95% ДИ 87,9-100,0%). Среди получивших превентивную терапию (2Б группа) - только у 12 (34,3%) из 35 человек {95% ДИ 18,5-50,0%) была положительная реакция. При этом все лица с отрицательными реакциями на пробу с ДСТ, получавшие превентивную терапию, были изолированы от родителей и находились в санатории или реабилитационном отделении МНПЦБТ. Отрицательная реакция на пробу Манту отмечена только у одного пациента в этой подгруппе (после лечения). Средний размер папулы на пробу с ДСТ 2А подгруппы был 15,9±4,6 мм, 2Б - 14,2±7,5 мм, на пробу Манту соответственно 15,2±3,7 и 12,8±4,26 мм. Средний возраст составил соответственно: 10,8±3,71 и 9,97±4,53 лет.

Обследовано 325 человек. Эти дети также были разделены на подгруппы - 294 человек не получали превентивную терапию (ЗА подгруппа), получал в амбулаторных условиях - 31 (ЗБ подгруппа). Из тех, кто не получал терапию, в 25 (8,5%) случаях реакция на пробу с ДСТ была положительной (95% ДИ 5,3-11,7%), из тех, кто её получал, только у 3 (9,7%) была положительная реакция (95% ДИ 0-20,1%). В то же время реакция на пробу Манту у всех была положительной.

Средний размер папулы на пробу с ДСТ составил: в ЗА подгруппе 10,0±6,28 мм и у троих детей из ЗБ подгруппы - 4,10,14 мм. Средний размер папулы на пробу Манту у детей в этих подгруппах был соответственно 10,5±3,12 и 10,4±3,84 мм.

Возраст детей в ЗА и ЗБ подгруппах составил соответственно 7,89±3,94и9,1±3,5лет. Обследовано 153 человека. Из 106 детей и подростков, не получавших превентивной терапии (4А подгруппа), у 51 (48,1%) реакция на пробу с ДСТ была положительной (95% ДИ 42,6-62,5%), а из 47 детей (4Б подгруппа), получивших превентивную терапию, у 21 (44,7%) была положительная реакция (95% ДИ30,4-58,9%). Реакция на пробу Манту у всех лиц обеих подгрупп была положительной, в том числе после лечения.

Средний размер папулы на пробу с ДСТ составил в 4А подгруппе 14,2±7,23 мм, в 4Б - 11,1 мм, на пробу Манту соответственно 17,6±4,19 и 16,7±3,65 мм. Возраст детей в 4А и 4Б подгруппах составил соответственно 10,1±4,21 и 10,4±4,46лет.

Обследовано 184 человека. Из них 165 - не получали превентивную терапию (5А подгруппа), 19 - получали (5Б подгруппа). Из 165, не получавших терапию, у 25 (15,1%) реакция на пробу с ДСТ была положительной (95% ДИ 9,6-20,5%), а из 19, получивших терапию у 2 (10,5%) была положительная реакция (95% ДИ 0-24,4%).

Средний размер папулы на пробу с ДСТ составил в 5А и 5Б подгруппах соответственно 10,1 (7,4) и у двоих - 11 и 22 мм. Реакция на пробу Манту у всех, в том числе получавших лечение, была положительной, и средний размер её составил 13,3±2,36 и 13,5±2,6 мм соответственно.

Возраст детей в 5А и 5Б подгруппах составлял соответственно 8,24±4,46 и 9,26±4,87 лет. Обследовано 342 человека. Эту группу составили лица, у которых в течение более 3 лет сохранялись «монотонно» положительные реакции на пробу Манту. Из них 309 человек не получали превентивного лечения (6А подгруппа), а 33 - получали (6Б подгруппа). Среди 309 человек, не получавших терапию, только у 8 (2,6%) была положительная реакция на пробу с ДСТ (95% ДИ 0,8-4,4%), а среди получавших - реакция у всех была отрицательной (100% 95%ДИ 95,9-100,0%). Средний размер папулы на пробу с ДСТ был в 6А группе 10,1±8,3 мм.