Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Особенности окислительных процессов в головном мозге в норме и при реперфузии
1.1.1. Окислительный метаболизм и процессы свободнорадикального окисления в мозге 10
1.1.2. Основные механизмы повреждения нервной ткани при реперфузии 17
1.2. Механизмы биологического действия озона 23
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Модели и схемы экспериментов
2.1.1.Характеристика экспериментального материала 30
2.1.2. Модель клинической смерти в результате острой кровопотери 31
2.1.3. Модель клинической смерти в результате пережатия сердечнососудистого пучка 32
2.2. Методы исследований
2.2.1. Получение озонированного физиологического раствора и определение концентрации озона в растворе 32
2.2.2. Определение неврологического статуса и основных показателей гемодинамики и дыхания крыс в постреанимационном периоде 33
2.2.3. Опре деление субстратов углеводного обмена
2.2.3.1. Определение лактата 33
2.2.3.2. Определение пирувата 33
2.2.4. Методы определения интенсивности процесса перекисного окисления липидов и ферментов антиоксидантной защиты
2.2.4.1. УФ-спектроскопия молекулярных продуктов ПОЛ 34
2.2.4.2. Флуориметрический метод определения содержания оснований Шиффа 35
2.2.4.3.Определение активности супероксиддисмутазы 35
2.2.4.4. Определение активности каталазы 35
2.2.5. Определение содержания макроэргических нуклеотидов 36
2.2.6. Гистохимическое определение активности ферментов 36
2.2.7. Электронно-микроскопическое изучение сенсомоторной области коры головного мозга 37
2.3. Методы статистической обработки материала 37
ГЛАВА 3. Влияние озонированного физиологического раствора на окислительные процессы в мозге крыс в норме
3.1. Влияние ОФР на энергетические процессы в ткани головного мозга 38
3.2. Влияние ОФР на ультраструктуру сенсомоторной зоны коры головного мозга 42
3.3. Влияние однократного введения ОФР на уровень перекисного окисления и активность антиоксидантных ферментов в головном мозге 48
3.4. Влияние длительного применения озонированного физиологического раствора на содержание продуктов перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты в ткани мозга 53
ГЛАВА 4. Влияние озонированных аутокрови и физиологического раствора на восстановление функционального состояния и метаболизма головного мозга крыс в раннем постреанимационном периоде
4.1. Восстановление неврологического статуса животных в раннем постреанимационном периоде 60
4.2. Изменения энергетического метаболизма головного мозга в раннем реперфузионном периоде 61
4.3. Перекисное окисление липидов в головном мозге в раннем реперфузионном периоде 66
4.4. Изменения ультраструктуры сенсомоторной зоны коры головного мозга в раннем реперфузионном периоде 68
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 80
Заключение 97
Выводы 100
Список литературы 102
- Окислительный метаболизм и процессы свободнорадикального окисления в мозге
- Модель клинической смерти в результате пережатия сердечнососудистого пучка
- Влияние ОФР на энергетические процессы в ткани головного мозга
- Изменения энергетического метаболизма головного мозга в раннем реперфузионном периоде
Введение к работе
Актуальность проблемы
Высокий уровень метаболизма наряду с минимальными резервами энергетических субстратов и относительно плохо развитыми механизмами антиокислительной защиты делают мозг очень чувствительным к любому изменению доставки и утилизации кислорода, что сразу же приводит к изменению его электрической активности и функции.
Методы окислительной терапии, широко применяющиеся в настоящее время как в клинической практике, так и в экспериментальной физиологии, обладают комплексным воздействием на организм. В качестве окислителя используются гипербарическая оксигенация, ультрафиолетовое облучение аутокрови, лазерное излучение, гипохлорит натрия, перекись водорода, аэроионы воздуха, озон (Ефуни С.Н., 1986; Закс И.О. и соавт., 1994; Кондрашова М.Н., 1997, Rilling S., Viebahn R., 1987).
Озон является одним из наиболее универсальных и легкодоступных окислителей. Известно, что парентеральное введение озона, улучшая транспортную функцию крови и облегчая отдачу кислорода, обеспечивает полноценную оксигенацию тканей (Rokitansky О., 1982, Viebahn R., 1985). Применение озонированных растворов с низкой концентрацией озона способствует активации аэробных путей окисления глюкозы, увеличению синтеза АТФ, улучшению микроциркуляции тканей (Зеленов Д.М., 1988; Бояринов ГА., Соколов В.В., 1999). В низких концентрациях озонированные среды стимулируют механизмы антиоксидантной защиты клетки и организма в целом (Конторщикова К.Н., 1995).
Однако несмотря на широкое применение озонотерапии (Rilling S., Viebahn R., 1987; Перетягин СП., 1991; Бояринов ГА., Соколов В.В., 1999; Turrent J., Menendez S., 2001), в том числе в неврологической клинике (Котов С.А., 1999, Густов А.В. и др., 2000; Konrad Н., 2001), механизм действия озонированных сред на мозг остается во многом неизученным.
При этом действие озона на неповрежденный мозг, когда он не является органом-мишенью, является неисследованным. В связи с этим актуальным является изучение влияния озона на нормальный мозг.
Церебральная ишемия и гипоксия сопровождает очень многие патологические процессы, такие как тяжелая травма мозга, массивная кровопотеря, острая дыхательная недостаточность, экзогенные отравления, сепсис, остановка системного кровотока с последующей реанимацией и является наиболее часто встречающимся осложнением в нейроанестезиологии и сердечнососудистой хирургии (Неговский В.А., 1987, Семченко В.В. и др., 1999, Остапченко Д. А. и др., 2000).
Восстановление кровотока после периода ишемии вызывает в ткани мозга развитие окислительного стресса (Chan Р.Н., 1996; White B.C. et al, 1996). Наряду с этим вследствие вторичных нарушений микроциркуляции возникают очаги вторичной гипоксии. Такие разнонаправленные нарушения окислительного метаболизма делают особенно сложной задачу восстановления функций головного мозга в постреанимационном периоде и резко ограничивают возможности реанимации, ухудшают течение восстановительного периода и определяют развитие постреанимационных и постаноксических энцефалопатии (Пермяков Н.К. и соавт., 1986; Неговский В.А. и соавт., 1987; Семченко ВВ. и др., 1999, Кожура В.Л., 1999).
Восстановление кислородного гомеостаза в этих условиях является первоочередной задачей, с этой целью используются средства с различным механизмом действия - вазодилататоры, вещества, повышающие кислородную емкость крови, антигипоксанты, методы окислительной терапии.
Антигипоксические свойства озона позволяют использовать его для коррекции метаболизма при состояниях, связанных с нарушениями кровоснабжения мозга. Однако вопрос об адекватности применения окислительных методов на фоне оксидантного стресса, часто сопровождающего критические состояния, остается актуальным.
Учитывая вышеизложенное, целью нашего исследования явилось изучить влияние озонированного физиологического раствора (ОФР) на состояние окислительного метаболизма в головном мозге животных в норме и в раннем постреанимационном периоде.
Задачи исследования
1. Изучить влияние однократного введения озонированного
физиологического раствора на состояние аэробного энергетического
метаболизма, про- и антиоксидантную систему головного мозга у интактных
животных.
Исследовать влияние многократного применения озонированного физиологического раствора с различной концентрацией озона на состояние перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты головного мозга у интактных животных.
Оценить нейропротекторное действие озонированной аутокрови и озонированного физиологического раствора на функциональную активность и метаболизм головного мозга крыс в раннем постреанимационном периоде.
Научная новизна
В работе впервые проведено сравнительное изучение влияния различных доз озона на процессы окислительного метаболизма в мозге в норме и на фоне окислительного стресса в раннем постреанимационном периоде.
В результате проведенного исследования показано, что применение озонированного физиологического раствора у интактных животных вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел.
Показано, что в мозге интактных животных озонированный
физиологический раствор вызывает значительную активацию
супероксиддисмутазы (СОД) как при однократном, так и при многократном использовании. Применение ОФР на фоне исходного окислительного стресса,
8 как и длительное введение высоких доз озона, вызывает снижение активности СОД и повышение активности каталазы.
Показано, что в раннем постреанимационном периоде применение озонированной аутокрови способствует лучшей сохранности пула адениловых нуклеотидов и скорейшему восстановлению уровня макроэргических фосфатов в мозге.
Введение ОФР в раннем постреанимационном периоде способствует улучшению кровотока в капиллярах, значительному снижению периваскулярного отека. В отличие от озонированного, оксигенированныи физиологический раствор вызывает нарушения структуры капилляров, развитие сильного отека мозговой ткани в раннем постреанимационном периоде, что приводит к гибели животных.
В результате проведенного комплексного исследования показано, что применение ОФР вызывает активацию синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров в норме и раннем постреанимационном периоде.
Теоретическая и практическая значимость
Данное исследование представляет теоретический интерес для нормальной и патологической нейрофизиологии и нейрореаниматологии. Установленные факты существенно дополняют современные представления о механизмах действия озона на головной мозг.
Практическое значение результатов работы заключается в экспериментальном обосновании необходимости мониторинга изменений про- и антиоксидантых процессов, вызываемых озоном, при применении ОФР в клинике, как у больных без повреждения головного мозга, так и, особенно, при развитии в нем окислительного стресса.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III, IV и V Всероссийских научно-практических конференциях "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" (Нижний Новгород, 1998, 2000, 2003); XV
9 Международном конгрессе по озону (Великобритания, Лондон, 2001); I Международной научно-практической конференции "Місцеве та парентеральне використання озонотерапіі в медицині" (Украина, Харьков, 2001), II и III Всероссийских конференциях "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1999, 2002); 8 Нижегородской конференции молодых ученых (2003), 1 Украинско-Российской научно-практической конференции "Озон в биологии и медицине" (2003).
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Положения, выносимые на защиту
Однократное применение озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг активирует аэробный энергетический метаболизм в ткани головного мозга у интактных животных, повышает активность СОД. При многократном введении ОФР с разными дозами озона интактным животным наблюдается интенсификация процессов ПОЛ, увеличение активности СОД, в меньшей степени каталазы. При введении ОФР на фоне окислительного стресса (в постреанимационном периоде) активность СОД снижается, наблюдается активация каталазы.
Введение озонированного физиологического раствора и озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде улучшает микроциркуляцию, активирует аэробные пути окисления глюкозы и кетоновых тел, повышает уровень макроэргических фосфатов в головном мозге, в результате чего происходит более быстрое восстановление функциональной активности ЦНС.
3. Озонированный физиологический раствор вызывает усиление
синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров в
интактном мозге и в раннем постреанимационном периоде.
Окислительный метаболизм и процессы свободнорадикального окисления в мозге
Мозг является одним из наиболее метаболически активных органов. Составляя около 2% от веса тела, он потребляет до 20-25% кислорода, поступающего в организм. Потребление кислорода мозгом человека составляет в среднем 1,5-1,7 ммоль/г/мин, мозгом крысы - 4,6-4,9 ммоль/г/мин. При этом 70% кислорода приходится на нейроны, интенсивность потребления кислорода которыми в десятки раз превышает таковую других клеток и тканей (Шмидт Р., Тевс Г., 1985; Ашмарин В.П., Стукалов П.В., 1996). Общее потребление кислорода мозгом колеблется незначительно, однако региональные изменения этого показателя зависят от уровня активности разных областей мозга. Регуляция метаболических потребностей головного мозга осуществляется за счет изменения мозгового кровотока, между величиной которого и уровнем метаболизма существует функциональное соответствие (Michenfelder D., Livingstone Н., 1988).
60% энергии бодрствующего мозга тратится на совершение внешней работы, 40% - на поддержание нейрональной и глиальной интеграции, что включает в себя регуляцию ионных градиентов, биосинтеза и аксонального транспорта (Michenfelder D., Livingstone Н., 1988).
Основным субстратом окисления для мозга является глюкоза, транспорт которой осуществляется преимущественно (на 95%) системой переносчиков. Мозг потребляет до 70% глюкозы, образующейся в печени (Ашмарин В.П., Стукалов П.В., 1996). Около 85-90% глюкозы полностью окисляется до СОг и воды в ходе аэробного гликолиза, 5-7% - в реакциях ПФП, функцией которого является снабжение структур нервной ткани восстановительными эквивалентами, а также пентозами. Небольшая часть глюкозы используется в других реакциях (синтез гликогена, нейротрансмиттеров, глутамата, церамидной части гликолипидов и гликопротеидов). Собственные запасы глюкозы в мозге чрезвычайно малы, по сравнению с высокой интенсивностью ее окисления, что определяет высокую чувствительность мозга к ее недостатку (Виленский Б.С, 1986).
В ряде случаев источником энергии в мозге могут служить другие субстраты окисления - жирные кислоты, кетоновые тела ф-оксибутират, ацетоацетат), лактат, глутамат, которые, однако, очень ограниченно могут компенсировать недостаток глюкозы (Daikhin Y., Youdkoff М., 2000; Kashiwaya Y. et al., 2000), основной причиной этого является низкая проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) в мозге взрослых животных для других субстратов окисления (Blomgvist G. et al., 1995). Утилизация субстратов, альтернативных глюкозе, может играть важную роль в выживании клеток мозга в экстремальных условиях, в частности, при гипоксии и ишемии. Так, показано увеличение потока глутамата из глии в нейроны, увеличение формирования а-кетоглутарата из глутамата при гипоксии мозга у крыс (Eschenko N. et al., 1998), увеличение метаболизма глутамата и ГАМК в астроцитах при локальной ишемии мозга (Pascual J. et al., 1998). Протективное действие при гипоксии и ишемии мозга оказывает также введение р-гидроксибутирата (Suzuki М. et al., 2001).
Астроциты являются первыми потребителями глюкозы благодаря своему расположению вокруг капилляров. Одним из основных продуктов их метаболизма является лактат, который может служить субстратом окисления для нейронов, особенно во время повышенной нейрональной активности (Poitry-Yamate С. et al., 1995). Кроме лактата астроциты продуцируют и кетоновые тела, также используемые для окисления в нейронах (Guzman М., Blanques С, 2001).
Регуляция и протекание реакций гликолиза в головном мозге имеет некоторые специфические черты. Ввод субстратов окисления в гликолитическую цепь происходит в основном через гексокиназную реакцию. Более высокая активность гексокиназы по сравнению с другими тканями, однонаправленная и синхронная регуляция адениловыми нуклеотидами (АТФ и АДФ) наиболее медленных этапов гликолиза - гексокиназной и фосфофруктокиназной реакции обеспечивает протекание реакций гликолиза на высоком уровне даже при низкой концентрации глюкозы в крови и корреляцию уровня окислительного метаболизма в зависимости от энергетических потребностей. Локализация лактатдегидрогеназы (ЛДГ) как в цитоплазме, так и в митохондриях дает возможность наиболее полно использовать пируват и лактат в дальнейших окислительных реакциях в митохондриях.
Основным путем пополнения пула метаболитов цикла Кребса в мозге является пируватдегидрогеназная реакция, скорость которой намного выше, чем в других тканях. В мозге также высока активность цитратсинтазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы, которые связаны в единый функциональный комплекс, что обеспечивает однонаправленное и синхронное изменение скорости наиболее медленных этапов цикла Кребса в зависимости от энергетических потребностей ткани, в первую очередь — от соотношения компонентов адениннуклеотидной системы (Ашмарин В.П., Стукалов П.В., 1996).
Специфическим для нервной ткани является ГАМК-шунт. ГАМК синтезируется в цикле Кребса и является одним из ключевых веществ в синтезе биогенных аминов и белков. Помимо этого, благодаря специфической активности ГАМК, в критических ситуациях повышается включение в цикл Кребса аминокислот и кетоновых тел, что в известной мере компенсирует энергетический дефицит в мозге (Виленский Б.С, 1986).
С циклом Кребса тесно связан и метаболизм глутамата, который является для нервных клеток промежуточным продуктом энергетического метаболизма. Участие глутамата в энергетическом обмене заключается в поддержании метаболитов цикла Кребса на определенном и достаточно высоком уровне, а также в снабжении митохондриальных синтетических процессов восстановительными эквивалентами. (Кометиани П.А., 1980; Ашмарин В.П., Стукалов П.В., 1996). Важнейшими функциями глутамата, кроме того, является его участие в обезвреживании аммиака, синтезе белков и биологически активных пептидов (Palmada М, Centelles J.J., 1998).
Высокая интенсивность цикла Кребса определяет большой объем продукции аминокислот, в первую очередь в ГАМК-шунте. Таким образом, утилизация глюкозы в мозге в значительной степени происходит через биосинтез и окисление аминокислот.
Модель клинической смерти в результате пережатия сердечнососудистого пучка
Изучение механизмов адаптационного действия озонированного физиологического раствора на мозг проводилось в этих сериях опытов на интактных наркотизированных животных.
В контрольной группе (интактные наркотизированные крысы) состояние неврологического статуса крыс соответствовало этапу неглубокого нембуталового наркоза. Отмечалось наличие самостоятельного дыхания, роговичного рефлекса, болевого рефлекса на механическое раздражение кончика хвоста крысы.
В течение часа наблюдался постепенный выход животного из состояния наркотического сна, проявление двигательной активности крыс.
Однократное внутрибрюшинное введение 1 мл озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг предварительно наркотизированным нембуталом интактным крысам приводило к снижению болевого рефлекса при сохранении роговичного рефлекса и самостоятельного дыхания.
Во всех остальных сериях опытов ОФР вводился интактным животным, наркотизация которых проводилась сразу перед забиванием.
Показанное ранее (Лапшин Р.Д., 2000) углубление физиологического сна (по данным электрокортикограммы) и усиление действия наркоза при введении ОФР интактным наркотизированным животным поставило вопрос о возможности развития гипоксических процессов в мозге в условиях углубления наркоза. В связи с этим нами было проведено исследование содержания ключевых продуктов гликолиза — лактата и пирувата, содержание и соотношение которых в тканях и крови является одним из маркеров гипоксии (Mishenfelder D., Livingstone Н., 1988).
Введение озонированного физиологического раствора на фоне нембуталового наркоза не вызывало увеличения содержания лактата в ткани мозга (табл. 1), по сравнению с интактной серией, что свидетельствовало об отсутствии развития гипоксических процессов в ткани мозга. Содержание пирувата при этом достоверно возрастало (на 35%), в результате чего соотношение лактат/тшруват достоверно уменьшалось (с 13±0,8 до 9,5+0,21) по сравнению с интактной серией.
Таким образом, углубление сна под действием озона не сопровождалось развитием гипоксии в головном мозге. Напротив, отмечалось некоторое усиление аэробного гликолиза в ткани мозга, что могло отражать повышенное потребление глюкозы мозгом на фоне хорошего снабжения кислородом при воздействии озонированного раствора. Введение интактным крысам в/б 1 мл озонированного физиологического раствора в дозе 2,8 мкг/кг вызывало изменение активности некоторых окислительно-восстановительных ферментов (рис. 1). Через 60 мин исследуемого периода наблюдалось снижение активности пируватдегидгогеназы на 14%, активность лактатдегидрогеназы не изменялась. Некоторое понижение активности ПДГ, вероятно, и повлияло на накопление пирувата, так как пируватдегидрогеназная реакция в мозге является основным путем ввода метаболитов в ЦТК. В то же время при использовании ОФР в головном мозге наблюдалось увеличение активности Р-обДГ на 25% - фермента, обеспечивающего взаимопревращение ацетоацетата в Р-гидроксибутират. Отмечалось повышение активности первого фермента электрон-транспортной цепи - НАДНДГ на 32%, что свидетельствовало об усилении окисления в дыхательной цепи НАД-зависимых субстратов. Это также могло быть следствием повышения включения в окислительный метаболизм нехарактерного для мозга субстрата окисления - кетоновых тел, что подтверждалось увеличением активности (5-обДГ. Известно, что усиление окисления кетоновых тел может приводить к активации ГАМК-шунта и повышению концентрации ГАМК в мозге (Daikhin Y., Yudkoff М., 1998). Возможно, этот механизм лежал и в основе наблюдаемого нами углубления действия наркоза при использовании озонированного физиологического раствора. В результате повышения включения в окислительный метаболизм кетоновых тел, возможно, снижалась активность ПДГ и тормозилась утилизация пирувата в цикле Кребса, несмотря на достаточную активность аэробного гликолиза в ткани мозга. Однократное введение озонированного физиологического раствора в дозе 2,8 мкг/кг интактным крысам практически не влияло на содержание адениловых нуклеотидов в ткани мозга (рис. 2). На 10% снижалось содержание АДФ, в результате чего повышалось соотношение АТФ/АДФ (на 11,6%). Соотношение АТФ/АМФ и общее содержание адениловых нуклеотидов не изменялись. Повышенное потребление АДФ при неизменном содержании АТФ и АдН могло свидетельствовать об ускорении синтеза АТФ, накопления которой не происходило, вероятно, вследствие ее усиленного потребления. При электронно-микроскопическом исследовании ультраструктуры сенсомоторной зоны коры головного мозга интактных наркотизированных крыс в микроциркуляторном отделе встречались преимущественно капилляры с электронноплотным эндотелием, органеллами обычного вида (рис. 4а). Изредка встречались участки набухания, с просветлением цитоплазмы и небольшими вакуолями, с набуханием базальной и люминальной мембраны. Плазма содержала мелкодисперсный осмиофильный материал (что соответствует плазменным белкам обычной структуры), эритроциты были с четкими мембранами. Астроглия большей частью имела обычный вид, встречались отдельные астроциты с набуханием цитоплазмы ножек. В нейронах определялись хорошо выраженные аппарат Гольджи, гранулярный ЭПР, рибосомы, полисомы. Ядра нейронов часто содержали ядрышко, диффузный хроматин (рис.46). В отдельных нейронах обнаруживалось незначительное набухание цитоплазмы, отмечались лизосомы 1 и 2 типов. Таким образом, электронно-микроскопическое исследование сенсомоторной зоны коры головного мозга интактных наркотизированных крыс показало наличие незначительных ультраструктурных изменений, вызванных, вероятно, воздействием наркоза. Это выражалось в незначительном очаговом набухании элементов нервной ткани — эндотелия, ножек астроцитов, нейронов. После введения озонированного физиологического раствора интактным наркотизированным животным при ультрастуктурном исследовании выявлялся большей частью электронноплотный эндотелий, реже встречались участки набухшего эндотелия, с единичными вакуолями и везикулами. Капилляры в основном содержали эритроциты (рис.5). Цитоплазма астроцитов содержала много органелл, в ряде случаев встречались набухшие и опустошенные митохондрии, расширенньїе цистерны ЭПР и аппарата Гольджи, первичные лизосомы. Иногда отмечалось набухание ножек астроцитов. В нейронах было обнаружено увеличенное содержание рибосом, полисом. В ядрах нейронов выявлялись ядрышки, плотная кариоплазма с эухроматином, встречались ядра с инвагинациями (рис.6, 7). Указанные изменения принято считать показателем увеличения белоксинтезирующей функции клетки (Н.Н. Боголепов, 1979).
Влияние ОФР на энергетические процессы в ткани головного мозга
Таким образом, применение озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде приводило к улучшению состояния капилляров и крови в капиллярах в головном мозге животных. Периваскулярныи отек, свидетельствующий о нарушении сосудистой проницаемости, в отличие от контрольной серии, наблюдался местами, вероятно, являясь следствием перенесенной ишемии. Для нейронов были характерны признаки восстановления синтетических процессов в клетке.
Принимая во внимание, что процентное содержание озона в составе озоно-кислородной смеси не превышает 0,01-0,001, была проведена серия экспериментов с изучением воздействия того же объема оксигенированного физиологического раствора без добавления озона с целью дифференцирования влияния озона и кислорода на состояние мозга в раннем постреанимационном периоде. Однако применение оксигенированного раствора ухудшало восстановление после клинической смерти и приводило к гибели животных на раннем этапе реперфузии (до 30 мин). Ультраструктурное исследование сенсомоторной зоны коры головного мозга при использовании оксигенированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде показало наличие сильного набухания ткани мозга. Часто отмечались нарушения циркуляции крови в капиллярах - капилляростаз за счет периваскулярного отека и агрегации эритроцитов. Наблюдалось много плазматических капилляров с грубодисперсной структурой белков плазмы (рис.25 а,б).
Эндотелий большей частью был электронно-прозрачным, люминальная мембрана местами была нечеткой. В цитоплазме эндотелия присутствовали лизосомы, опустошенные митохондрии с деструктивными изменениями крист, с электронно-прозрачным матриксом. Местами отмечалось появление миелиноподобных структур, что является результатом повышенной интенсивности свободнорадикального окисления (рис.25 а).
Наблюдался сильный отек ножек астроцита. В ножках астроцита встречались липофуспиновые включения — результат отложения нерастворимой фракции оснований Шиффа. В нейронах вследствие набухания цитоплазмы уменьшалось ядерно-цитоплазматическое соотношение. В большинстве нейронов отсутствовало ядрышко. Наблюдался диффузный хроматолиз цитоплазмы (рис.26). Большое количество митохондрий находилось в состоянии деструкции. Увеличивалось количество вторичных лизосом, в том числе липофусциновых гранул. Количество полисом снижалось относительное нормального уровня. Присутствовало значительное количество темных клеток. Таким образом, применение оксигенированного физиологического раствора, в отличие от озонированного, вызывало более глубокие повреждения ультраструктуры неокортекса по сравнению с контрольной серией. Выявлялись нарушения кровотока и целостности стенки капилляра, ярко выраженный отек клеток эндотелия, астроцитов, хроматолиз нейронов, признаки снижения синтетической активности нейронов. Присутствие миелиноподобных структур, большого количества липофусциновых гранул свидетельствовало о значительной активации процессов перекис ного окисления липидов. Указанные изменения свидетельствовали о преобладании катаболических процессов в нейронах. Итак, применение озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде приводило к более быстрому восстановлению неврологического статуса животных, при этом восстановление болевого рефлекса не ускорялось. При использовании озонированной аутокрови в ранний постреанимационный период наблюдалось также более полное восстановление уровня адениловых нуклеотидов в ткани головного мозга. Использование озонированного физиологического раствора в раннем реперфузионном периоде вызывало значительное снижение лактатацидоза в ткани головного мозга за счет активации ЛДГ, снижалось также отношение лактат/пируват. Влияние оксигенированного физиологического раствора на ультраструктуру неокортекса крысы через 60 минут восстановительного периода после 10-минутного пережатия сердечно-сосудистого пучка (жроматолиз нейрона, уменьшение количества органелл, особенно в перинукмсарной зоне, ядро нейрона без ядрышка, первичные лизосомы) И11 - ядро нейрона. Ув. 6000. Применение ОФР в раннем постреанимационном периоде стимулировало ПФП и окисление кетоновых тел в головном мозге, что оказывало защитное действие в условиях метаболического стресса. Введение ОФР в период восстановления после клинической смерти вызывало умеренную активацию процессов ПОЛ и повышение активности катал азы. Использование озонированного физиологического раствора в раннем реперфузионном периоде способствовало значительному уменьшению отека ткани мозга, восстановлению микроциркуляции. Отмечалось усиление синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров. Возможно, под действием продуктов озонолиза активировался синтез специфических белков, способных повышать резистентность мозга к последующим воздействиям. Использование оксигенированного физиологического раствора в раннем реперфузионном периоде после тотальной ишемии приводило к ухудшению восстановления функций головного мозга и ранней гибели животных вследствие ухудшения микроциркуляции, нарушения выработки энергии и некомпенсированной активации процессов ПОЛ в ткани мозга.
Изменения энергетического метаболизма головного мозга в раннем реперфузионном периоде
Широкое распространение озонотерапии в современной медицине определяет интерес исследователей к механизмам действия озона на органном и тканевом уровне. В особенности это актуально для головного мозга, кровоснабжение и метаболизм которого определяют его высокую чувствительность как к гипоксии, так и к окислительному стрессу.
Воздействие озона на кислородный метаболизм организма реализуется несколькими механизмами: 1) повышением эластичности эритроцитов, текучести крови и артериального рОг, 2) ускорением гликолиза в эритроцитах, ростом 2,3-ДФГ, и, вследствие сдвига кривой диссоциации оксигемоглобина, улучшением отдачи кислорода тканям, 3) активацией ферментов, участвующих в разложении радикалов кислорода и пероксидов, 4) активацией митохондриальной цепи процесса дыхания (Конторщикова К.Н., 1995; Риллинг 3., Фибан Р., 1997; Sunnen G., 1989; Richelmi P. et al., 1995). Системные метаболические эффекты озона при парентеральном введении в настоящее время рассматриваются, прежде всего, как результат действия продуктов его распада - озонидов и пероксидов (Зайцев В.Я., Разумовский С.Д., 1998). Благодаря высокой реакционной способности озон, поступивший в организм, практически мгновенно реагирует с компонентами крови. Большая его часть разрушается плазменными антиоксидантами, оставшаяся часть образует относительно стабильные продукты, которые разносятся током крови в органы и ткани. Поступившие в мозг продукты озонолиза запускают в клетках мозга комплекс реакций, ведущих к изменению биохимического статуса и, вследствие этого, функциональной активности.
Известно, что применение озонированных растворов с низкой концентрацией озона способствует активации аэробных путей окисления глюкозы в тканях сердца, печени, почек (Зеленов Д.М., 1988; Бояринов ГА., Соколов В.В., 1999). В проведенных нами экспериментах в ткани головного мозга интактных животных при введении ОФР также наблюдалось повышенное потребление глюкозы и усиление аэробного гликолиза.
В тоже время, следует отметить, что наблюдавшееся нами значительное накопление пирувата при воздействии ОФР в интактном мозге было, вероятно, следствием не только активации гликолиза, но и некоторого торможении утилизации пирувата в цикле Кребса. Об этом свидетельствовало одновременное снижение активности ПДГ, являющейся основным путем ввода пирувата в цикл Кребса в головном мозге.
Незначительное торможение включения пирувата в цикл Кребса с избытком компенсировалось другими субстратами окисления, что вызывало активацию работы дыхательной цепи. Отмечалось повышение активности первого фермента электрон-транспортной цепи — НАДНДГ на 32%, что свидетельствовало об усилении окисления в дыхательной цепи НАД-зависимых субстратов. Это могло быть связано с увеличением потребления нехарактерного для мозга субстрата окисления - кетоновых тел, что подтверждалось активацией (3-обДГ на 25% - фермента, обеспечивающего взаимопревращение ацетоацетата в гидроксибутират. Кроме того, показано, что кетоновые тела способны входить в ЦТК через ацетил-КоА в обход ингибированной ПДГ (Kashiwaya Y. et al., 2000). Повышенное окисление кетоновых тел - более энергетически выгодного субстрата, возможно, и приводило к активации работы дыхательной цепи в ткани головного мозга интактных животных при воздействии ОФР. Так как гематоэнцефалический барьер определяет низкую проницаемость экзогенных кетоновых тел, то источником кетоновых тел в данных условиях могли служить астроциты, которые способны продуцировать кетоновые тела для последующего окисления в нейронах (Guzman М., Blanques С, 2001). Не исключено также, что активация (З-об-ДГ отражала и повышение образования кетоновых тел, используемых для синтеза специфических липидов мозга.
По данным Daikhin Y. Yudkoff М. (1998), усиление окисления кетоновых тел может приводить к активации ГАМК-шунта и повышению концентрации ГАМК в головном мозге. Кетоновые тела, через ацетил-КоА входя в цикл Кребса в обход ингибированной ПДГ, увеличивают количество цитрата и снижают уровень оксалоацетата. В результате замедляется АлАТ-реакция, меньшее количество глутамата подвергается трансаминированию, больше глутамата остается для глутаматдекарбоксилазной реакции, что способствует активации синтеза ГАМК (Daikhin Y. Yudkoff М., 1998). Возможно, изменение баланса тормозных и возбуждающих аминокислот, вследствие сдвига субстратов окисления, являлось одним из механизмов потенцирующего наркоз действия ОФР при его введении интактным животным, находившимся под легким нембуталовым наркозом. По данным Лапшина Р. Д. (2001) углубление наркотического сна без снижения уровня метаболизма и замедление восстановления болевой реакции у интактных животных и в раннем постреанимационном периоде на фоне применения ОФР может являться также следствием влияния озона на компоненты опиоидной системы.
При изучении параметров энергетического обмена мозга было выявлено, что, несмотря на активацию аэробного энергетического метаболизма, наблюдавшуюся в ткани головного мозга животных при воздействии ОФР, уровень АТФ практически не менялся. Повышенный расход АДФ в этих условиях, при неизменном содержании АТФ и АдН, свидетельствовал об ускорении синтеза АТФ. Таким образом, отсутствие накопления АТФ, вероятно, было связано с ее усиленным потреблением в клетке.
При введении ОФР в головном мозге интактных животных наблюдалось также некоторое снижение общего содержания гуаниловых нуклеотидов (ГуН). Высокое содержание ГТФ является особенностью мозговой ткани и служит источником энергии для аксонального транспорта (процесса полимеризации-деполимеризации микротрубочек), выполняет регуляторную функцию, влияя на свободные и сопряженные с аденилатциклазой рецепторы, модулирует действие гормонов и нейромедиаторов, понижая их селективное сродство к соответствующим рецепторам. В цитоплазме ГТФ участвует в рибосомальном синтезе белка (Хватова Е.М., 1989).
Возможно, что выявленное нами снижение содержания в ткани мозга ГТФ было связано с превышением потребления ГТФ над его синтезом, обусловленное, в частности, торможением реакции субстратного фосфорилирования в цикле Кребса в результате активации ГАМК-шунта (Кометиани П. А., 1980; Rodichok L.D., Albers R.W., 1980).
Снижение количества гуаниловых нуклеотидов могло также являться следствием обеспечения активных белоксинтезирующих процессов. Данное предположение подтверждалось результатами электронно-микроскопического исследования. Так, при использовании ОФР в неокортексе интактных крыс наблюдалось увеличенное содержание рибосом, полисом в нейронах, в ядрах нейронов чаще выявлялись ядрышки, присутствовала плотная кариоплазма с эухроматином, встречались ядра с инвагинациями. Указанные изменения считаются показателем увеличения белоксинтезирующей функции клетки (Н.Н.Боголепов, 1979). Повышенное окисление кетоновых тел как более энергетически выгодного субстрата, возможно, также было связано с обеспечением энергией синтетических процессов.
