Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Роль гонадотропных гормонов в нейрогуморальной регуляции функции воспроизводства у сельскохозяйственных животных 7
1.2. Гонадотропин сыворотки жеребых кобыл 13
1.2.1. Химический состав 15
1.2.2. Биологические свойства 17
1.3. Методы определения гонадотропина СЖК в биологических жидкостях и их сравнительная оценка 20
1.3.1. Общие принципы метода тИФА 24
1.3.1.1. Определение антител 24
1.3.1.2. Определение антигенов 26
1.4. Значение сывороточного гонадотропина в период ранней жеребости у кобыл 28
1.5. Опыт применения препаратов на основе ГСЖК в животноводстве и ветеринарии 32
1.5.1. Применение ГСЖК для повышения мясной продуктивности 33
1.5.2. Гормональное воздействие и получение дополнительного приплода 35
1.5.3. Применение препаратов ГСЖК с целью синхронизации охоты и преодоления некоторых функциональных расстройств репродуктивной системы самок 36
2. Материал и методы исследований 39
2.1. Условия проведения опыта 39
2.2. Краткая характеристика лошадей башкирской породы 40
2.3. Условия содержания кобыл - продуцентов 41
2.4. Организация и проведение случной компании 45
2.5. Взятие крови от кобыл - продуцентов ГСЖК 47
Исследование крови . 48
Определение гонадотропной активности СЖК при помощи иммуноферментного анализа 48
Определение гонадотропной активности СЖК с помощью биологической пробы на крысах 51
Результаты собственных исследований 53
Синхронизация охоты кобыл 53
Влияние генотипа жеребца на биологическую активность гонадотропина сыворотки жеребых кобыл 54
Влияние сезона случки на активность сывороточного гонадотропина и период использования кобыл в качестве продуцентов ГСЖК 56
Изучение активности гонадотропина сыворотки крови у кобыл разного возраста 57
Изучение активности гонадотропина сыворотки крови в зависимости от массы тела животных 60
Уровень гонадотропного гормона в сыворотке крови кобыл на различных стадиях жеребости 62
Изучение гематологических показателей кобыл - продуцентов ГСЖК в период эксплуатации 65
Применение сурфагона с целью повышения активности гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл 68
Экономическая эффективность повышения гонадотропной активности СЖК 69
Обсуждение результатов исследований 70
Выводы 78
Практические предложения 80
Список литературы 81
- Методы определения гонадотропина СЖК в биологических жидкостях и их сравнительная оценка
- Применение препаратов ГСЖК с целью синхронизации охоты и преодоления некоторых функциональных расстройств репродуктивной системы самок
- Изучение активности гонадотропина сыворотки крови у кобыл разного возраста
- Изучение гематологических показателей кобыл - продуцентов ГСЖК в период эксплуатации
Введение к работе
Актуальность темы. За последнее десятилетие в силу неблагоприятно сложившихся экономических условий производства в сельском хозяйстве, в нашей стране произошло значительное снижение численности поголовья в различных отраслях животноводства, что неблагоприятно отразилось на количестве выпускаемой продукции. Так по данным ЦСУ (на апрель 2004 г.) в последние три года ежегодно поголовье крупного рогатого скота сокращается на 500 - 700 тыс., свиней на 1млн голов. В данных обстоятельствах выход, наряду с повышением сохранности поголовья, следует искать в совершенствовании методов регуляции репродуктивной функции животных. Одним из них является использование гормональных препаратов на основе гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (СЖК), который эффективно применяют с целью повышения многоплодия в овцеводстве, свиноводстве, звероводстве, мясном скотоводстве, а также с целью синхронизации охоты и борьбы с некоторыми видами функционального бесплодия у самок сельскохозяйственных животных. (М.И.Прокофьев, 1979; В.К.Копытин,1986;В.Е.Даровских,1990; A.M. Чомаев, Ю.Д. Клинский, 2004). Препарат СЖК содержит гонадотропный гормон, который при введении животному стимулирует функцию половых желез, вызывает развитие дополнительных фолликулов при полноценном половом цикле и регулирует его фазы при некоторых формах бесплодия.
Заготовка сыворотки жеребых кобыл осуществляется в период с 40-45 по 90-100 день жеребости, когда в ней содержится максимальное количество гонадотропных гормонов. Однако, вследствие не совершенных методов определения гонадотропной активности, а также достоверно не изученных факторов прямо или косвенно влияющих на активность гонадотропина сыворотки, вопрос рационального использования животных реципиентов, улучшения качества, а также увеличения производства СЖК остается открытым, что в конечном итоге снижает экономическую эффективность
использования препаратов изготовленных на основе СЖК. Все это требует более детального изучения причин влияющих на гонадотропную активность СЖК, а также совершенствования старых и разработки новых методов определения гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл.
Цель и задачи исследований. Учитывая вышеизложенное, мы поставили перед собой цель - изучение факторов влияющих на биологическое качество получаемой СЖК и дальнейшее совершенствование технологии производства гонадотропного гормона.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить гонадотропную активность сыворотки крови жеребых кобыл в зависимости от индивидуальных особенностей продуцентов.
2.Изучить влияние условий содержания продуцентов на биологическое качество СЖК.
3.Определить оптимальные параметры эксплуатации кобыл-доноров.
4.Изыскать наиболее оптимальные и экономически целесообразные методы определения гонадотропной активности СЖК.
5.Провести анализ полученных данных и сформулировать выводы и практические предложения.
Научная новизна исследований. Впервые в качестве продуцентов ГСЖК использованы кобылки двухлетнего возраста. С целью преодоления сезонной гипофункции яичников у кобыл охота синхронизировалась с использованием гонадотропин содержащих препаратов. Для массовой заготовки СЖК в производственных условиях предложен и внедрен метод иммуноферментной диагностики активности гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл, а также проведена его сравнительная оценка с биологическим методом определения активности СЖК. Дано технологическое обоснование выбора наиболее приемлемых продуцентов гонадотропина в условиях республики Башкортостан.
Практическая значимость работы. В условиях производства СЖК внедрен метод определения гонадотропной активности с наименьшими экономическими затратами и наибольшей достоверностью, что позволяет значительно повысить качество производимого гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл.
Апробация работы. Результаты исследований доложены и одобрены на ученых советах Всероссийского государственного НИИ животноводства (2005 - 2006); на объединенной конференции отдела эндокринологии, селекции молочного скота, лабораторий генетики животных и биохимии (2006). Материалы диссертации были представлены на III Международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», Дубровицы (2005).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах компьютерной верстки, содержит 11 таблиц, 1 схему, 1 гистограмму, 2 графика. Структурно включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 183 источника, из них 133 иностранных.
Положения, выносимые на защиту:
- оценка и диагностика гонадотропина сыворотки крови жеребых
кобыл;
- изучение влияния различных факторов на биологическую активность
гонадотропина сыворотки жеребых кобыл.
Методы определения гонадотропина СЖК в биологических жидкостях и их сравнительная оценка
С целью заготовки сырья для производства препаратов на основе гонадотропинов сыворотки жеребых кобыл и дальнейшей биотехнологической переработки в животноводстве используются различные методы диагностики ранней жеребости у кобыл. Наиболее распространенным и часто используемым методом диагностики ранней жеребости является постановка биопробы на различных лабораторных животных (Лоде З.О., 1967; Резников А.Г., 1980; Самсонова В.М.,1960; Шаталов П.И., Желев В.З., 1975; Клинский Ю.Д., 1984; Клинский Ю.Д., Чомаев А.М., 2004; Allen W., 1969). Так, например, значительное распространение получила проба на самцах озерной лягушки. Свежую неконсервированную сыворотку крови жеребой кобылы в количестве 1,5-2 мл вводят в спинное лимфатическое пространство (под кожу спины) самцам озерной лягушки (отличаются от самок мозолями на пальцах передних конечностей и голосовыми мешками-резонаторами). Перед постановкой реакции проверяют, чтобы в их моче не было спермиев. Для этого самца обертывают влажной марлей, в клоаку на глубину 0,5 см вводят пастеровскую пипетку и берут каплю мочи. Затем наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают в микроскоп при малом увеличении. Лягушек с инъецированной сывороткой помещают без воды в стеклянную емкость на 2-4 часа, после чего берут мочу и исследуют под микроскопом. Гонадотропин вызывает появление спермиев в моче самцов озерной лягушки, поэтому реакцию считают положительной при наличии спермиев у двух из трех используемых в опыте самцов, отрицательной при отсутствии спермиев, сомнительной при наличии положительной реакции у одного самца из трех. В этом случае реакцию переставляют (Шаталов П.И., 1975).При этом стоит отметить, что положительная реакция на самцах озерной лягушки в случае наличия гонадотропина фиксируется в мае-августе, в остальной период она отрицательна.
Гонадотропин сыворотки жеребых кобыл можно также определять на петушках в возрасте 30-70 дней с хорошо развитыми листовидными гребешками, массой тела 300-500 г. Перед опытом линейкой измеряют длину и высоту гребешка. Длину измеряют от начала восковицы ноздрей до наиболее откинутого назад гребня, высоту - от основания над глазом до вершины наиболее высокого зубца. В зависимости от исходной гормональной активности СЖК, уже на следующий день после первой инъекции могут быть заметны рост и покраснение гребешка. Окончательное решение принимается после контрольных измерений длины и высоты гребешка на 4-5 день после начала опыта. Если длина и высота гребешка увеличилась в сумме более чем на 6 мм, реакция на гонадотропин считается положительной (Лоде З.О., 1967).
Получившим наибольшее распространение определение ГСЖК является мышинно - маточный тест. Гонадотропин определяют на самках белых мышей массой 6-8 г в возрасте 21-28 дней. Активность сыворотки измеряют в мышиных единицах (м.ед.), т.е. минимальное количество гонадотропного гормона, содержащегося в СЖК, способное вызвать у 50% неполовозрелых самок мышей 3-кратное увеличение матки и раскрытие влагалища. В целях сравнимости и унификации оценки сравнимости ГСЖК была введена система стандартов ВОЗ: международная единица или интернациональная Ш=0,003569 мг чистого гонадотропина, равная 2,33-2,43 м.е., и национальные стандарты различных стран.
Существуют две модификации теста, которые различаются по количеству инъекций: первая предусматривает одну инъекцию 0,2 мл препарата СЖК в физиологическом растворе, вторая предусматривает 3-5-кратное применение 1 мл СЖК в физиологическом растворе. Для постановки реакции сыворотка разводится в 80 раз и выше. В опыте используют 5 мышей, которым инъецируют нативную СЖК в область спины. Продолжительность первой модификации -76 часов, второй-100 часов. Мышей усыпляют хлороформом и вскрывают, выделяя матку и яичники. Эффективность реакции оценивают по массе матки. Наименьшим считается увеличение до 30-35 мг (+), высоким - свыше 60мг (+++).При его постановке очень важно учитывать правильный подбор мышей, т.е. они должны быть здоровы и иметь нормальную упитанность, иначе даже при хорошей гормональной активности пониженная реактивность их организма даст ложную картину (Клинский Ю.Д., 1984).
Концентрацию гонадотропина в сыворотке крови можно определять как биологическим, так и иммунологическим методом. Первыми разработали и выполнили иммунологическую пробу количественного определения ГСЖК в 1963 году М. Wide и L. Wide. Она основывалась на принципе торможения гемагглютинации в присутствии этого гонадотропина. Сыворотка крови кобыл после 40-го дня беременности тормозит реакцию агглютинации обработанных формалином эритроцитов баранов в присутствии антисыворотки к гонадотропину СЖК, тогда как сыворотка не жеребой кобылы не тормозит эту реакцию.
В дальнейшем бараньи эритроциты были заменены Szezesny Т. (1974) на биологически нейтральные частицы с использованием суспензии латекса. Латекс-тест позволял определять жеребость к 40 дню покрытия.
R. De Coster и F. Estors (1979) описали метод определения жеребости по агглютинации частиц латекса, основанного на обнаружении ГСЖК, продуцируемого клетками трофобласта. По их данным, гонадотропин определялся в крови кобыл с 40 по ПО день жеребости агглютинацией частиц латекса, предварительно сенсибилизированных антисывороткой к ГСЖК.
Наряду с обычными иммунологическими методами определения уровня ГСЖК в крови жеребых кобыл получили радиоиммунологические методы, в частности радиорецепторный. Благодаря возможности определять метку, которой является изотоп, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Иалоу и С. Берсон в 1977г. были удостоены Нобелевской премии, однако наряду с несомненными достоинствами имеет и ряд недостатков, к которым можно отнести ограниченный срок радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов; относительно дорогое оборудование для регистрации радиоактивности, а также возможность заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов (Егоров A.M. и др.,1991).Эти и другие трудности явились основной причиной для дальнейшего поиска методов, альтернативных РИА, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и относительную простоту исполнения.
Принципиальные основы иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения антигенов и антител разработаны в 70-х годах. (Engvall Е., Perlmann Р., 1971; Van Weemen В.К. and Shuurs А., 1971). Благодаря этим исследованиям появилась возможность определения широкого класса веществ: онкомаркеров, лекарственных препаратов, бактерий, вирусов, иммуноглобулинов, идентификация лимфоцитов (субпопуляций), гормонов, в том числе и гонадотропинов.
Применение препаратов ГСЖК с целью синхронизации охоты и преодоления некоторых функциональных расстройств репродуктивной системы самок
Многоплодие животных зависит от числа яйцеклеток, оплодотворенных за один половой цикл, и является наследственно обусловленным фактором. Так, крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих, поэтому можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время как в яичнике находятся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), представляющих огромный генетический потенциал.
Увеличивая гормональный фон гонадотропинов в организме самок можно получить повышение уровня суперовуляции (Мадисон В.Л., Мадисон В.В., 1988; Betteridge K.J., 1977). Чаще всего для множественного роста и созревания фолликулов у коров и телок используют препараты ГСЖК с соотношением ФСГ/ЛГ 4:1 (Christie W.B., 1986). Wagner W.C. et. al., 1974 отмечает, что наиболее оптимальные результаты получены при высоком соотношении ФСГ к ЛГ (12:1).
С увеличением дозы ГСЖК вариабельность суперовуляторной реакции увеличивается (Savege N.C., Marletoff R.I., 1985), часть начавших расти фолликулов может не овулировать, превращаясь в кисты (Saiddudin S., 1968). Во время охоты, вызванной введением ГСЖК, концентрация плазменного эстрадиола и прогестерона увеличена, что говорит о нарушении гормонального баланса. Эти показатели обусловливают низкую оплодотворяемость в индуцированную ГСЖК охоту (Goodrowe K.L. et al., 1986; Roth T.L. et. al., 1997; Barnes F.L., 2000; Graham L.H. et al., 2000). У коров, которым вводили ГСЖК в дозе 3000 ИЕ с интервалом в 6 месяцев, не отмечалось различий в реакции яичников после повторного введения. Когда препарат стали вводить с интервалом 31-40 дней, яичники перестали реагировать на введение ГСЖК (Jainudeen H.R., 1966). Иммунная реакция на введение ГСЖК может изменяться в зависимости от индивидуальных особенностей организма. По данным, полученным на кроликах (Bourdillon A. et al., 1992; Lebas F. et al., 1996), козах (Remy B. et al., 1991) и на лошадях (Roser J.F. et al., 1979), при одинаковой дозе реакция организма может быть как высокой, так и низкой. Jainudeen H.R. (1966) выдвинул гипотезу что, невосприимчивость к ГСЖК может быть обусловлена выработкой антител. В 1979 году Roser J.F. подтвердил существование антител к гонадотропинам, вводя кобылам по 2600 ИЕ ХГЧ в течение 5-6 половых циклов. Период, необходимый для производства антител к ГСЖК, колеблется от 24 часов до 2 недель, что связано с особенностями строения, дозой антигена, а также способом введения (Avrameas S. et al., 1976). Обобщая имеющиеся литературные данные стоить отметить, что реакция яичников на гонадотропин остается непредсказуемой при гормональном вызывании суперовуляции, а метод трансплантации зависит от изыскания наиболее оптимального применения гонадотропинов для вызывания суперовуляции. Наиболее часто в животноводстве препараты СЖК используются с целью индукции и синхронизации охоты. Результативность их применения, по данным разных авторов, широко варьирует в зависимости от способа применения, дозы и стадии полового цикла. Гонадотропин активирует морфогенную и сосудистую реакцию в соединительнотканной оболочке фолликула и вызывает гиперсекрецию гранулезы, обеспечивая созревание и овуляцию (Черемисинов Г. А., 1974). Рекомендованная доза ГСЖК для КРС по разным данным составляет 1,5 - 2 ИЕ на 1 кг массы тела. Приход в охоту при этом колеблется от 40 до 86%, при оплодотворяемости в индуцированную охоту 7 - 45,1% (Бахитов К. И., 1998; Воробьев Н. Н., 1980; Прокофьев М. И. и др., 1983; Власов С. А., 1991). Но применение только ГСЖК часто приводило к образованию фолликулярных кист (Шипилов В. С, Семиволос А. М., 1986). Большинство исследователей сходятся во мнении, что комплексное применение ГСЖК с другими биологически активными препаратами повышает оплодотворяемость. Наиболее распространены схемы, подразумевающие комплексное применение ГСЖК с прогестагенами (Mauleon P. et al., 1968; Chupin D.et al., 1972; Rowson L.E.A. et al., 1972; Fike K. E. et al., 1997; Johnson S. K. et al., 1997; Lammoglia M. A. et al. 1998; Бахитов К. И., 1998 и др.). Схемы обработки, сочетающие действие прогестагена, гонадотропина и простагландина обеспечивают наиболее физиологически полноценное действие, оплодотворяемость при этом может достигать 80% (Beckers J.F. et al., 1978; Christie W.B. et al., 1979; Клинский IO. Д., Чомаев A. M., 1999; Чомаев A. M. и др., 2002; Вареников MB. и др., 2002). В овцеводстве препараты СЖК в основном применяют для синхронизации охоты в анестральный сезон, а также для стимуляции многоплодия в каракулеводстве. Широко применяются на практике методы синхронизации охоты с использованием препаратов СЖК в анэстральный период (Gordon I., 1968; Cognie I. et al.,1972; Provost E. et al., 1968; Minotakis С et al., 1972; Perez Y. и Perez F., 1972 и др.). По данным разных авторов, процент прихода в охоту при этом колебался от 64% (Minotakis С. et al., 1972; Cognie I. et al.,1972) до 90% (Perez Y. и Perez F., 1972). В случной период препараты СЖК применяются для увеличения выхода ягнят (Otel V., 1972). Разные авторы рекомендуют использовать ГСЖК в различных дозировках и в сочетании с разными биологическими препаратами. Большинство авторов применяли ГСЖК в дозе 500-1000 ИЕ в комплексе с прогестагенами. Установлено, что оплодотворяемость снижалась с увеличением дозы ГСЖК, но процент прихода в охоту при высоких дозах был выше (Carbonero Bravo D., 1968).
В свиноводстве ГСЖК применяется для повышения выхода поросят и синхронизации охоты (Polge С, 1968; Ectors F., Derivaux K.J., 1968; Martinat F. et al., 1972; Hunter R.H.F., 1972; Cerne F, Schilling E., 1972). Приход в охоту в течение 5 дней после обработки при этом составлял от 62 до 88%, а оплодотворяемость по разным данным колебалась от 36-40 до 87,3%.
Нашли широкое применение препараты гонадотропина в животноводстве и при лечении у животных некоторых функциональных расстройств яичников, в частности гипофункции, которая является следствием неполноценности кормления при высоком уровне интенсификации производства. Так, М.В.Вареников и др. (2003) сообщает о высокоэффективном использовании гонадотропинов в сочетании с диамолом, позволяющем выводить яичники из состояния гипофункции с хорошим синхронизирующем эффектом и оплодотворяемостью. A.M. Чомаев и Ю.Д. Клинский (2002) с этой целью советуют использовать ГСЖК в дозе 1000 - 1200 ИЕ в сочетании с эстрофаном и отмечают приход в охоту уже в течение 5-7 дней 60% поголовья.
Изучение активности гонадотропина сыворотки крови у кобыл разного возраста
Кроме того, с целью определения влияния первой жеребости на биологическую активность гонадотропина сыворотки крови, нами была изучена средняя активность у кобылок двух летнего возраста. Образцы крови для исследования отбирались через каждые 7 дней до отсутствия положительной реакции на гонадотропин. Группа кобылок двух летнего возраста составила 8 голов (гист. 1).
Из представленных данных видно, что средняя активность двухлетних кобылок выше на 6,7 ИЕ/мл активности 3-х летних, на 24,9 ИЕ/мл активности 4-х летних, а активности 9 и 10 летних кобыл почти в два раза: 55,4 ИЕ/мл и 56,3 ИЕ/мл, причем разница оказалось достоверной (Р 0,02). Одна из кобылок этой группы имела наивысшую среднюю активность гонадотропина 191,8 ИЕ/мл, а на одном из этапов крововзятий 244 ИЕ/мл. Кобылки из этой группы, имеющие высокую активность составили 50% от участвовавших в опыте. Полученные результаты свидетельствуют о том, что интенсивный обмен веществ характерный для молодых животных и особей с небольшой живой массой и обусловливает более высокую гонадотропную активность сыворотки продуцентов. Учитывая факт отсутствия физиологической зрелости у данной группы животных, все кобылки нами подверглись искусственному прерыванию жеребости на сроке до трех месяцев. С целью регрессии желтого тела использовали препарат магэстрофан совместно с синестролом (через 6-12 часов после инъекции магэстрофана). Профилактика после абортивных осложнений осуществлялась внутриматочной закладкой 2-х таблеток генобиотика на следующий день после аборта, и через одну неделю. Все кобылки абортировали через 2-12 дней после применения препаратов. Дальнейший контроль состояния матки осуществлялся ректально спустя две недели после аборта. Осложнений выявлено не было.
После установления гонадотропной активности, за день до взятия первой порции донорской крови кобыл взвешивали на весах и распределяли по группам в зависимости от живой массы тела. С учетом средней активности гонадотропина СЖК в группе по всему циклу крововзятий было проведено сравнение активности кобыл по живой массе среди 5 групп (табл. 7).
Максимальная гонадотропная активность выявлена у кобыл с живой массой менее 350 кг - 111,9 ИЕ/мл (Р 0,001), у отдельной особи средняя гонадотропная активность СЖК по 6 крововзятиям составила 186,8 ИЕ/мл. В этой же группе и самый высокий процент высокоактивных кобыл - 62,5%. На долю кобыл с живой массой тела 350 - 400 кг также приходится высокий процент доноров имеющих наивысшую активность - 20,5%. С увеличением массы тела активность снижается. В группах кобыл с массой 450 кг и более, животных с высокой активностью не выявлено, а средняя активность в них составляет не выше 63,8 ИЕ/мл с незначительной разницей - 3,7 ИЕ/мл между группами. Учитывая полученные результаты, мы проанализировали гонадотропную активность сыворотки крови жеребых кобыл, разбив их на группы с учетом живой массы, как и в предыдущем исследовании, но каждая группа формировалась из кобыл отличающихся по массе тела не более чем на 10-20 кг. Для каждой группы была определена средняя гонадотропная активность в 1 мл сыворотки. Результаты представлены на графике 1.
Как видно из графика 1, активность СЖК сильно варьировала в зависимости от массы тела. Учитывая данные представленные в таблице 7, становится очевидным, что максимальная гонадотропная активность наблюдается у животных живой массой 300-400 кг. У кобыл с живой массой более 400 кг по мере возрастания массы тела гонадотропная активность сыворотки снижается.
Нами была поставлена цель изучить динамику накопления гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл, а также изыскать способы определения количественного состава этого гормона в сыворотке с возможностью заготавливать более качественное сырье для последующего производства гонадотропин - содержащих препаратов.
В этой связи было подобрано две группы кобыл, в ретроспективе условно разделенных по гонадотропнои активности на две группы в зависимости от полноты цикла крововзятии и средней активности гормона в группах. Гонадотропная активность определялась методом иммуноферментного анализа и биопробой на крысах с учетом времени крововзятии на различных сроках жеребости (табл. 8).
Из приведенных данных таблицы 8 видно, что накопление гонадотропина сыворотки у кобыл в различные сроки жеребости имеет разную динамику. Так первое взятие крови у кобыл продуцентов ГСЖК приходится на 50-й день жеребости в обеих группах. У кобыл первой группы пик активности гормона приходится на 64 день жеребости (Р 0,001) с титром нарастания в первую неделю 5,1 ИЕ/мл. У кобыл второй группы этот показатель составляет 8,7 ИЕ/мл, а максимум гонадотропной активности приходится на 71 день беременности, с последующей динамикой снижения на 6 ИЕ/мл до 78дня и 5,2 ИЕ/мл на 85-й день соответственно, причем в этой группе данные достоверны по обоим методам исследования (Р 0,01 и Р 0,02). Период крововзятий составил 35 дней во второй группе и 28 дней в первой. Появление гормона фиксировалось методом ИФА на сроке 39 дней жеребости с значением в 2 ИЕ/мл, минимальное значение титра сывороточного гонадотропина на первом взятие крови, в первой группе, составило 27 ИЕ/мл, максимальное - 208 ИЕ/мл на 3 взятие крови с сроком жеребости 64 дня. Во второй, при шести взятиях крови - у группы кобыл с более высокой активностью гормона: минимальное значение титра гонадотропина на первом взятии крови 39 ИЕ/мл, максимальное 278 ИЕ/мл на сроке 71-й день беременности или 4-ое взятие.
Кроме вышеприведенных показателей динамики накопления гонадотропина, нами был проведен сравнительный анализ двух методов определения гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл в тех же группах, который представлен на графике 2.
Общая разница по всем взятиям крови в двух группах между биологической пробой и иммуноферментным анализом составляет 12% , однако кривые расположены параллельно, что в целом не искажает картины динамики гонадотропной активности в обеих группах.
Изучение гематологических показателей кобыл - продуцентов ГСЖК в период эксплуатации
Как уже отмечалось ранее из обзора литературы, по мнению многих авторов, появление гонадотропной активности в сыворотке крови у жеребых кобыл фиксируется на сроке в 35 -40 дней (Cole Н., Hart G.,1930, Pigoniowa Н., 1962; Allen W.,1969; Клинский Ю.Д.1967; Moor R., 1972), достигает максимума к 55 - 70 дню беременности, и затем, снижается до минимального значения к 120 -150 дню жеребости. Однако, по мнению Saint-Dizier M.et. al., 2003 ГСЖК, секретируемый эндометрием матки появляется на 14 - 31 день жеребости, достигая максимума на 38 - 62 день и исчезает к 83-101дню жеребости. Наши исследования согласуются с мнением большинства ученых, так появление гонадотропина фиксировалось в среднем на сроке 39 - 40 дней (сроки определены методом ИФА), однако на сроке уже в 105 дней нами не было выявлено ни одной жеребой кобылы с наличием сывороточного гонадотропина, а пик его активности приходился на 64-71 день плодоношения.
Seung Y.K.et al. (2003) предполагают, что низкий уровень сывороточного гонадотропина в первые недели беременности необходим для нормальной имплантации плода в стенку матки, и отмечают, что при высоком уровне гонадотропинов в этот период в результате повышения уровня тканевых ингибиторов металлопротеиназ, снижается активность самих металлопротеиназ, что значительно затрудняет имплантацию трофобласта в эндометрий и способно, в конечном итоге, привести к гибели эмбриона.
Еще одной причиной отсутствия гонадотропной активности сыворотки в первые недели беременности может являться высокий уровень прогестагенов, которые снижают моторику гладкой мускулатуры матки из-за нейтрализации нервных рецепторов (Thorburn G.D. et al., 1988; Thorburn G.D., 1993; Silver M., 1994). Начиная с 40-го дня жеребости, физиологическая необходимость повышения гонадотропной активности сыворотки обусловлена высокой потребностью организма в стероидных гормонах, что способствует созданию оптимальных условий для развития плода (Nagaoka Т. et al., 2002). В этот период, средняя гонадотропная активность в нашем опыте составляла 10-12 ИЕ/мл.
Как уже отмечалось выше, гонадотропин сыворотки жеребых кобыл отличается способностью сочетать фолликулостимулирующую и лютеинизирующую активность, что обеспечивает создание оптимальных условий для развития эмбриона. По мнению ряда авторов, сигналом для выработки гонадотропина служит выделение эмбрионом специфических факторов полипептидной природы, так называемых эндометриальных факторов роста или EGF, которые регулируют рост и дифференциацию клеток эндометрия и плаценты посредством рецепторов тирозин-киназы на клетках-мишенях. Высокий уровень этих полипептидов поддерживается приблизительно до 250 дня беременности. (Stewart F. et al., 1994; Lennard S.N. et al., 1998). Очевидно, у жеребых кобыл в местах прилегания аллантохориона к эндометрию, под действием специфических веществ зародыша возникают местные воспалительные процессы, в которых принимают участие клетки ретикулоэндотелиальной системы и образуют специфические образования, продуцирующие гонадотропин. На ранних этапах развития зародыша они выполняют функцию доставки питательных веществ, в дальнейшем предохраняют зародыш, способствуя развитию и овуляции фолликулов и возникновению дополнительных желтых тел.
Многие западные ученые считают, что в клетках эндометральных образований, при синтезе гонадотропина, содержатся липоиды в мелкодисперсном состоянии. Этот сложный глико - липо - протеиновый комплекс веществ, по мнению (Fralish G. В.,2001, Saint-Dizier М, et al., 2004, Simoni М.,1997) также влияет на активность биологические свойства гонадотропина, поскольку очистка гормона СЖК ведет к снижению его активности и изменению биологических свойств. Установлено, что сывороточный гонадотропин у лошади связан только с определенными фракциями белка, а именно с альбуминами и бета глобулинами. Помимо гонадотропина в маточных железах эндометрия образуется секрет, который содержит большое количество клеточного белка и с которым смешивается гонадотропин. Это так называемое «маточное молочко», которое для прикрепления аллантоидной плаценты служит питательным веществом для зародыша. Возможно, что этим и объясняется отсутствие гонадотропинов в крови до 40 дней, так как в это время он накапливается в клетках и выделяется с «маточным молочком».
Прикрепление аллонтоидной плаценты к эндометрию совпадает с максимальным содержанием гонадотропина в крови. К 100 дню жеребости плацента прикрепляется к эндометрию на большой площади и необходимость в эндометральных образованиях (более точно в «маточном молочке») для зародыша исчезает, и поэтому начинается постепенный некроз этих структур.
Как следует из полученных нами данных уровень гонадотропной активности зависит не только от срока плодоношения, но и от индивидуальных особенностей организма жеребых кобыл. Так, при изучении влияния возраста кобыл на гонадотропную активность СЖК (таблица №6) установлено, что с увеличением возраста животных активность гормона снижается. По мнению G.L. Woods et al. (1988) более низкая активность сывороточного гонадотропина у животных старше 10 лет объясняется возрастными изменениями в эндометрии кобыл. В наших исследованиях средняя активность гонадотропина у группы животных 10 летнего возраста составила 54,8 ИЕ/мл, что почти в два раза меньше по сравнению с группой 3-х летних кобыл - 104,4 ИЕ/мл, причем разница достоверна (Р 0,05). Не безынтересен факт высокой активности сывороточного гонадотропина у использованных нами в опыте кобылок 2-х летнего возраста, у них средняя активность гормона выше, чем у 3-х летних кобыл на 6,7 ИЕ/мл, а 4-х летних на 24,9 ИЕ/мл. Разница в активности с 10 летними кобылами также достоверна (Р 0,02). Многие авторы связывают высокую активность гонадотропина со свойственным для молодых животных высоким уровнем обмена веществ. Некоторые западные специалисты, в частности Otel V., (1972) утверждают, что высокий уровень гормона у молодых животных может быть связан с иммунологическим аспектом первых жеребостей, т.е. плод в период первой беременности выступает в качестве антигена и посредством иммунологических реакций стимулирует выработку эндометрием матки избыточного гонадотропина. В последующие беременности в организме матери происходит выработка антител к иммунологическим структурам плода и соответственно меньшему производству гормона. Однако данный вопрос нуждается в дополнительном изучении.
