Влияние норм азотных удобрений на белковый обмен в растениях картофеля Мельникова Ирина Евгеньевна

Содержание к диссертации

Введение

1. РАЗВИТИЕ КАРТОФЕЛЯ КАК ОСНОВА ЕГО ПРОДУКТИВНОСТИ

1.1. Онтогенез картофеля и соотношение отдельных его этапов 7

1.2. Влияние азота на продуктивность картофеля и механизм его действия в растении 15

1.3. Обмен белков в растениях и его изменение в ходе онтогенеза. Влияние азотных удобрений на белковый обмен 25

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Краткие сведения по систематике и биологическим особенностям картофеля. Характеристика сорта Гатчинский 39

2.2. Методика закладки вегетационного опыта и уход за растениями 43

2.3. Анализ растительных образцов и использованные методы анализа 48

2.4. Статистическая обработка полученных результатов 59

3. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ ОСНОВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПИТАНИЯ

В ХОДЕ ОНТОГЕНЕЗА РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ

3.1. Влияние различных условий азотного питания на накопление азота 61

3.2. Влияние различных условий азотного питания на накопление фосфора и калия в растениях картофеля 76

3.3. Вынос элементов питания из почвы вегетационных сосудов растениями 83

4. ВЛИЯНИЕ НОРМ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ НА РОСТ И РАЗБИТИЕ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ В ХОДЕ ОНТОГЕНЕЗА 89

5. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ НОВІ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ НА БЕЛОК В РАСТЕНИЯХ КАРТОФЕЛЯ

5.1. Влияние норм азотных удобрений на содержание и фракционный состав белков .99

5.2. Влияние норм азотных удобрений на аминокислотный состав белков картофеля и его изменение в ходе онтогенеза 117

5.3. Влияние норм азотных удобрений на активность пептид-гидролаз и её изменение в ходе

онтогенеза 126

6. ВЛИЯНИЕ НОРМ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ

КАРТОФЕЛЯ И КАЧЕСТВО ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ 136

7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 146

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 170

ВЫВОДЫ 172

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 175

ПРИЛОЖЕНИЯ 196

• Онтогенез картофеля и соотношение отдельных его этапов
• Краткие сведения по систематике и биологическим особенностям картофеля. Характеристика сорта Гатчинский
• Влияние различных условий азотного питания на накопление азота
• ВЛИЯНИЕ НОРМ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ НА РОСТ И РАЗБИТИЕ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ В ХОДЕ ОНТОГЕНЕЗА
• Влияние норм азотных удобрений на содержание и фракционный состав белков

Введение к работе

Одной из главных задач, поставленных ХХУТ съездом КПСС перед биологической наукой, является повышение продуктивности сельскохозяйственных культур за счет создания новых высокоурожайных сортов, разработки новых технологических приемов их возделывания /I/. Решение этой задачи невозможно без углубления знаний о механизмах и закономерностях прохождения онтогенеза, без углубленного исследования влияния отдельных факторов на онтогенез сельскохозяйственных растений.

Картофель является одной из наиболее ценных продовольственных культур Нечерноземной зоны. Современная агротехника, подбор сортов позволяют получать в передовых хозяйствах урожаи этой культуры до 24...30 т с одного гектара. Однако средние урожаи, получаемые в Нечерноземье, много ниже и в ряде случаев опускаются до 10...12 т с одного гектара. В Продовольственной программе СССР намечены конкретные вопросы, решение которых связано с повышением урожайности сельскохозяйственных культур и, в том числе, картофеля и улучшением качества получаемой продукции /2/. Для решения этих вопросов необходимо дальнейшее углубленное изучение биологии картофеля и, в частности, влияния условий выращивания на продуктивность и качество, и, особенно, действие минеральных удобрений на его урожайность.

Для картофеля важнейшим этапом онтогенеза, определяющим реализацию генетической программы развития и, следовательно, и продуктивность, является этап клубнеобразования. Для заложения и роста клубней необходима целая совокупность факторов, глубокое знание которых позволило бы управлять процессом клуб-необразования, регулировать сроки закладки клубней, их коли- чество, нарастание массы клубня. В настоящее время опытных данных для решения этих задач недостаточно.

Одним из наиболее важных факторов, способных регулировать скорость прохождения отдельных этапов онтогенеза и влиять на формирование органов растения, является минеральное питание и, особенно, азот. Внесение все более высоких доз удобрений и, в частности, азотных удобрений, получает широкое распространение в сельскохозяйственной практике. Влияние оптимальных доз удобрений, вносимых под различные культуры, которые вызывают резкое увеличение продуктивности и улучшение качества продукции, изучается достаточно подробно, тогда как влияние высоких доз удобрений остается совершенно не изученным. Такое же положение наблюдается и в отношении исследования влияния азота, хотя известно, что высокие дозы удобрений способны вызывать снижение продуктивности, а, главное, ухудшение качества получаемой продукции. Именно изучение влияния высоких доз азотных удобрений жало бы возможность глубже понять механизм действия азота на онтогенез растений.

Целью работы было исследование влияния широкого диапазона доз азотных удобрений на белковый обмен картофеля сорта Гатчинский в ходе всего онтогенеза. Основная задача заключалась в том, чтобы выявить изменения, вызванные внесением высоких доз азотных удобрений, возникающие в белковом обмене. С другой стороны, ставилась задача найти такие показатели белкового обмена, которые, одновременно с этим, могли бы характеризовать рост и развитие растений. Таким показателем могла быть активность нейтральных (рН 7,8) пептид-гидролаз, локализованных в протоплазме, которая на ранних этапах онтогенеза оказа-лать тесно связанной со скоростью роста растений. Кроме того, в работе была предпринята попытка представить продуктивность растений картофеля, как конечный результат прохождения онтогенеза, в целом, и его ранних этапов, в частности. Так, были выявлены параллели в действии доз азотных удобрений на нарастание площади листовой поверхности растений на ранних этапах онтогенеза и числом закладывающихся клубней, между содержанием хлорофилла в листьях и накоплением крахмала в клубнях картофеля.

Изучение влияния азота на белковый обмен в ходе онтогенеза, с одной стороны, и на прохождение отдельных этапов онтогенеза, с другой, позволило более четко представить роль азотных удобрений в усилении процесса клубнеобразования. Отсутствие замедления роста ботвы в начальные этапы клубнеобразования, очевидно, явилось одной из главных причин снижения продуктивности картофеля при повышении доз внесенных азотных удобрений.

Новизна работы заключается в том, что впервые было изучено влияние азота на фракционный состав белка и активность пеп-тид-гидролаз в растениях картофеля в ходе всего онтогенеза. В настоящее время глубокое понимание физиологических механизмов возможно только при изучении их в ходе онтогенеза и при объединении данных, полученных на разных уровнях исследования. Подход с этой точки зрения к изучению влияния азота на растения картофеля является новым. Именно при таком подходе открываются возможности дальнейшего изучения физиологических механизмов влияния удобрений на продуктивность сельскохозяйственных культур и качество получаемой продукции, необходимые при разработке программирования урожаев.

I. РАЗВИТИЕ КАРТОШЕЛЯ КАК ОСНОВА ЕГО ПРОДУКТИВНОСТИ

I.I. Онтогенез картофеля и соотношение отдельных его этапов

Знание закономерностей онтогенетических изменений необходимо для управления ростом и развитием организма в целом и формированием тех органов, ради которых возделывается это растение. Для картофеля эти закономерности особенно важны, так как в начальные этапы необходимо происходит нарастание вегетативной массы надземной части растения, а затем переключение на формирование клубней, что связано с остановкой дальнейшего роста вегетативной части. Данные, полученные П.И.Альсмиком /7/, свидетельствовали, что для сортов картофеля, различающихся по скороспелости, существует постоянная закономерность роста: вначале происходит интенсивный рост ботвы, затем, в период начала цветения, остановка её роста. Причем, у скороспелых сортов остановка роста вегетативной части происходит раньше, чем у позднеспелых.

Показано, что столоны закладываются на П этапе органогенеза, который характеризуется дифференцировкой в нижней части конуса нарастания узлов и междоузлий стебля. На узлах формируются зачатки листьев, в пазухах которых закладываются точки роста столонов /79/. Продолжительность П этапа в зависимости от вида и сорта картофеля составляет от 5 до 14 дней /71/. Столонообразование у картофеля является генетической особенностью, и этот закономерный процесс начинается в определенный, конкретный период онтогенеза. Это определяется тем, что столоны представляют собой побеги ветвления стебля, а число побегов стебля определяется на П этапе органогенеза /73, 74 /. Согласно теории морфофизиологии развития Ф.М.Куперман выделя-

8 ют следующие этапы развития растения картофеля: I - прорастание клубней, П - закладка столонов, Ш-УП - вегетативный рост, причем начало клубнеобразования будет соответствовать УІ этапу, УШ - бутонизация, IX - цветение, X - образование ягод. Максимального сухого веса стебель достигает на IX этапе органогенеза. G завершением этого этапа наступает усиленный отток метаболитов из надземной части в клубни /136/. Начало этапа клубнеобразования, следовательно, совпадает с фазой бутонизации у растений картофеля.

Данные о важности начальных этапов онтогенеза для клубнеобразования приведены и в работе В.А.Новикова /101/, где автор разбивает весь онтогенез картофеля на четыре основные стадии, причем первая и вторая стадии характерны только для выращиваемых из семян растений. Третья стадия - световая и четвертая - образование пыльцы. Изучая влияние внешних факторов на онтогенез картофеля, автор приходит к выводу о большей значимости световой стадии при формировании продуктивности растений картофеля. Так, влияние интенсивности света и температуры в этот период онтогенеза оказало наиболее существенное влияние на урожай растений.

До:і настоящего времени в специальной литературе встречается разделение онтогенеза картофеля на следующие этапы: 1-рост вегетативной массы, 2 - цветение, 3- дозревание клубней, 4 -отмирание ботвы /52/. Однако, учитывал, что рост надземной части тормозится уже в фазу бутонизации, представляется более правильным разделение онтогенеза картофеля на следующие фазы: I - интенсивный рост, 2 - бутонизация, 3 - цветение, 4 - дозревание клубней и отмирание ботвы /30/. Под термином фаза развития растения в современной физиологии растений следует понимать морфофизиологическое проявление этапов онтогенеза, свя-

9 занное с проявлением и развитием отдельных органов /161/. Важнейшей проблемой в онтогенезе картофеля является воз- можность управлять прохождением отдельных его этапов. Так, А.С.Лорх писал: "... управлять ростом и развитием растений -один из основных приемов борьбы за урожаи" ^к' /81/. Он доказывал, что амплитуда урожайности ранних сортов картофеля может колебаться от 90 до 165%, а среднеспелых - от 86 до 141% от среднего урожая в зависимости от метеорологических условий, почвы и других факторов, способных удлиннять или укора-чивать онтогенез картофеля. Все это, по мнению автора, свидетельствует о высокой экологической пластичности картофеля и о возможности управлять прохождением его онтогенеза для получения высоких урожаев.

Главный этап онтогенеза для формирования урожая у растений картофеля - этап замедления роста надземной части и начала дифференциации тканей столонов в клубни. В этот период усиливается приток питательных веществ к формирующимся клубням /129/. Необходимость остановки прироста вегетативной части - ботвы - в этот период доказывает тот факт, что при химической обработке её, вызывающей легкий ожог, например, раствором солей фосфора, служащим одновременно и удобрением, за счет более ранней остановки роста ботвы ускоряется скороспелость растений картофеля и повышается урожай в условиях полевого опыта /68/. К сожалению, автор не вскрывает в своей работе физиологических причин, вызвавших раннюю скороспелость и повышение продуктивности, и не говорит о том, совпадает ли ожог ботвы с началом закладки клубней. Аналогичные данные получены при обработке ботвы картофеля ретердантами или этилен- *^} Лорх А.С, 1968, с. 14. продуцирующими веществами. В этом случае искусственная остановка роста надземной части растений приводила к увеличению числа клубней или их массы /180, 181, 182/.

Растительный организм представляет собой целостную систему с четко определенными внутренними связями. Поэтому факторы, определяющие столоно- и клубнеобразование запрограммированы физиологически в самом растении. Процесс этот достаточно сложный и поэтому целая совокупность событий должна приводить к перестройке транспорта ассимилятов в клубни вначале их закладки /150/. Природа клубнеобразования изучена недостаточно, поэтому исследование факторов, определяющих этот процесс, очень важно для понимания физиологии картофеля.

На основании экспериментальных данных можно говорить о способствующем или задерживающем влиянии различного рода удобрений /114, 116, 81, 41, НО, 30 и др./ на онтогенез растений и процесс и клубнеобразование, в частности. Аналогичное влияние оказывало изменение влажности почвы и её механический состав. Так, повышение влажности почвы до 85% от полной полевой влагоемкости приводило к снижению продуктивности картофеля в 2 раза /137, 138/. Ряд опытных данных указывает на формообразующее действие света на процесс клубнеобразования /101, 128/, а также на роль температурного фактора в регуляции этого процесса /129, 14, 159/.

В работах, проводимых, начиная с 30-х годов В.И.Разумовым, было показано, что для диких видов картофеля влияние длины дня является определяющим фактором в процессе клубнеобразования. Картофель - короткодневное растение и при выращивании его только на длинном дне целый ряд видов не дает клубней, происходит лишь обильное нарастание массы ботвы. Было отмечено, что при выращивании на длинном дне в ходе всего онтогене- за, растения картофеля сохраняли способность к цветению. Однако для Soa/7i//7? (/его$ш/.- вида, к которому относятся практически все культурные сорта, выращивание растений на длинном дне вызывало лишь задержку клубнеобразования на 7... 10 дней /128/. Автор пришел к выводу, что влияние короткого дня, вызывающего образование клубней, воспринимается листьями, которые и являются рецепторными органами. Возникающие при этом изменения представлялось возможным объяснить скорее с точки зрения гормональной теории, чем с помощью нарушения баланса питательных веществ. Исследуя устойчивость растений к пониженным температурам, удалось показать, что морозостойкость, являясь генетически запрограммированной для вида и сорта картофеля, может широко варьировать в зависимости от условий вы-ращивания /129/. Однако факторы, определяющие формирование клубней в условиях пониженной температуры,оставались совершенно не изученными.

В настоящее время широкое распространение получила гормональная теория развития растений, предложенная М.Х.Чайлахяном /156, 158/. Согласно этой теории зацветание и клубнеобразова-ние находится под контролем фитогормонов и непосредственно зависит от сочетания их различных концентраций /159/. В.И.Кефели полагает, что все процессы, связанные с ростом и развитием растений определяются поступлением фитогормонов в ткани, их биосинтезом и влиянием ингибиторов роста, метаболизм которых тесным образом связан с фитогормонами /53, 54, 55/. Все процессы дифференциации связываются только с регуляцией на клеточном уровне, причем эта регуляция является основой развития растения /18/. При таком подходе, однако, трудно объяснить влияние удобрений и, особенно, азота на органообразование, на резкое повышение продуктивности растений. Для картофеля это проявляется особенно наглядно, так как эта культура наиболее требовательна к обеспечению питательными веществами.

Согласно другой точке зрения трофический фактор и условия произрастания являются ведущими в процессе клубнеобразования. В частности, важность трофических факторов подчеркивал А.В.Пе-тербургский /109/. Влияние минерального питания и интенсивности фотосинтеза на клубнеобразование изучено достаточно хорошо /40/. Экспериментально показано, что для начала клубнеобразования очень важно накопление углеводов в нижней части стебля. При улучшении условий азотного питания за счет более интенсивного роста ботвы в начале онтогенеза увеличивается содержание растворимых Сахаров в нижней части стебля, что вызывает ускорение процесса клубнеобразования. Для получения хорошего, качественного урожая необходимо, чтобы высокая продуктивность фотосинтеза и высокие суточные приросты сухого вещества были направлены на формирование клубней. Важно, чтобы наиболее полно проходили фазы онтогенеза и сроки их не были растянуты. При полном завершении этих процессов 80-90% всех продуктов фотосинтеза сосредотачиваются в клубнях. Исходя из этого положения, ведущую роль в клубнеобразовании будет играть транспорт асеимилятов, и, главным образом, его направление в связи с изменением аттрагирующего центра. Так, в фазу интенсивного роста таким центром будет конус нарастания, в котором интенсивно идут процессы роста и дифференцировки клеток, закладка новых органов /23/, а при закладке клубней происходит возникновение нового аттрагирующего центра, который притягивает ассимиляты /76/ в зависимости от потребности запасающей части растения.

Интенсивность фотосинтеза не одинакова по ярусам листьев.

Показано, что максимальной она будет в листьях 2...4 ярусов растений картофеля, а минимальной - ниже 8 яруса. Повышение интенсивности фотосинтеза зависит от процессов, связанных с ускорением вывода из листа растворимых углеводов, усилением оттока и превращением растворимых углеводов в неподвижную форму - крахмал. Таким образом, накопление ассимилятов в нижней части стебля может служить итогом фотосинтетической активности растения картофеля и являться, в связи с этим, внутренним стимулом клубнеобразования /30/. Интенсивное клуб-необразование совпадает с окончанием роста стеблей, перераспределением транспорта ассимилятов в пользу закладывающихся клубней и, следовательно, может регулировать трофическими факторами.

Согласно целому ряду работ начало клубнеобразования непосредственно не связано с действием ауксина и гиббереллина /159/. Однако, показано, что этот процесс регулируется при участии каких-то физиологических факторов. В частности, роль этих факторов могут играть цитокинины или ингибиторы роста типа абсцизовой кислоты, которые будут вызвать торможение роста столона и ускорять его дифференцировку /157, 159, 136, 56/.

С нашей точки зрения нельзя в объяснении процессов клубнеобразования придерживаться какой-либо одной теории, так как это не объясняло бы всех полученных данных. Очевидно, правильнее будет говорить о разных уровнях регуляции, которые тесным образом связаны между собой и совокупным результатом работы которых является прохождение всего онтогенеза растения, его продуктивность. Такую систему очень подробно рассматривает в своих работах В.В.Полевой, указывая на тесную связь трофической регуляции с гормональной на уровне целых клеток. Тогда как ниже по иерархии располагается уровень генной регуляции и регуляции активности ферментов - такие способы регуляции возможны на уровне мембранных систем и макромолекул /118,120/. Все эти процессы происходят в столоне в начальный момент клубнеобразования. С помощью регуляторных процессов на разных уровнях организации можно объяснить остановку роста столона и начало дифференцировки его тканей в ткани клубня.

Показано, что условия питания, являются важным, но не единственным фактором, определяющим закладку новых органов /29, 153/. Следует учитывать, что важную роль в дифференци-ровке тканей буцет играть создание градиента факторов, которое может быть обусловлено условиями питания /23, 24/, фито-гормонами /158, 159/, условиями произрастания /30, 136/.Диф-ференцировка клеток и тканей имеет в своей основе перестройку метаболических систем, которая индуцируется этим градиентом. При такой перестройке в растущих клетках могут синтезироваться ферментные системы а& novo за счет генной регуляции или активироваться уже имеющиеся ферментные системы за счет активаторов или снятия действия ингибиторов. Второй механизм распространен более широко /152, 153/. В частности, хорошо интерпретируемые данные по изменению активности ферментных систем превращения перекиси водорода в связи с дифферен-цировкой, старением или воздействием неблагоприятных условий внешней среды получены рядом авторов /200, 136, 170, 171/.

Суммируя приведенные данные, можно заключить, что сложный процесс клубнеобразования регулируется и гормональными, и трофическими факторами. Само клубнеобразование представляет собой процесс, в основе которого лежат перестройки метаболизма на молекулярном уровне, изменение транспорта ассимиля- тов в целом растительном организме в связи с возникновением нового аттрагирующего центра - клубней.

1.2. Влияние азота на продуктивность картофеля и механизм его действия в растении

Проблема азота в земледелии является одной из важнейших проблем в сельскохозяйственной науке. Особая роль этого элемента определяется тем, что он входит в состав белков и нуклеиновых кислот. Проблема азотного питания существенна еще и потому, что большинство почв бедно азотом, а почва - основной источник азота для растений /126/. Поэтому глубокий теоретический интерес исследований обмена азотсодержащих веществ в растениях сочетается с большим практическим значением.

Органический азот становится доступным для растений только после предварительной его минерализации. Основными же формами азота, доступными для растений, являются аммонийный и нитратный азот. Из органических.форм азота усваивается непосредственно лишь мочевина, аспарагин и глутамин, т.е. лишь те органические соединения, которые способны легко отщеплять аммонийный азот /66/. Показано, что из трех важнейших элементов минерального питания растений - азота, фосфора и калия - наиболее дефицитным является именно азот. Поэтому в результате внесения его в почву урожаи сельскохозяйственных культур увеличиваются в 2...2,5 раза. Особенно чувствителен к внесению азотных удобрений - картофель /НО, 41/. Лучшими азотными удобрениями являются аммонийные и нитратные соли и различные их комбинации, например, нитроаммофоска и карбомвд. Одним из лучших удобрений, содержащих доступный растениям азот, наряду с этими, является навоз. Он сравнительно медленнее разлагается в почве, растворимые соединения азота, образующиеся из него в результате жизнедеятельности аммонифицирующих бактерий, поступают в почву постепенно и вымываются из неё медленнее, чем при удобрении хорошо растворимыми минеральными соединениями азота /107/.

При усвоении растением неорганического азота он сразу же должен включаться в органические соединения. При усвоении нитратного азота происходит его восстановление до аммиака, которое представляет собой ряд ферментативных, последовательных окислительно-восстановительных реакций /66, 47, 94/. Аммиак, поступивший в корневую систему растения из почвы или восстановленный из нитратов, далее включается в первичные аминокислоты /аланин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота/ и амиды /аспарагин и глутамин/. Показано, что азот аммонийных солей, поступивший в корневую систему уже в корнях может включаться в амидные группы глутамина и аспарагина. Таким образом, создается пул запасных аминокислот и амидов, которые обезвреживают аммиак. Восстановление нитратов может идти в стебле и в листьях растения. Причем, для травянистых растений большую роль в восстановлении нитратов играют листья /66/. Согласно современным данным, корни растений играют более важную роль в ассимиляции неорганических ионов азота, чем в восстановлении нитратов. Основное количество нитратов восстанавливается в листьях растений /176/.

Известно, что при урожае 300...340 ц/га при сухой массе 22$ клубни картофеля содержат 0,39$ азота, 0,14$ фосфора и 0,59$ калия, а ботва при сухой массе 17% содержит 0,37% азота, 0,15% фосфора и 0,82$ калия /125/. Приведенные данные характеризуют картофель как наиболее калиелюбивую культуру. Однако, показано, что азот играет даже большую роль в формировании продуктивности картофеля, чем калий. Так, внесение азот- ных удобрений на ранних этапах онтогенеза вызывает ускорение роста ботвы и, в дальнейшем, увеличение урожаев в большей степени, чем внесение калия /41/.

Поступление азота и калия в растение картофеля теснейшим образом взаимосвязано. Особенно остро это проявляется при внесении аммонийного азота в качестве удобрения, когда недостаток калия не позволяет переводить его в органическую форму. Это может приводить к накоплению аммиака в тканях, что оказывает токсическое действие на растение /147/. Хотя фосфор не является таким лимитирующим элементом питания растений, как азот и калий, его поступление в растение также тесно связано с поступлением азота, как и поступление калия /143/.

В настоящее время, в связи с интенсификацией сельского хозяйства вносятся все большие дозы органических и минеральных удобрений. Так, если раньше общепринятой дозой считалась л/б0*40-60%0-90' ^{т0 сейчас} эффективной дозой удобрений при выращивании картофеля считается 135 кг действующего вещества /vPK на I га при внесении 60 т/га торфонавозного компоста /19/. Однако влияние повышенных доз удобрений, и, особенно, азотных удобрений, на растения остается недостаточно изученным. Следует отметить и тот факт, что именно изучения влияния повышенных доз азотных удобрений поможет глубже понять механизм действия азота в растении, его влияния на продуктивность и качество, механизм который в настоящее время остается не ясным, несмотря на значительное количество работ, посвященных этому вопросу.

Целый ряд факторов участвует в регуляции минерального и, в частности, азотного питания растений. Интенсивность поглощения ионов пропорциональна их концентрации в водной пленке, окружающей корни. Поэтому, по мере снижения влажности почвы, когда все более ослабевает контакт между отдельными микро-каппилярными скоплениями влаги, доля диффузии в снабжении азотом будет падать, а доля направленного движения почвенного раствора - возрастать. Большое влияние на поглощение азота из почвы оказывает температурный фактор, так как температура влияет как на диффузионные процессы, так и на направленные потоки ионов в почве. Кроме того, при пониженной температуре тормозится активный транспорт ионов, который осуществляется с помощью переносчиков /39, 121, 33/. Показано, что пониженная температура связана с изменением активности ферментов, участвующих в усвоении азота корнями растений. Это является одной из причин снижения уровня поступления азота в растения при низких температурах и заморозках /6/.

Направленное движение воды связано с транспирацией растений, поэтому усиление транспирации является одним из путей интенсификации снабжения азотом почвенного раствора. Следовательно, у высших наземных растений должна существовать система, способствующая приведению в соответствие уровней светового и азотного питания /70/. В случае недостаточного высокого уровня светового питания, когда синтезируется минимальное количество углеводов, надземная часть растения конкурирует за них с корневой системой - углеводы являются лимитирующим фактором. В случае недостатка азота затруднено поступление его к листьям, что способно вызвать азотное голодание. Азот при такой ситуации является лимитирующим фактором. Только существование между надземной и подземной частями растения динамического равновесия обеспечивает оптимизацию всех синтетических процессов в организме за счет перераспределения потоков метаболитов /76/.

Кроме систем регуляции всего минерального питания на уровне целого организма, существуют системы регуляции на клеточном и тканевом уровнях. Основную роль здесь играют мембраны и мембранные потенциалы. Поглощение анионов и катионов за счет механизмов активного транспорта может регулироваться рН среды /64/. Именно на этом уровне может проявляться действие фитогормонов, как факторов регуляции ионных потоков /150 /. Регуляция усвоения азота растением идет и на ферментативном уровне. Так, показателем усвоения азота, наряду с накоплением биомассы, нитратов, уровнем содержания азота в растении в целом, может являться и активность нитратредуктазы, которая тесным образом связана с поступлением нитратов и их восстановлением в растении /83/.

В литературе можно встретить указания на то, что картофель, по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами, потребляет из почвы значительно больше питательных веществ. Такое потребление элементов питания вызвано тем, что при среднем урожае с I гектара картофеля получают в 3 раза больше углеводов, чем с I гектара озимой пшеницы /109/. Это обстоятельство позволяет отнести картофель к наиболее требовательным культурам к питательным веществам почвы.Кроме того, объем почвы, занимаемой корневой системой картофеля в 1,4 раза меньше, чем у ячменя, и в 2,2 раза меньше, чем у сахарной свеклы /132/.

Согласно данным, полученным рядом авторов /152, 137/, между потреблением картофелем основных элементов минерального питания и урожаем клубней не удается выявить достаточно строгой зависимости. При урожае 404,9 ц/га могло быть исполь- зовано в два раза меньше азота, чем при создании урожая 199,1 ц/га. Это зависело, прежде всего, от условий года,плодородия и агротехники поля. Следует учесть, однако, что эти данные получены только для урожая клубней, а химический анализ ботвы в этих работах не приводится. Поэтому строгих выводов на основании приведенных данных делать нельзя / 137 /. Коэффициент использования азота растением картофеля сорта Гатчинский колебался в зависимости от погодных условий от 40,7 в 1980 году до 66,4 в 1978 году /138/. Показано, что практически при любых урожаях картофеля потребление калия в два раза превышает потребление азота и в четыре раза потребление фосфора. Избыток же отдельных элементов питания может оказьшать такое же вредное действие, как и их недостаток /30/.

Можно заключить, что вынос минеральных элементов из почвы растением картофеля - величина нестабильная, так как она зависит от многих условий, связанных с ростом и развитием растений.

Существовала точка зрения, что картофель в начальный период онтогенеза не нуждается в элементах питания, так как они в достаточном количестве находятся в материнском клубне. В настоящее время показано, что в первый период развития -период интенсивного роста и бутонизации - картофель более чувствителен к условиям минерального питания /114, 41/. Существенное влияние на рост и развитие растений в этот период оказывает азот. Растения с оптимальным уровнем азотного питания формировали мощный листовой аппарат и, в дальнейшем, давали высокий урожай клубней с максимальным содержанием крахмала. Раннее развитие листового аппарата очень важно, так как, чем быстрее он формируется, тем более высокую про- дуктивность фотосинтеза можно получить за вегетацию /99/.

Показано, что основные элементы минерального питания и, особенно, азот способны оказывать влияние на динамику накопления зеленых пигментов фотосинтетического аппарата в листьях растений картофеля и ряда других культур. Влияние это удается проследить в ходе всего онтогенеза. Оптимальные дозы азота способны резко увеличивать содержание хлорофилла в период интенсивного роста и бутонизации, тогда как повышенные дозы азотных удобрений или азотное голодание - снижать его /162, 127, 30/.

Для картофеля четко показана зависимость между поступлением азота в растение и содержанием углеводов и органических кислот в тканях. Особенно ярко эта зависимость проявляется в начальные периоды онтогенеза. При выращивании в условиях гидропоники эту зависимость удается проследить и в более поздние периоды онтогенеза - цветение, дозревание клубней /26/. Связь между азотным и углеводным обменом обнаруживают и другие авторы /114, 41/. Так, с увеличением норм азота относительное содержание углеводов существенно снижается, а абсолютное увеличивается. При внесении высоких норм азотных удобрений синтез углеводов является фактором, лимитирующим урожайность.Такая зависимость характерна не только для растений картофеля, а оказывается общей для всех сельскохозяйственных культур /163/.

То, что азотное питание имеет наибольшее значение в начальные этапы онтогенеза, подтверждает факт, что внесение азота после бутонизации не оказывает существенного влияния ни на скорость онтогенеза в целом и прохождение отдельных его этапов, ни на продуктивность растения /8, 22/. Следовательно, можно говорить о критическом периоде для растений картофеля по отношению к азоту. Этот термин можно ввести по аналогии с критическим периодом в жизни растений по отношению к температурному фактору /17, 16/. Таким критическим периодом по отношению к азоту у картофеля является фаза интенсивного роста надземной части растения - начало фазы бутонизации. В первую очередь, это будет определяться тем, что при внесении азота под картофель уже в начале онтогенеза способно влиять на формирование мощного листового аппарата, что является основой формирования урожая /100/. После бутонизации, когда рост надземной части прекращается, азот перестает существенно влиять на урожай, и внесение его в этот период не вызывает заметного увеличения продуктивности картофеля /41/. Интенсивность клуб-необразования также будет определяться в первую очередь дозами азотных удобрений, причем высокий уровень азота способен задерживать клубнеобразование. Здесь нагрядно проявляется,так называемая "азотфлоральная" реакция, которая заключается в том, что азот способен сдерживать зацветание у растений, особенно при внесении его в больших количествах. Для картофеля это выражается в том, что азот резко удлинняет вегетативный рост ботвы и затрудняет или полностью снимает остановку её роста, все фазы онтогенеза замедляются и процесс клубнеобра-зования тоже. Азот, таким образом, является мощным фактором управления онтогенезом растений. Он может влиять на скорость роста и дифференцировки клеток и закладку вегетативных и репродуктивных органов /82, 23/. При недостатке азота происходит изменение ультраструктуры клеток, особенно в корнях растений /86/, которое может приводить к изменению потоков ассимилятов в проводящих тканях /10, 172/.

Азот сильно влияет на скорость роста молодых листьев растений. Причем, показано, что низкое содержание азота в почве приводит к недостаточному росту листьев, а его избыток - к общему подавлению роста растения. Все угнетение роста в этом случае происходит вследствие депрессии роста в дневное время /203/. Недостаток азота может вызывать дефицит гидролитических свойств в корне, что неизбежно приводит к изменению водного потенциала, нарушению движения воды через клеточные стенки. Кроме того, поступление азота в растения способно изменять разность потенциалов не только в вегетативных органах, но и в генеративных, в колосе пшеницы, например. Причем, возникновение разности потенциалов в колосе при внесении азотных удобрений определяет скорость поступления азота в формирующееся зерно и, таким образом, определяет урожай /139/.

На молекулярном уровне важнейшую роль в метаболизме азота играют ферментативные системы, связанные с синтезом амидов и моноаминодикарбоновых аминокислот. Регуляция активности таких ферментных систем, как глутаминсинтетазной и аспарагининсинте-тазной,происходит или с помощью концентрации поступающих форм неорганического азота и накопления аспарагиновой и глутамино-вой кислот,или за счет накопления амидов. Первый механизм обес' печивает активацию ферментных систем, а второй - ингибирование на уровне субстратной регуляции активности ферментов /48, 42, 183/.

Важной проблемой, связанной с поступлением азота в растение, является изучение перераспределения его между отдельными органами. Так, показано, что в молодых растениях фасоли содержание меченных нитратов оказалось более высоким в молодых листьях, по сравнению со старыми. Такое распределение посту- пающего азота связано, по-видимому, с различной интенсивностью транспирации и, следовательно, с различной скоростью притока по ксилеме питательных веществ. Уже из листьев происходит перераспределение меченных атомов в другие органы растения, причем, преимущественно они поступают в точки роста /190/. Полностью меняется характер накопления нитратов в период закладки генеративных органов. Так, для растений сои показано, что в период образования бобов происходит мобилизация азота из листьев и его накопление в завязывающихся бобах. При этом снижается содержание азота и даже масса вегетативных тканей растения /209/.

Проблема азотного питания растений изучается сейчас достаточно широко. Это связано, в первую очередь, с важностью азота для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур. Роль азота в получении программированных урожаев исследуется достаточно полно /145/. Разнообразны методы, привлекаемые для изучения этой проблемы. Так, среди новых методов изучения азотного питания растений можно отметить создание имитационных моделей динамики азота в растении, которые нашли свое применение в решении задач по программированию урожаев /93/.

Суммируя все вышесказанное, следует заключить, что существует два основных направления изучения азотного питания растений. Одно - на уровне целого организма, охватывает вопросы, связанные с продуктивностью растений, прохождением этапов онтогенеза, формированием фотосинтетического аппарата, органогенезом и т.д. Другое - на уровне молекулярных перестроек, связанных с поступлением азота, регуляцией его метаболизма. Существует целый ряд работ» указывающих на синтез белка, как итоговый эффект реакции растений на обеспеченность солями азо- та /116, II, 83, 114 и др./. К сожалению, в научной литературе практически отсутствуют работы, связывающие перестройки на молекулярном уровне, синтез белка в зависимости от поступления азота в растение с физиологической реакцией растений на условия азотного питания. Именно в этом направлении, по нашим представлениям, следует искать закономерности формирования продуктивности сельскохозяйственных культур и влияния на неё азота. Особенно существенно изучение онтогенеза в целом для понимания механизмов, регулирующих закладку и формирование продуктивных частей растения и роль минеральных удобрений в этих процессах.

1.3. Обмен белков в растениях и его изменение в ходе онтогенеза. Влияние азотных удобрений на белковый обмен

Все основные свойства и функции организма фактически обусловлены свойствами и функциями белков. На их свойствах основаны молекулярная организация протоплазмы, обмен веществ, реакции на внешнее воздействие и т.д. Через белки реализуются генетические функции нуклеиновых кислот и морфогенных процессов. В последнее время интерес к проблеме растительных белков возрос в связи с тем, что это основной источник белкового питания человека и животных. Развитие фундаментальных исследований в области молекулярной биохимии и генетики растительных белков, изучение механизмов генетического контроля их биосинтеза и распада совершенно необходимо для интенсификации производства растительного белка, улучшения его качества и кормовой ценности /60, 63/.

Многообразие функций, выполняемых в растениях белками, свидетельствует об особой роли этой группы азотсодержащих ве- ществ в метаболизме растения в целом. При ассимиляции иона аммония переход азота из неорганической формы в органическую необходимо происходит за счет образования аминокислот и их амидов. Показано, что аммиак выполняет регулирующую роль в метаболизме азота в растениях, но,в первую очередь, его влияние проявляется при регуляции белкового обмена /47, .66/.

Белки растений неоднородны по составу, они различаются по молекулярной массе, растворимости, подвижности в электрическом поле, функциональному назначению и т.д. Показано, что возникновение стрессовых ситуаций,в первую очередь,вызывает изменения в обмене водорастворимых белков. При этом меняется как количественное их содержание, так и количество отдельных фракций /199/. Это обстоятельство представляет особый интерес для исследователей, так как большинство ферментов растений относится к водорастворимой или "альбуминоподобной" фракции /194, 27/. Существуют данные, что не только водорастворимые белки изменяются в ответ на действие внешних факторов. Так, показано, что при изменении условий азотного питания изменяется аминокислотный и фракционный состав средне- и труднорастворимых белков у некоторых злаков /67/.

Содержание белка в картофеле, особенно в клубнях, невелико. Так, содержание сырого протеина в клубнях колеблется в пределах 1,74-2,35% в зависимости от условий произрастания и сорта картофеля, а в ботве от 2,08 до 4,10% /123/. Однако, учитывая долю картофеля в пищевых рационах, он может являться основным источником белка. Это особенно существенно для рационов сельскохозяйственных животных. Белки картофеля наиболее полноценны из всех растительных белков; из незаменимых аминокислот, в них содержится наибольшее количество лизина, вали- на, фенилаланина, лейцина. Только метионин содержится в белках картофеля в незначительных количествах /30/.

Обмен азота в растении, его поступление и накопление, как в виде органического, так и неорганического азота, теснейшим образом связано с обменом белков. Так, с повышением дозы вносимого азота, увеличивается содержание общего и белкового азота, свободных аминокислот сначала в вегетативной части растения, а потом и в продуктивной. Для целого ряда сельскохозяйственных культур, однако, таких как кукуруза, пшеница, рожь,картофель, показано, что внесение высоких доз азотных удобрений способно подавлять синтез белка, что отрицательно сказывается на продуктивности растений и качестве получаемой продукции /78, 114, 116, 41, 30, 183, 23, 25 и др./. Фосфор и калий также способны влиять на белковый обмен, хотя это влияние менее выражено. Так, для картофеля показано, что пониженный уровень калия снижает отношение . небелковый' ^{внесение} К даже после бутонизации приводило к увеличению содержания белкового азота. Однако азот оказывал более выраженное влияние. Это позволило авторам заключить, что азот в большей степени способен влиять на продуктивность картофеля, чем калий, хотя картофель - наиболее калиелюбивая культура /116, 41/.

Внесение азотных удобрений оказывает сильное влияние и на динамику Сахаров. Отношение _мон^|_ра ^и cax^f ^в03" растает по мере созревания клубней картофеля. При недостатке фосфора и, особенно, калия оно может резко снижаться. Приведенные данные указывают на важную роль калия в синтезе олиго-и полисахаридов /114/. При недостатке азота можно наблюдать такую же зависимость. Однако уменьшение содержания общего крахмала в этом случае происходит опосредовано, за счет ослаб- ления ферментных систем в сторону снижения синтетических процессов /41/.

Растения и, в особенности, листья характеризуются определенным содержанием белков, изменяющимся в зависимости от возраста листьев и самого растения, условий питания, внешней среды и других факторов. Для озимой пшеницы показано, что интенсивность обновления белкового азота зависит от степени водо-обеспеченности растений. Недостаток воды в листьях может вызывать усиление распада белка по сравнению с его синтезом /143/. Синтезу белка в листьях свойственна периодичность, которая определяется эндогенными причинами. Во время нормального вегетативного роста быстрый синтез и накопление белка обычны для молодых растений. В начале онтогенеза интенсивность биосинтеза белка увеличивается и остается какое-то время на максимальном уровне, а затем, по мере старения листьев, снижается и, одновременно, снижается общее содержание белка в них /142/. У картофеля снижение содержания белка в ботве происходит к фазе цветения /8, 30/. Эти данные хорошо согласуются с тем фактом, что критическим периодом по отношению к условиям азотного питания у растений картофеля является период интенсивного роста - начала периода бутонизации, так как внесение азота после бутонизации не оказывает существенного влияния ни на белковый обмен, ни на продуктивность картофеля. Синтез белка, таким образом, тесно связан с условиями азотного питания. Подход к синтезу суммарного белка, как итоговому эффекту реакции растений на условия азотного питания позволяет глубже понять молекулярные механизмы усвоения азота растением /II/ и связать возникающие изменения с ходом всего онтогенеза.

Условия азотного питания оказывают влияние не только на- содержание белка, но и его качество. Так, при недостатке азота может снижаться содержание таких незаменимых аминокислот, как лизин, аргинин, валин, резко снижается содержание глута-миновой и аспарагиновой кислот и их амидов /116/. Ряд авторов указывает, что наиболее сильное влияние азотное питание оказывает на пул свободных аминокислот. Причем, при недостатке азота в первую очередь снижается содержание незаменимых аминокислот /104, 208 /. Для картофеля это особенно существенно, так как показано, что новообразование аминокислот и амидов может происходить у него не только в надземной части, но и в клубнях /116/, что оказывает существенное влияние на все процессы, связанные с клубнеобразованием. Эти данные подтверждаются опытами с применением меченных атомов. Показано, что у растений существует два пула свободных аминокислот: один - непосредственные предшественники белка, второй - запас свободных аминокислот. Первый пул очень ограничен и быстро метаболизи-рует, а второй - формируется, в первую очередь, за счет поступления азота извне /188/. В ходе онтогенеза может изменяться скорость включения азота в те или иные аминокислоты. В период прорастания семян ячменя азот включается во все аминокислоты с примерно одинаковой скоростью, а в фазу колошения -преимущественно в глутаминовую кислоту и глутамин /211/. Можно сделать вывод о том, что количество и качество белка в растении зависит от формы, способа и времени корневой и внекорневой подкормки азотом.

Белковый обмен связан с регуляцией роста у растений. Так, с возрастом изменяется фракционный состав белка, активность целого ряда ферментов /20/. Важнейшим показателем этого обмена является активность протеолитических ферментов - пептид- гидролаз. Внутриклеточный протеолиз можно назвать инструментом, регулирующим различные стороны метаболизма клетки. Про-теазы участвуют в различных внутриклеточных процессах таких, как созревание белков, связанное с отщеплением аминокислот или пептидов, характерное для белков мембран, инактивация или модификация биологически активных белков, специфическое разрушение дефектных белков, регуляция уровня белков и снабжение аминокислотами и энергией в условиях голодания и диффе-ренцировки и т.д. Деградация внутриклеточных белков может осуществляться лизосомным и нелизосомным путем. Лизосомы осуществляют деградацию экзо- и эндогенных белков на уровне клеточных мембран, при этом протеолиз идет с помощью кислых пеп-тид-гидролаз /173/. Внелизосомный путь деградации белковых молекул осуществляется за счет специфических нейтральных пеп-тид-гидролаз, локализованных в протоплазме. Причем, уровень их активности может регулироваться по принципу обратного ин-гибирования продуктами реакции /184/.

В растениях пептид-гидролазы содержатся как в вегетативных органах, так и в покоящихся и прорастающих семенах.Пептид-гидролазы растений могут быть разделены на две основные группы по отношению к субстрату: протеиназы - ферменты, расщепляющие пептидные связи в молекулах белков с большим молекулярным весом, и пептидазы, расщепляющие пептидные связи в молекулах пептидов. Наиболее изучены в настоящее время ферменты, относящиеся к первой группе /97, 124/.

Большое количество работ советских и зарубежных ученых за последние 20 лет было посвящено выделению пептид-гидролаз в чистом виде, изучению их свойств, строения активного центра, механизму катализа. В этом направлении достигнуты значи- тельные успехи. В частности, была раскрыта структура активного центра папаина и ферментов, сходных по типу катализа, которые получили название папаиназ. Установлена роль спиралей в этом активном центре с помощью метода молекулярных орбит /175, 167, 9, 97/.

Вторым большим направлением работ является изучение динамики мобилизации запасных белков при прорастании семян. Это направление очень интересно и перспективно, так как позволяет подойти к пониманию регуляции активности этих ферментов на организменном уровне, выявить общие механизмы активации. Резкая активация протеаз в первые 2...4 дня прорастания в зависимости от изучаемой культуры, отмечалась всеми исследователями /96, 97, 195, 45, 174, 168 и др./. Большое внимание уделялось изучению функций отдельных групп гидролитических ферментов, их кооперативных активностей, включения их на отдельных этапах прорастания семени, выявления механизмов,контролирующих активность этих ферментов и, особенно, роль осевых органов в регуляции их активностей. Показано, что мобилизация запасных белков осуществляется целой группой пептид-гид ролаз, как кислого, так и основного характера /198, 194,174, 46, 45/. Так, первые два дня у проростков кукурузы можно наблюдать лишь общую деградацию запасных белков и их переход в альбумины и глобулины. Лишь после этого наступает полный распад всех белковых фракций запасных белков, причем скорость этого распада определяется исключительно величиной протеоли-тической активности. Через 2,5...3 дня протеолиз замедляется /195/. Динамика активности пептид-гидролаз в ходе прорастания кормовых бобов носит также неравномерный характер. Так, при рН 5-6 наблюдается её медленное возрастание до восьмого дня, затем - резкое повышение активности кислой протеазы. В этот период происходит наиболее существенная модификация белков, которая необходима для облегчения их мобилизации /188/.

В прорастающих семенах сосны обнаружено четыре основных группы пептид-гидролаз с помощью ингибиторного анализа.Активность их в эндосперме в 10...50 раз выше, чем в самих проростках. Показано, что кислые (рН 3,7) и нейтральные (рН 7,0) протеазы принимают участие в мобилизации запасных белков /193/. Содержание протеаз в эндосперме прорастающих семян не зависело от наличия осевых органов зародыша. Однако осевые органы оказывали решающее влияние на величину активности этой группы ферментов. Особенно сильно это влияние на 3...4 день прорастания, что позволяет ряду авторов отводить зародышу решающую роль в регуляции активности пептид-гидролаз на ранних этапах прорастания семени /169, 196/. С другой стороны, регуляция активности ферментов в этих условиях может происходить не только в зависимости от осевых органов зародыша, но и являться результатом регуляции на уровне продуктов реакции. Такая регуляция может осуществляться по принципу обратной связи вследствие накопления аминокислот и пептидов в эндосперме прорастающего семени /194/. Если в первые 3...5 суток возрастает общая активность пептид-гидролаз, то впоследствии она снижается, но увеличивается специфическая активность отдельных групп этих ферментов /168/.

Рассмотренные механизмы регуляции относятся, в основном, к процессу деградации белков. Внутриклеточный протеолиз изучен совершенно недостаточно. Сульфгидрильные, сериновые, кислые, металлоэндо- и металлоэкзопептидазы и многие другие - все эти пептид-гидролазы находятся внутри растительной клетки. Они играют роль не только в процессах мобилизации запасных белков, но и при старении клеток и внутриклеточных органелл, в механизмах дифференциации клеток и тканей, образовании ферментов из их предшественников. Указывают на особую роль внутриклеточных протеаз в механизмах, связанных с ответом на инфекцию, протеолиз при этом представляется основным ответом на внедрение инфекции /185/. На внутриклеточном уровне можно выделить три основных механизма регуляции активности пептид-гидролаз: во-первых, локализация ферментов внутри специальных структурных образований - лизосом, вакуолей, во-вторых, присутствие большого числа ферментов в форме зимогенов и, в-третьих, наличие внутри клетки специфических белков - ингибиторов протеаз. Данные, полученные целым рядом исследователей свидетельствуют, что третий путь регуляции является наиболее универсальным. Особенно четко он выявляется у злаков, пасленовых, бобовых. Ингибиторы, наряду с подавлением активности пептид-гидролаз, могут выполнять и другие функции, например, подавлять активность пептид-гидролаз насекомых и фитопатогенов и, таким образом, являться белковым компонентом иммунитета растений /94, 57, 206/.

Последние годы все более широкое распространение получили исследования, связанные с накоплением белка в зерновках растений в ходе онтогенеза, изменением его фракционного состава и динамикой цротеолитической активности в формирующихся генеративных органах /31, 32, 4, 23, 25 и др./. Появление этих работ связано с тем, что от изучения механизмов регуляции протеолиза на молекулярном и клеточном уровне необходимо на настоящем этапе перейти к изучению их динамики в онтогенезе целого растения и, особенно, этапа формирования органов и тканей.

Подробно* обсуждая органогенез, мы останавливались на ^Xj* том, что ведущая роль регуляции органообразования отводится в современной литературе гормональным факторам /159, 160/. Существует тесная связь между уровнем фитогормонов в тканях и активностью пептид-гидролаз в ходе дифференциации клеток. Так, ауксины могут менять активность пептид-гидролаз, вследствие их активной роли в экспорте протонов и изменении рН внутриклеточной среды. Показано существование тесной корреляции между влиянием ауксинов на приток протонов в корнях кукурузы, активностью нейтральных пептид-гидролаз и ростом растения /191/. Другие исследователи полагают, что гибберел-лины активируют протеазы, что и является первым звеном в запуске роста и дифференцировки. Пептид-гидролазы могут играть в этом случае роль индукторов специфической м-РНК /179/. Работы, выполненные на проростках фасоли показывают, что и ци-токинины могут принимать активное участие в регуляции протео-литической активности. Так, возрастание активности пептид-гидролаз в течение первых семи дней прорастания зависело от зародышевой оси. При её удалении, влияние зародыша можно было заменить добавлением кинетина или зеатина. Гиббереллины при этих условиях не оказывали стимулирующего действия на активность пептид-гидролаз /178/. Другие авторы показали,что гиббереловая и абсцизовая кислоты могут усиливать активность пептид-гидролаз в период между 2...5 днями прорастания зерен у пшеницы. Авторы полагают, что это звено физиологического контроля активности экзо- и эндопротеазной активности в проростках пшеницы /201/. Полагают, что фитогормоны способны образовывать комплексы с белками и нуклеопротеидами и влиять на рост и развитие растений через эти комплексы /84, 87/.

Показано, что индолилуксусная кислота может вызывать качественные изменения в спектре легкорастворимых белков в митохон-дриальной мембране колеоптелей яровой пшеницы, что, вероятно, обуславливает изменение оксидазной и фосфорилазной активности митохондрий. Следствием этого является изменение в энергетическом обмене клетки и организма в целом /80/.

Пептид-гидролазы играют важную роль в росте растений и дифференциации тканей. Э.Я.Хавкин полагает, что морфогенез растений сопровождается формированием новых ферментных систем, причем изменение активности целого ряда ферментов могут тормозить или ускорять процессы дифференцировки клеток /153/. Протеолиз макромолекул клеточных поверхностей может, в конечном счете, инициировать клеточные деления в меристеме /197/. Этот факт представляется особенно интересным, так как можно регулировать активность пептид-гидролаз за счет экзо- и эндогенных механизмов регуляции. Таким образом,можно регулировать и накопление числа клеток. Накопление же определенных чисел клеток связано с формированием органов /23/.

В растущих и стареющих клетках формирование метаболических систем может осуществляться за счет синтеза ферментов /151, 152/ или за счет активации уже имеющихся ферментных систем /45/.

Азот способен влиять на белковый обмен у растений и на активность пептид-гидролаз в разных органах растительного организма. Показано, что азотное голодание способно вызывать полную перестройку обмена белка в клетке хлореллы. Недостаток азота вызывает в этом случае резкую активацию пептид-гидролаз и ускорение реутилизации аминокислотного фонда /134/. У растений кукурузы и пшеницы при недостатке азота активность пептид- гидролаз также увеличивается. Причем, это увеличение активности наиболее четко проявляется на начальных этапах онтогенеза. Метаболизм растений, голодающих по азоту на ранних стадиях развития, значительно отличается от такового на поздних стадиях /207/.

Изучение суммарной активности и свойств протеолитических ферментов озимой пшеницы показало, что уже на ранних этапах созревания в колосе и в верхнем листе при различных условиях азотного питания обнаружены не только различия в уровне активности ферментов, но и имеются различия в качественном составе ферментов. Максимальной активностью обладают пептид-гидролазы в фазу формирования зерна, причем наибольшая активность в эту фазу наблюдалась у нейтральных и щелочных пептид-гидро-лаз. Впоследствии, проращивание семян, выращенных без удобрений и на удобренном фоне, показало, что удобрения оказывают влияние не только на формирование протеиназного комплекса, но и обладают последействием, определяя уровень протеиназной активности в процессе прорастания семян /112/.

Работы, проводимые на кафедре физиологии растений ЛСХИ, показывают, что активность протеолитических ферментов, особенно, нейтральных пептид-гидролаз, изменяется неоднозначно в ходе онтогенеза растений. Так, в конусах нарастания злаков она является максимальной в начальные фазы онтогенеза. В дальнейшем активность этих ферментов снижается. Важно отметить, что именно вначале онтогенеза активность нейтральных пептид-гидролаз в конусах нарастания четко коррелирует со скоростью роста и дифференциации тканей, с одной стороны, и с величиной дозы вносимых азотных удобрений, с другой /23, 24, 25/. Однако работ по этому вопросу в научной литературе не достаточно, и механизмы этих явлений остаются неясными до конца.

Все рассмотренные работы касались, в основном, зерновых и зернобобовых культур. Протеазы картофеля изучены в настоящее время очень слабо. Показано, что клубни разных сортов картофеля содержат кислую протеазы (рН 4,6) и ингибиторы этого фермента. Отдельные сорта при этом различаются по количественному содержанию фермента и его ингибитора /186/. Однако роль этого фермента в белковом обмене не совсем ясна. Протеиназная активность в растениях картофеля изучалась и другими учеными /204/. Выявлено, что в листьях наибольшая суммарная активность приходится на кислые пептид-гидролазы. В щелочной области активность пептид-гидролаз оказалась несколько ниже. Однако взаимосвязь с онтогенезом и влияние внешних факторов на активность пептид-гидролаз картофеля в этих работах не рассматривается. Показана связь между накоплением общего азота и азота свободных аминокислот и активностью ряда гидролитических ферментов в тканях картофеля /211/. Показано, что между ними существует корреляция, и что активность гидролитических ферментов и оксидоредуктаз в меристематических тканях зависит от содержания в них общего азота.

Можно заключить, что взаимосвязь белкового обмена и условий азотного питания у растений картофеля изучена недостаточно. Не ясны механизмы, определяющие влияние азота на онтогенез растений, и, как следствие этого влияния, на продуктивность. Таким образом, остается разрыв между исследованиями, связанными с молекулярными механизмами регуляции белкового обмена, и исследованиями, связанными с изучением влияния факторов внешней среды, в том числе, и удобрений, на продуктивность картофеля и качество получаемой продукции. Мы в своей работе поставили задачу выявить связь между изменениями белкового обмена в различных органах растения картофеля, вызываемыми азотом и ходом всего онтогенеза и продуктивностью растения. Таким образом, в работе была сделана попытка объединить ор-ганизменный и молекулярный уровни исследования, что позволит значительно расширить понимание механизмов онтогенетического развития растений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Краткие сведения по систематике и биологическим особенностям картофеля. Характеристика сорта Гатчинский

Картофель относится к семейству Пасленовых -о&л&рЯі

РОДУ о ЗГ7М/Л , К СеКЦИИ 7Zer&riL//77 (jO^/7. ) St/A*. , т.е. клубненосов. Родоначальник всех европейских культурных сортов ЗоЛ1//77 Z-t/oes'DSL'/ri /_ чилийский вид по происхожде-нию /22/.

На родине картофель представляет собой многолетнее растение. Это растение с мочковатыми корнями и подземными побегами, образует клубни. Стебель высотой 0,5...1 метр, ветви слегка гранистые, стебли покрыты короткими прижатыми волосками, зеленые или окрашенные антоцианом. Листья прерывисто перистые с 7...II крупными долями, чередующимися с мелкими, снизу опушенные. Соцветие картофеля представляет собой сложный завиток, цветоножки сочлены близ сердцевины, чашечки с пятью лепестками, венчик белый или окрашен антоцианом. Столбики у основания сросшиеся, рыльце - головчатое. Плод картофеля - ягода, шаровидная, зеленая 1,5...2 см в диаметре /150/.

Одной из существенных особенностей биологии картофеля является фотопериодическая реакция. Генеративные органы образуются у картофеля в условиях длинного дня, в то время как уменьшение длины дня стимулирует клубнеобразование. Влияние фотопериодизма на рост главного побега картофеля имеет ту особенность, что в первые фазы его роста удлиннению стебля способствует короткий день, а, спустя 2...3 недели после появления всходов фотопериодический оптимум перемещается в условия длин -ного дня.Фотопериодическая реакция у картофеля определяется его видовыми особенностями. Следует подчеркнуть, что количе- ство листьев и побегов ветвления увеличивается с увеличением продолжительности дневного освещения. При закладке столонов число их не зависит от фотопериода, а определяется лишь генетическим потенциалом вида или сорта. В дальнейшем столоны в своем развитии, однако, также зависят от фотопериодической реакции растений. Реакция на клубнеобразование при более коротком дне сложилась у картофеля как филогенетический признак, связанный с особенностями его происхождения. Оптимальной для клубнеобразования является длина дня равная 12,5... 12 часам.

Картофель - растение очень чувствительное к погодным условиям, которые в значительной степени определяют его продуктивность. Так, в годы с более жарким летом ботва картофеля начинает отмирать на 2 недели раньше среднего установленного срока, а в годы с холодным летом - на 3...4 недели позже. Оптимальная температура для клубнеобразования I6...I8C. При температуре свыше 22С клубнеобразование отсутствует /69/.

Существенной биологической особенностью картофеля является наличие периода покоя клубней. Фактически этот период может наступать с начала клубнеобразования. Состояние покоя клубней определяется комплексом физических и биохимических условий, оно определяется рядом факторов окружающей среды. Продолжительность периода покоя может значительно варьировать в зависимости от вида картофеля /69/.

Сорт Гатчинский был выведен в Северо-западном НИИ сельского хозяйства группой авторов от скрещивания гибрида 382-48 с сортом Приекульский ранний / 49/. Районирован с 1969 года в 21 области, преимущественно в условиях Нечерноземья. Сорт столового назначения, имеет удовлетворительные вкусовые ка-

41 чества, урожайность высокая. Средняя урожайность достигает 20...24 т/га, а на сортовых участках - до 40...50 т/га.

Сорт пригоден для выращивания на разных типах почв, но наивысшие урожаи дает на хорошо окультуренных легких и средних суглинистых почвах. Отличается повышенной отзывчивостью на внесение удобрений. Наиболее высокие урожаи удается получать при внесении таких доз минеральных удобрений, как л/і20^РІ20^КІ80 ^_л/і50^РІ80^КІ80 ^на $^{не внесения б0 тонн} торфо-навозного компоста на I гектар. Доза удобрений /\/б0^б0^60 дает возможность получать урожай клубней 17,0 т/га. Картофель сорта Гатчинский устойчив к раку; фитофторой ботва поражается слабо, клубни - средней степени, в отдельные годы - сильно. Черной ножкой, микоспориозом и паршой обыкновенной поражается слабо, к вирусным болезням устойчив. Крупные клубни нередко затрудняют семеноводческую работу с сортом. Кожура клубней сетчатая, окраска белая. Клубни картофеля этого сорта имеют округлую форму. Мякость белая, не темнеющая при разрезке клубня. Глазки, расположенные на поверхности клубня, мелкие.

Куст растения картофеля сорта Гатчинский высокий, хорошо облиственный. Стебли зеленые, толстые, пигментация наблюдается только в пазухах листьев. Листья темно-зеленые, плотные, матовые, жилкование среднее. Доли и дольки листа стерженько-вые с вытянутыми кончиками и равными краями. Основание конечной доли - сердцевидное. Цветки - темно-красно-фиолетовые, с белыми кончиками. Чашечка пигментированная, остроконечия длинные. Пыльники ярко желтого цвета. Ягод этот сорт не образует.

Сорт Гатчинский был выбран для проведения эксперимента в связи с тем, что он наиболее широко районирован в Нечерноземной зоне и, особенно, в Ленинградской области. При применении современной агротехники этот сорт картофеля способен давать высокие урожаи. Благоприятна для решения поставленных в эксперименте задач высокая отзывчивость этого сорта на внесение минеральных удобрений. Для проведения вегетационных опытов большое значение имеет и высокая устойчивость картофеля сорта Гатчинский к различным болезням.

2.2. Методика закладки вегетационного опыта и уход за растениями

В работе были поставлены задачи: изучить влияние азота на белковый обмен в растениях картофеля, на прохождение онтогенеза, на продуктивность и качество получаемых клубней. В работе был использован вегетационный метод выращивания растений. Вегетационный опыт закладывался в сетчатом павильоне кафедры физиологии растений Ленинградского сельскохозяйственного института на малом опытном поле. Растения в сосудах помещали на специально сделанный стеллаж и постоянно в ходе вегетации перемещали вдоль и поперек стеллажа для выравнивания освещенности. Кроме того, сосуды с растениями регулярно поворачивали вокруг своей оси с этой же целью. При проведении вегетационного опыта создается возможность проводить более строгие наблюдения и регулировать воздействие таких факторов жизни и роста растений, как влажность, температура, освещение. При ведении полевых опытов дефицит или избыток какого-либо из перечисленных факторов не может быть устранен и способен вызвать резкое изменение полученных результатов опыта. В этом случае невозможно столь определенно говорить о действии какого-либо одного фактора. В нашей работе таким фактором был азот, поэтому только вегетационный опыт способен был дать необходимую чистоту опыта.

В вегетационном опыте выращивали растения картофеля в почвенной культуре. Растения выращивали на дерново-подзолистой легкосуглинистой почве. Агрохимическая характеристика использованной почвы в течение всех лет эксперимента приведена в табл.2.2.1. Так как картофель - культура особенно чувствительная к механическому составу почвы, для облегчения механическо- го состава перед набивкой сосудов почву смешивали с речным песком, предварительно отмытым, в соотношении 5:1. В течение всех лет опыта использовали выровненную по агрохимическим характеристикам почву.

Таблица 2.2.1

Агрохимическая характеристика дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы _{;гу- j} PH_KGI; ^{і % \}

Вегетационный опыт с почвенной культурой значительно отличается от полевого опыта. Так, для набивки вегетационных сосудов используется только верхний пахотный горизонт почвы ( горизонт А), в то время как в полевых условиях корни растений усваивают питательные вещества не только пахотного горизонта, но и подпахотного и более глубоких слоев (горизонт АВ). Следовательно, в вегетационном опыте количество питательных веществ, доступных корням растений меньше, чем в полевых условиях.Поэтому дозы вносимых удобрений на сосуд должны быть значительно выше. В вегетационном опыте принято вносить удобрения в средних дозах: hi - 0,35...0,75; Р₂0₅ - 0,3...0,5 и К0- 0,3...0,5 г на сосуд емкостью 5...8 кг почвы. При условном пересчете на І гектар доза 0,5 грамма действующего вещества соответствует 150 кг/га в поле /164/. По данным, приводимым другими авторами, для картофеля наиболее распространены дозы минеральных удобрений в I г действующего вещества на сосуд емкостью 6 кг почвы /41, 114, 30 и др./.

При постановке вегетационного опыта в качестве однократной нормы удобрений была выбрана доза, соответствующая I г действующего вещества Л/ , Р и К на сосуд емкостью 10 кг почвы. В настоящее время чаще приводится расчет доз удобрений на I кг почвы /164/. В нашем вегетационном опыте однократная норма удобрений соответствовала 100 мг действующего вещества на I кг почвы.

Опыт закладывали по следующей схеме: I вариант - контроль (без внесения удобрений), 2 - РК (фосфорно-калийный фон), 3 -А/₂РК, 4 - Л/₄РК, 5 - Л/₆РК, 6 - Д^РК, 7 - a/jqPK. Внесение столь высоких норм удобрений было вызвано спецификой поставленных задач: выявить изменения, возникающие в белковом обмене растений картофеля при действии азотных удобрений. Только высокие нормы удобрений способны были вызвать такие изменения. Вначале работы, в 1980 году мы закладывали вегетационный опыт по следующей схеме: I - контроль (без удобрений), 2 - РК (фосфорно -калийный фон), 3 -a/jPK, 4 -Л/₂РК, 5 -Л/₃РК, 6 -У₄РК, 7 - Л/р-РК. Однако, в этом случае различия в полученных результатах для растений соседних вариантов не были достаточно четкими. Продуктивность растений картофеля вариантов с внесением одно- и двукратной норм азотных удобрений различалась незначительно: 382,6 и 396,1 г на одно pacTemiej соответственно.Аналогичные данные были получены для вариантов с внесением трех-и четырехкратной норм азотных удобрений. Продуктивность растений этих вариантов была 287,9 и 304,4 г на одно растение,

46 соответственно. Поэтому в дальнейшем при постановке вегетационного опыта мы использовали схему, описанную ранее с внесением двух-, четырех-, шести-, восьми- и десятикратной норм азотных удобрений, так как она позволяла более подробно изучить влияние нормальных и повышенных норм азота на растения картофеля, выявить и изучить изменения в белковом обмене, вызванные внесением высоких норм азотных удобрений.

Все варианты опыта закладывали в восьмикратной повторнос-ти. При этом растения четырех сосудов использовали в ходе онтогенеза для анализов, а растания четырех оставшихся сосудов доводили до урожая. При выращивании растений картофеля по одному растению в сосуде рекомендуют шести - восьмикратную пов-торность использовать для получения урожайных данных /164/. Однако в этом случае полностью исключается взаимное влияние растений. Для картофеля возможно выращивать по два растения в сосуде /101/. Это вызвано тем, что корневая система картофеля занимает меньший объем, чем корневая система сахарной свеклы, кукурузы и других культур. Мы высаживали по два растения на один сосуд. Для создания при этом благоприятных условий роста использовали вегетационные сосуды большей емкости - на 10 кг почвы.

Для выращивания растений использовали металлические сосуды Митчерлиха с прорезью на дне и металлические поддонники, в которые собирались излишки влаги. При набивке сосуда прорезь на дне прикрывалась металлическим гребешком. Сверху помещали бумажный фильтр по диаметру немного больший, чем дно сосуда. Перед набивкой сосуда почву смешивали в эмалированном тазу с речным песком (соотношение 5:1) и удобрениями. Затем почву насыпали в сосуд постоянно утрамбовывая. Все сосуды перед набивкой были оттарированы. В сосуды при набивке вносили всю норму

47 удобрений полностью. Это было необходимо для изучения действия азота на ранних этапах онтогенеза.

Для посадки в сосуды использовали предварительно отобранные клубни картофеля сорта Гатчинский. Сортовые клубни картофеля первой репродукции получали в учхозе "Пушкинское". Средняя масса клубней, используемых для посадки была 85,99 г,средний диаметр - 54 мм. Число глазков на одном клубне, в среднем, составляло 8. Клубни для посадки отбирали округлые, ровные, чуть уплощенные, что вообще характерно для клубней картофеля сорта Гатчинский. Пигментация клубней, используемых для посадки в вегетационные сосуды, отсутствовала. Перед посадкой клубни проращивали на свету при температуре 20...23С в течение 17...20 суток. Посадка клубней в сосуды проводилась не позднее 20...23 мая.

Чтобы стебли растений во время роста не ломались, после наступления фазы цветения делали каркас из металлических прутьев с проволочными кольцами. В ходе всей вегетации сосуды поливали по массе, из расчета 70% от полной влагоемкости почвы, исходя из оптимальной влажности почвы. Полив растений проводился обычно один раз в день в ранние утренние или вечерние часы водопроводной водой. В случае продолжительных или сильных дождей в период вегетации полив проводился водой,собранной в поддонники, что позволяло избежать вымывания питательных веществ. Полученный урожай убирали при полном созревании растений. Для картофеля это соответствует началу отмирания ботвы. Обычно, уборка урожая проходила в период до 10 сентября.

2.3. Анализ растительных образцов и использованные методы анализа

Материал для анализа растительных образцов отбирали в ходе всего онтогенеза, в четыре срока, которые соответствовали: I - фазе интенсивного роста ботвы, 2 - фазе бутонизации, 3 -фазе цветения, 4 - фаза дозревания клубней. Образцы отбирали из разных органов растения картофеля: верхней части стебля, которая включала/ и конусы нарастания, средней части стебля, листьев верхних (2.«.5) ярусов, которые имели полностью сформированную листовую пластинку, и клубней. Отбор такого количества образцов позволил более полно проследить взаимодействие отдельных органов растения картофеля в онтогенезе, накопление азота в них и его перераспределение в ходе онтогенеза. При отборе растительных образцов полностью выкапывали растения из двух различных сосудов каждого варианта опыта. Отбор средних образцов проводили по стандартным методикам /91/. В отобранных образцах определяли сухую массу надземной части растений, площадь листовой поверхности и содержание хлорофилла в листьях.

Определение сухой массы. Сухая масса надземной части определялась стандартным методом, путем высушивания растительных образцов в стеклянных бюксах при температуре І05С в сушильном шкафу до установления постоянного веса /108/. Взвешивание проводили на аналитических лабораторных весах марки ВЛР-200.

Определение площади листовой поверхности. Использовали метод высечек /12/. При определении площади листовой поверхности этим методом вначале взвешиваются все листья растения, а затем определяется площадь одного грамма листьев. Высечки

49 делались сверлом с диаметром 10 мм. Метод этот не так точен, как определение площади листовой поверхности по линейным размерам листа, широко применяемое для злаков, или определение площади листа по контуру, обведенному на миллиметровой бумаге. Однако, этот метод позволяет определить площадь листовой поверхности для тех растений, листья которых имеют сложную конфигурацию. Кроме того, достаточно сильная облиственность куста растений картофеля сорта Гатчинский не позволяет применять метод определения площади листовой поверхности по обведенным контурам отдельных листьев. Поэтому, для стоящих перед нами задач, сравнения увеличения площади листовой поверхности в онтогенезе при различных условиях азотного питания и сравнения вариантов опыта, выбранный метод оказался наиболее подходящим.

Определение содержания хлорофилла. В листьях содержание хлорофилла определяли, экстрагируя его 96% этиловым спиртом /139/. Навеска листьев предварительно растиралась в ступке до образования однородной массы, заливалась 96% этиловым спиртом и в течении 20 минут оставлялась при комнатной температуре для прохождения экстракции. Затем содержимое ступки количественно переносилось на бумажный фильтр.Ступку ополаскивали спиртом 2 раза. Фильтрат доводили до определенного объема (до 25 мл) и фотометрировали на ФЭК-56ПМ с красным светофильтром. Калибровочная кривая строилась по раствору бихромата калия и сернокислой меди.

Определение валового содержания азота, фосфора и калия в растительных образцах и почве. В те же периоды времени, которые соответствовали четырем основным фазам роста растений картофеля, определяли общее содержание азота, фосфора и калия в растительной ткани и в почве вегетационных сосудов.

Общее содержание азота в образцах растительной ткани определяли путем мокрого озоления предварительно высушенных образцов в селенированной концентрированной серной кислоте. Селен играет в этом случае роль катализатора в процессе озоления /115/. На озоление отбирали навеску 250 мг предварительно размолотой и пропущенной через сито диаметром 0,1 мм, сухой растительной ткани и приливали 10 мл селенированной концентрированной серной кислоты. После озоления объем раствора доводили до 250 мл и из него отбирали аликвоту на определение азота. Азот определяли колориметрически с помощью реактива Несслера /177/. В настоящее время этот метод широко распространен при проведении массовых анализов и, при отсутствии специального оборудования, метод дает лучшие результаты, чем метод отгонки по Къельдалю. При проведении реакции с реактивом Несслера необходима полная нейтрализация раствора.

Определение валового содержания фосфора и калия в растительной ткани проводили из одной навески /92/. Как и при определении валового азота, навеску ткани 250 мг предварительно высушенной и измельченной озоляли в концентрированной серной кислоте. После озоления объем доводили до 250 мл и оттуда отбирали аликвоту для определения фосфора по методу Кирсанова, измеряя интенсивность окрашивания развивающегося при взаимодействии раствора с молибдено во кислым аммонием и хлористым оловом /5/. Измерение оптической плотности раствора проводили на ФЭК-56ПМ. Содержание калия проводили на пламенном фотометре без предварительного разведения и нейтрализации. При этом шкала готовилась на 4$ Н^О^..

Определение валового содержания азота, фосфора и калия в почвенных образцах, отобранных из вегетационных сосудов в основные фазы онтогенеза картофеля, проводили из одной навески /5/. Навеску воздушно-сухой почвы, предварительно размолотой и пропущенной через сито диаметром 0,1 мм, подвергали мокрому озолению в концентрированной серной кислоте. Далее определение проводили так, как это описано ранее.

Для почвенных и растительных образцов проводили пересчет валового содержания азота, фосфора и калия на сухую массу. Для этого при отборе образцов на анализ валового содержания элементов питания одновременно отбирали образцы для определения сухой массы. Эти образцы высушивали в стеклянных бюксах при температуре І05С в сушильном шкафу до установления постоянной массы. После определения сухой массы рассчитывали коэффициент пересчета для каждого образца.

Определение содержания нитратов в растительных и почвенных образцах. В растительных образцах и в почве в те же периоды вегетации определяли содержание нитратов. Для количественного определения содержания нитратов использовали потенциомет-рический метод /89/. Вытяжку готовили на 1% растворе алюмока-лиевых квасцов. Для сухого растительного материала подбирали соотношение навески к растворителю 1:4, для почвенных образцов - 1:2,5. Растворы тщательно перемешивали в течение 30 минут и оставляли на 1,5 часа. Измерение проводили на универсальном ионометре марки ЭВ-74, оборудованном специальным электродом для определения нитратов - ЭМ -N/Og - 01. Прибор от-калибровывали непосредственно перед каждым определением. Для построения калибровочной кривой использовали раствор предварительно очищенного и перекристаллизованного КМО* в 1% растворе алюмокалиевых квасцов. Расчет содержания нитратов в исследуемых образцах проводили по калибровочной кривой и пе- ресчитывали на сухую массу, определение которой проводили параллельно с определением нитратов.

Определение содержания аммония в почвенных образцах. Для более полного изучения динамики различных форм азота в почве в ходе вегетации из почвенных образцов, отобранных из сосудов, проводили определение содержания в них подвижного иона аммония /5/. Аммонийный азот извлекали из почвы, обрабатывая её I н раствором хлористого калия. Соотношение навески почвы к растворителю в этом случае было 1:10. Колбы тщательно перемешивали, оставляли на 12 часов и, после этого, отфильтровывали. Из прозрачного фильтрата отбирали аликвоту на определение содержания аммония с помощью реактива Несслера. Оптическую плотность испытуемых растворов определяли на фотоэлектроколо-риметре ФЭК-56ПМ. Шкалу стандартных растворов готовили непосредственно перед каждым определением из химическо-чистого хлористого аммония. Пересчет содержания иона аммония в почвенных образцах проводили на сухую массу почвы, поэтому параллельно с определением содержания аммония проводили определение сухой массы почвенного образца.

Определение содержания белка в растительных образцах. Основным показателем белкового обмена являлось общее содержание белка в различных органах растения и его изменение в ходе онтогенеза на фоне различных условий азотного питания. Общее содержание белка определяли в сроки, которые также соответствовали фазам онтогенеза растений картофеля: в фазу интенсивного роста ботвы, в фазу бутонизации, в фазу цветения и в фазу дозревания клубней. Одновременно проводили разделение белка на фракции и изучали фракционный состав. Общее содержание белка определяли по Лоури /189/ в модификации Ермакова /91/. Экстракцию белка из растительной ткани проводили 0,1 н щелочью.

Соотношение навески к растворителю было 1:50. После экстракции отбирали аликвоту отфильтрованного или отцентрифугирован-ного раствора и определяли содержание белка по его взаимодействию с реактивом Шолина. Измерение оптической плотности проводили на спектроэлектрофотометре марки СФ-4А или СФ-26 при длине волны 720 нм. Калибровочную кривую строили по казеину, очищенному по методу Гамерстена. При высоком содержании хлорофилла в тканях листьев, его предварительно экстрагировали из навески 96% этиловым спиртом. Фенолы, содержащиеся в тканях картофеля в значительных количествах способны препятствовать определению белка по методу Лоури /115/. Чтобы избежать методической ошибки, мы в 1980 году провели параллельное определение общего содержания белка с помощью осаждения его раствором Ь% трихлоруксусной кислоты и последующим мокрым озолени-ем в концентрированной серной кислоте. Далее определялось содержание белкового азота с помощью реактива Несслера и последующего фотометрирования. При пересчете содержания белкового азота на содержание белка в растительной ткани использовали коэффициент 6,28 /115/. Расхождения в полученных результатах этими двумя методами не превышали 3,0...4,8^. При этом метод определения белка по Лоури более быстрый и позволяет анализировать большое количество образцов одновременно. Кроме того, навеска растительной ткани в этом случае требуется намного меньше, что особенно существенно при анализе конусов нарастания на ранних этапах онтогенеза и клубней в период их закладки. Изучение фракционного состава белка. При изучении фракционного состава белка выделяли три основные фракции, беря за основу разделения различную растворимость. Первая фракция -белки, растворимые в воде, или альбуминоподобные белки, вторая фракция - белки, растворимые в растворах нейтральных солей, или белки глобулинового типа (рН до 8,8), третья фракция -белки, растворимые только в 0,1 н Н&ОН /27, 193, 112/. При таком разделении большинство ферментов оказывались в первой фракции, запасных белков - во второй, труднорастворимых - в третьей. При фракционном разделении белков навеску растительной ткани гомогенизировали и заливали дистиллированной водой в соотношении навески к растворителю 1:10. Экстракцию водорастворимых белков проводили в течение 3 часов при температуре 4С в холодильном шкафу. Затем пробу количественно переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали на центрифуге с рефрижераторным охлаждением 20 минут при б тысячах оборотов в минуту. Супернатант сливали в пробирки и использовали для определения водорастворимых белков, а к осадку приливали 10 мл фосфатного буфера с рН 8,8. Экстракцию проводили в течение 4 часов при 4С в холодильном шкафу. Затем пробы центрифугировали, супернатант использовали для определения еолераство-римых белков, а к осадку приливали 10 мл 0,1 н [ЧдОН .Экстракцию проводили в течение 4 часов при температуре 4С,затем пробы центрифугировали и супернатант использовали для определения белков, растворимых в щелочи. Чтобы избежать ошибки при количественном определении водорастворимых белков, которая может быть вызвана наличием в пробе фенолов, солей и так далее, водорастворимые белки дополнительно очищались с помощью диализа /27/. Диализ водорастворимой фракции проводили против дистиллированной воды в течение двух часов при температуре 4С в холодильном шкафу. Количественно белок во всех фракциях определяли по Лоури /91/.

Онтогенез картофеля и соотношение отдельных его этапов

Знание закономерностей онтогенетических изменений необходимо для управления ростом и развитием организма в целом и формированием тех органов, ради которых возделывается это растение. Для картофеля эти закономерности особенно важны, так как в начальные этапы необходимо происходит нарастание вегетативной массы надземной части растения, а затем переключение на формирование клубней, что связано с остановкой дальнейшего роста вегетативной части. Данные, полученные П.И.Альсмиком /7/, свидетельствовали, что для сортов картофеля, различающихся по скороспелости, существует постоянная закономерность роста: вначале происходит интенсивный рост ботвы, затем, в период начала цветения, остановка её роста. Причем, у скороспелых сортов остановка роста вегетативной части происходит раньше, чем у позднеспелых.

Показано, что столоны закладываются на П этапе органогенеза, который характеризуется дифференцировкой в нижней части конуса нарастания узлов и междоузлий стебля. На узлах формируются зачатки листьев, в пазухах которых закладываются точки роста столонов /79/. Продолжительность П этапа в зависимости от вида и сорта картофеля составляет от 5 до 14 дней /71/. Столонообразование у картофеля является генетической особенностью, и этот закономерный процесс начинается в определенный, конкретный период онтогенеза. Это определяется тем, что столоны представляют собой побеги ветвления стебля, а число побегов стебля определяется на П этапе органогенеза /73, 74 /. Согласно теории морфофизиологии развития Ф.М.Куперман выделя 8 ют следующие этапы развития растения картофеля: I - прорастание клубней, П - закладка столонов, Ш-УП - вегетативный рост, причем начало

Краткие сведения по систематике и биологическим особенностям картофеля. Характеристика сорта Гатчинский

На родине картофель представляет собой многолетнее растение. Это растение с мочковатыми корнями и подземными побегами, образует клубни. Стебель высотой 0,5...1 метр, ветви слегка гранистые, стебли покрыты короткими прижатыми волосками, зеленые или окрашенные антоцианом. Листья прерывисто перистые с 7...II крупными долями, чередующимися с мелкими, снизу опушенные. Соцветие картофеля представляет собой сложный завиток, цветоножки сочлены близ сердцевины, чашечки с пятью лепестками, венчик белый или окрашен антоцианом. Столбики у основания сросшиеся, рыльце - головчатое. Плод картофеля - ягода, шаровидная, зеленая 1,5...2 см в диаметре /150/.

Одной из существенных особенностей биологии картофеля является фотопериодическая реакция. Генеративные органы образуются у картофеля в условиях длинного дня, в то время как уменьшение длины дня стимулирует клубнеобразование. Влияние фотопериодизма на рост главного побега картофеля имеет ту особенность, что в первые фазы его роста удлиннению стебля способствует короткий день, а, спустя 2...3 недели после появления всходов фотопериодический оптимум перемещается в условия длин -ного дня.Фотопериодическая реакция у картофеля определяется его видовыми особенностями. Следует подчеркнуть, что количество листьев и побегов ветвления увеличивается с увеличением продолжительности дневного освещения. При закладке столонов число их не зависит от фотопериода, а определяется лишь генетическим потенциалом вида или сорта. В дальнейшем столоны в своем развитии, однако, также зависят от фотопериодической реакции растений. Реакция на клубнеобразование при более коротком дне сложилась у картофеля как филогенетический признак, связанный с особенностями его происхождения. Оптимальной для клубнеобразования является длина дня равная 12,5... 12 часам.

class3 ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ ОСНОВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПИТАНИЯ

В ХОДЕ ОНТОГЕНЕЗА РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ class3

Влияние различных условий азотного питания на накопление азота

Азот является одним из лимитирующих элементов, определяющих плодородие почв. Он играет важную роль в жизни растений, так как входит в состав белков, нуклеиновых кислот и ряда других жизненно важных веществ. Однако большинство почв, встречающихся в нашей стране, обеднены азотом. Именно поэтому внесение азотных удобрений является важнейшим фактором повышения плодородия почв и урожайности сельскохозяйственных культур /126/. Основными формами азота, которые доступны растениям, являются неорганические соединения азота - аммонийные и нитратные формы. Из органических соединений наиболее доступной формой для растений является мочевина. Показано, что с большей скоростью растения способны усваивать те соединения азота, которые имеют аммонийную группу /146/. При усвоении растением нитратов, они практически сразу же восстанавливаются до аммиака. Этот процесс начинается еще в корневой системе растений, однако, более важную роль в восстановлении нитратов играют листья /66, 176/.

В ходе онтогенеза наблюдается накопление азота в различных органах растений. В первую очередь это накопление происходит за счет возрастания содержания белкового азота. В листьях, кроме того, могут накапливаться нитраты, что приводит к резкому уменьшению отношения л/ небелковый Е0 02 10» что изменение соотношения белкового и небелкового азота вызывает изменения в метаболизме азота в растении в целом /114, 116, 41/. В настоящее время, в сельскохозяйственном производстве применяются все более высокие дозы азотных удобрений. Действие повышенных доз азотных удобрений на динамику накопления азота в растениях картофеля и, в частности, белкового азота, изучено недостаточно.

Влияние норм азотных удобрений на рост и разбитие растений картофеля в ходе онтогенеза

Процесс клубнеобразования у картофеля тесно связан с прохождением отдельных этапов онтогенеза. Наиболее четко эта связь проявляется на ранних этапах развития растений. Известно, что для нормального клубнеобразования необходимо, чтобы растения картофеля уже на ранних этапах онтогенеза сформировали мощные, хорошо облиственные стебли. В дальнейшем рост вегетативной части тормозится, что по времени примерно совпадает с фазой бутонизации и начинается интенсивный процесс клубнеобразования /136, 30/. Показано, что воздействие внешних факторов может тормозить или ускорять переход растений к клубнеобразованию. Так, для диких видов картофеля выращивание их только на длинном дне (при продолжительности светового дня 18 часов) привело к интенсивному росту и развитию ботвы, в то время как клубни у этих растений не закладывались совсем или их количество было много ниже, чем у растений контрольного варианта. При выращивании только на коротком дне (продолжительность светового дня 10 часов) наблюдалось раннее образование клубней, при этом ботва растений развивалась слабо /128/. Особенно важным в этой работе представляется тот факт, что, меняя длину светового дня автор получил возможность управлять ходом клубнеобразования у растений картофеля.

Полученные данные хорошо согласовались с гормональной теорией развития растений /155/. Накопление определенных концентраций фитогормонов и их различные сочетания представляются с этой точки зрения единственным фактором,-который регулирует процесс клубнеобразования /159/. Процессы, происходящие в столонах в начальные этапы клубнеобразования,согласно этой точке зрения,определяются накоплением фитогормонов и ингибиторов роста. Подавление роста столона и скорости деления клеток вызывает переход к дифференциации тканей клубня. Подобное влияние регуляторов роста было установлено для целого ряда растений /56/.

При внесении азотных удобрений у картофеля удается выявить, так называемую "азотфлоральную" реакцию, которая выражается в замедлении зацветания растений. В этих условиях происходит одновременное торможение клубнеобразования /41/, что трудно объяснить, исходя только из гормональной теории его регуляции. Очевидно, трофические факторы играют существенную роль в регуляции клубнеобразования, которая, однако идет на другом уровне, чем регуляция с помощью ростовых веществ /120/. Роль трофических факторов может сводиться к созданию градиентов концентраций веществ, в частности, в накоплении углеводов в нижней части стебля. Создание такого градиента, по-видимому, является одним из наиболее существенных внутренних факторов, регулирующих клубнеобразование /30, 136, 68, 23/.

Влияние норм азотных удобрений на содержание и фракционный состав белков

Согласно современным данным содержание белков в тканях растения изменяется в ходе онтогенеза. Показано, что старение листьев вызывает резкое снижение содержания белка в них /199/. На общее содержание белка в растительных тканях могут влиять факторы внешней среды: температура, влагообеспеченность, условия минерального питания. Для таких сельскохозяйственных культур, как пшеница, кукуруза, рожь, картофель показано, что внесение высоких доз азотных удобрений способно подавлять биосинтез белка, что неблагоприятно сказывается на продуктивности растений и качестве получаемой продукции и др./.

При нормальном росте и развитии растений наиболее интенсивно процесс биосинтеза белка проходит на ранних этапах онтогенеза. Затем интенсивность синтеза белка остается некоторое время на максимальном уровне, а, в дальнейшем, в более поздние этапы онтогенеза, снижается /199, 141/. У картофеля подобное снижение содержания белка в надземной части происходит в фазу цветения /30/, тогда как максимальное содержание белка в растениях картофеля было обнаружено в фазу бутонизации /41/.

Наиболее интенсивно вынос азота у картофеля происходит в фазу интенсивного роста - фазу бутонизации, в это время растения выносят до 90% всего азота, поглощаемого в ходе вегетации /106/. Одновременно с этим наблюдается максимальная интенсивность синтеза белка. Учитывая временную взаимосвязь этих двух процессов, можно судить о взаимном влиянии накопления азота в тканях растения и белкового метаболизма. Изучение взаимосвязи между условиями азотного питания растений и накоплением белка в листьях позволяет представить биосинтез суммарного белка, как реакцию растений на условия азотного питания /II/.

Условия азотного питания оказывают влияние не только на содержание суммарного белка, но и на его фракционный состав. Экстремальные воздействия внешней среды способны вызывать стрессовые состояния у растений. При этом изменяется не только продуктивность сельскохозяйственных растений и качество полученной продукции, но и возникают нарушения в обмене белков, углеводов и биологических регуляторов роста /148/. Так, показано, что возникновение стрессовых ситуаций, к которым может быть отнесено и выращивание растений на повышенных нормах азотных удобрений, в первую очередь, изменяет содержание водорастворимых белков. При этом может изменяться как количественное их содержание, так и качественное, что проявляется в появлении новых фракций, выделяемых при разделении водорастворимых белков /199/. Показано, однако, что не только водорастворимые белки могут изменяться в зависимости от условий азотного питания. Средне-и труднорастворимые белки также могут изменять свой фракционный состав под действием этого внешнего фактора /67/.