Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Морфофункциональная характеристика нефрона почки млекопитающих 10
1.2. Транспорт воды через эпителий собирательных трубок почки 12
1.3. Регуляция проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок вазопрессином 18
1.4. Кальций-зависимые пути регуляции водной проницаемости плазматической мембраны эпителия собирательных трубок вазопрессином 26
1.5. Модуляторы регуляции водной проницаемости эпителия сбирательных трубок вазопрессином 32
1.6..Регуляция проницаемости базолатеральной мембраны 33
1.7. Становление механизма трансдукции сигнала АДГ в постнатальном онтогенезе 35
1.8.Заключение 39
Глава II. Материалы и методы 41
2.1.Экспериментальные животные 41
2.2. Реактивы 41
2.3.Измерение водной проницаемости эпителия собирательных трубок 42
2.3.1 Растворы 42
2.3.2 Обработка стекол полилизином 42
2.3.3 Получение фрагментов собирательных трубок 42
2.3.4 Измерение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок 43
2.3.5 Измерение водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок 45
2.3.6 Исследование влияния dDAVP на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок у крыс разного возраста 48
2.3.7. Оценка влияния проникающего аналога цАМФ - дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок 48
2.3.8. Исследование влияния внутриклеточного хелатора кальция ВАРТА на эффект dDAVP и дб-цАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок 49
2.3.9. Исследование влияния ингибитора протеинкиназы С на эффект dDAVP и дб-цАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок 49
2.4. Вестерн-блот анализ 50
2.4.1. Получение срезов почки и их инкубация с различными агентами 50
2.4.2. Полученение мембранной и цитозольной фракции наружного мозгового вещества почки 51
2.4.3. Измерение концентрации белка 51
2.4.5. Электрофоретическое разделение белков, перенос белко на PVDF мембрану 52
2.4.6 Проведение Вестерн-блот анализа 53
2.5. Статистика 53
Глава III. Результаты исследований 55
3.1. Регуляция водной проницаемости клеток открытого конца собирательных трубок почки крысы и экспрессии AQP2, AQP3 десмопрессином в постнатальном онтогенезе 55
3.2. Оценка экспрессии различных изоформ РКС в наружном мозговом веществе почки крыс разного возраста 60
3.3. Влияние внутриклеточного хелатора Са2+ на десмопрессин-зависимое повышение водной проницаемости собирательных трубок почки крысы и содержание РКСа и водных каналов 2 и 3 типа 66
3.4. Подавление ингибитором РКС Ro-31-8220 эффекта десмопрессина на водную проницаемость базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок почки крысы 72
3.5. Влияние ингибитора РКС Ro-31-8220 и внутриклеточного хелатора кальция ВАРТА на эффект цАМФ-дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательной трубки почки крысы 76
Глава IV. Обсуждение 81
Выводы 93
Список цитированной литературы 95
- Регуляция проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок вазопрессином
- Измерение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок
- Получение срезов почки и их инкубация с различными агентами
- Оценка экспрессии различных изоформ РКС в наружном мозговом веществе почки крыс разного возраста
Введение к работе
Акуталъность проблемы.
У млекопитающих главным эффекторным органом системы
поддержания водного гомеостаза является почка. Экскреция осмотически свободной воды определяется ее реабсорбцией в собирательных трубках под действием вазопрессина. Согласно современным представлениям, основной механизм увеличения транспорта воды через главные клетки собирательных трубок почки под действием вазопрессина состоит в обратимом встраивании аквапорина 2 (AQP2) в апикальную мембрану. На молекулярном уровне происходит связывание гормона со специфическими V2 рецепторами, расположенными на базолатеральной мембране клеток собирательных трубок. Образование гормон-рецепторного комплекса приводит к активации аденилатциклазы, происходит наработка цАМФ что, в свою очередь, приводит к запуску каскада внутриклеточных процессов, одним из конечных результатов которых является встраивание AQP2 в апикальную мембрану (Agre,1993; Nielsen et.al., 1995; Shaw, Marples, 2002; Hoffert et.al., 2005).
Кроме того, по-видимому, существуют пути регуляции проницаемости клеток собирательных трубок почки, в которых непосредственно не участвует цАМФ. Было установлено, что вазопрессин, наряду с повышением количества цАМФ, вызывает кратковременное повышение концентрации внутриклеточного кальция, которое показано в клетках собирательных трубок внутреннего мозгового вещества (Соленов и др., 1991; Ecelbarger et.al., 1996; Chou et.al., 1998). При этом не наблюдается повышения концентрации кальция при действии дб-цАМФ, 8-бромо-цАМФ и форсколина, активирующих цАМФ зависимый путь трансдукции сигнала вазопрессина (Nickols et al., 2004). Увеличение концентрации кальция, очевидно, имеет важное значение для реализации эффекта вазопрессина в собирательных трубках, поскольку обработка
суспензии собирательных трубок хелатором кальция-ВАРТА AM приводит к подавлению реакции на гормон (Chou et al., 2000; Yip, 2002).
PKC является одним из наиболее вероятных участников цАМФ независимого пути регуляции водной проницаемости собирательных трубок вазопрессином и, вероятно, может принимать участие в механизмах созревания чувствительности к гормону в ходе постнатального онтогенеза. Так, было показано, что хроническая обработка ингибитором РКС приводит к нарушению нефрогенеза (Saxena et al., 1994; Serlachius et al., 1997)
Однако, несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярных основ действия вазопрессина, многие аспекты остаются неясными. Среди них - процессы становления гормональной компетентности почки в ходе постнатального развития.
В ранний постнатальный период почка незрелорождающих млекопитающих нечувствительна к действию антидиуретического гормона (вазопрессина). У крыс гормональная компетентность к действию вазопрессина появляется у 20-22 дневных животных, что совпадает с концом периода виннинга и переходом от молочного вскармливания к самостоятельному питанию. В этот период завершается формирование всего комплекса регуляторных систем водно-солевого гомеостаза, обеспечивающих работу почки, исходя из потребностей организма (Aperia, Herin, 1975; Dlouha, 1976; Соленов, Иванова, 1997). Однако причины отсутствия реакции на вазопрессин в настоящее время не ясны. Исследования формирования чувствительности почки к вазопрессину относительно немногочисленны и носят фрагментарный характер. В то же время, понимание процесса становления гормональной компетентности почки необходимо для прояснения путей поддержания водно-солевого гомеостаза в ходе постнатального развития.
Целью настоящей работы являлось исследование роли РКС и внутриклеточного кальция в регуляции вазопрессином водной проницаемости эпителия собирательных трубок почки крысы в постнатальном онтогенезе.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
Получить данные о влиянии водной депривации и десмопрессина, агониста V2 рецепторов вазопрессина, на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок почки крысы и на содержание водных каналов 2 и 3 типов в мембранной фракции наружного мозгового вещества у взрослых животных и в постнатальном онтогенезе.
Оценить изменение содержания и перераспределение белка из цитозольной фракции в плазматическую мембрану различных изоформ протеинкиназы С в ходе постнатального развития
Исследовать участие протеинкиназы С в регуляции вазопрессином водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок мозгового вещества почки взрослых мышей и в ходе постнатального онтогенеза.
Исследовать роль внутриклеточного кальция в регуляции вазопрессином водной проницаемости клеток собирательных трубок мозгового вещества почки крысы
Научная новизна.
С использованием разработанного в лаборатории метода была
охарактеризована водная проницаемость собирательных трубок почки крысы. Показано, что водная проницаемость плазматической мембраны клеток собирательных трубок повышается в ходе постнатального развития, и одновременно нарастает содержание водных каналов 2 и 3 типов в плазматической мембране.
Впервые показано подавление эффекта десмопрессина на водную проницаемость ингибитором протеинкиназы С и выяснено, что протеинкиназа С участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ
Обнаружено, что связывание внутриклеточного кальция с помощью хелатора ВАРТА приводит к подавлению стимулируемой десмопрессином водной проницаемости общей поверхности и базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок почки крысы.
Установлено, что созревание механизмов трансдукции сигнала вазопрессина, в том числе и кальций-зависимых путей, происходит к 20-24 дню постнатального развития.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные дополняют и расширяют существующующие
представления о механизмах действия вазопрессина на эпителий собирательных трубок почки млекопитающих. Кроме того, результаты данного исследования могут иметь и прикладное значение, поскольку дефект любого из звеньев на пути передачи гормонального сигнала вазопрессина приводит к тяжелейшим нарушениям водно-солевого гомеостаза, особенно в детском возрасте. Глубокое и всестороннее исследование механизмов регуляции водного и ионного транспорта в клетках эпителия почки позволит применить полученные данные в разработке методов компенсации нарушений водного баланса у человека.
Апробация материалов.
Материалы диссертации доложены на конференции, посвященной
80-летию со дня рождения М. Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), XX съезде физиологического общества им.Павлова (Москва, 2007).
Основное содержание диссертации изложено в 4 статьях и 9 тезисах докладов.
Регуляция проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок вазопрессином
В главных клетках собирательной трубки локализованы рецепторы к различным гормонам и биологически активным веществам, таким как простагландины, инсулин, эндотелии, брадикинин, АТФ, предсердный натрийуретический фактор (Hebert et.al., 1990; Nadler et.al., 1992; Kishore et.al., 1995; Suko et.al., 1997; Zelenina et al., 2000;Bouley et al., 2000; Bustamante et.al., 2005), рецепторы к рианодину (Chou et al., 2000). Все эти вещества могут модулировать регуляцию водной проницаемости клеток эпителия. Однако наиболее значимое влияние на водную проницаемость оказывает вазопрессин (Yamamoto et al, 1995; Nielsen et.al., 2002).
Вазопрессин представляет собой нонапептид циклического строения с боковой цепью. У млекопитающих описаны две модификации гормона: у человека и большинства млекопитающих - это аргинин-8-вазопрессин, у ряда других видов (свинья, гиппопотам) - это лизин-8-вазопрессин.
Экспрессия вазопрессина усиливается при длительной дегидратации организма (Burbach et al., 1984; Sherman et al., 1986; Lightman, Young, 1987). В условиях длительной гипоосмии транскрипция вазопрессина значительно подавляется (Herman et al., 1991). Нарушение биосинтеза АДГ приводит к развитию гипоталамического несахарного диабета (Majzoub et al., 1983; Moore, Rosenior, 1983). Хорошо описанной в литературе моделью наследственного несахарного диабета является линия крыс Brattleboro (Valtin, 1967). У крыс этой линии нарушен синтез вазопрессина, в результате чего они не способны регулировать реабсорбцию воды в собирательных трубках почки (Schmale, Richter, 1984). Крысы Brattleboro экскретируют до 70 % веса тела гипотоничной мочи в сутки и вынуждены выпивать эквивалентное количество жидкости.
Высвобождаясь в кровь, вазопрессин оказывает множественное действие на организм, в том числе поддержание нормального осмотического давления в организме, регуляция секреции АКТГ (Baertschi, 1983), увеличение синтеза простагландинов интерстициальными клетками мозгового слоя почек (Kirschenbaum et al., 1982; Schlondorff et al., 1985), агрегация тромбоцитов (Haslam, Rosson, 1971), высвобождение факторов коагуляции (Share, 1988). Помимо этого вазопрессин участвует в процессах ЦНС, в частности, процессах памяти (de Wied D et al, 1974; Croiset et al., 2000).
Известны два типа рецепторов к АДГ - VI и V2 , при этом VI имеет два подтипа: Via и Vlb (Birnbaumer et al., 1992; Lolait et al., 1992; Morel et al., 1992; Hirasawa et al., 1994; Thibonnier et al, 1994). Вазопрессин способен также связываться с рецепторами другого гормона нейрогипофиза - окситоцина, главным образом благодаря большой аминокислотной гомологии как рецепторов, так и самих гормонов (Chini et al., 1996; Gimol, Fahrenholz, 2001). Все вышеперечисленные рецепторы входят в класс трансмембранных рецепторов, связанных с внутриклеточными G белками (GPCR - G protein-coupling receptor). Рецепторы этого класса - мембранные белки с 7-ю трансмембранными доменами. Рецепторы окситоцина, Via и Vlb рецепторы сопряжены с G белками Gq/11 семейства, которые опосредуют активацию фосфолипазы (Nathanson et al., 1992). Рецепторы Via локализованны в мозге, в интерстициальных клетках мозгового вещества почки, в печени, в сосудах и в ряде других органов, опосредующих различные действия вазопрессина (Michell et al., 1979; Jard et al., 1987; Jard, 1988; Barberis et al., 1992). Vlb рецепторы выявлены, главным образом, в аденогипофезе и участвуют в высвобождении АКТГ под действием вазопрессина (Baertschi, Friedli, 1985; Jard et al., 1986; Du Pasquier et al., 1991; Arsenijevic et al., 1994; Jard et al., 1987; Jard, 1988; Barberis et al., 1992). Помимо этого, рецепторы данного типа обнаружены в почках, тимусе, сердце, молочной железе, легких и в мозговом веществе надпочечников (Lolait et al., 1995). С использованием иммуноблоттинга, было показано наличие VI схожего рецептора вазопрессина в кортикальных и медулярных собирательных трубках почки крысы, при этом иммуноокрашивание с использованием специфических антител показало, его базолательную локализацию (Gonzalez et.al., 1997). Однако введение антогониста VI рецептора не влияло на перераспределение аквапорина 2 и увеличение осмолярности мочи под действием вазопрессина и дегидратации животных (Hayashi М et.al., 1994). На клетках эпителия мочевого пузыря лягушки было показано, что агонист VI-рецепторов в растворе у слизистой оболочки снижает гидроосмотический эффект аргинин-вазотоцина, добавленного к раствору у серозной оболочки (Пруцкова Н.П. и др.,2000).
V2 рецептор локализован главным образом на базолательной поверхности собирательных трубок (Kinne, Schwartz, 1997; Nonoguchi et.al., 1995). Показано, что у крыс экспрессируется два сплайсированных варианта V2 рецептора. Длинный вариант кодирует рецептор, сопряженный с аденилатциклазой. У короткого варианта отсутствует нуклеотидная последовательность, кодирующая предполагаемый седьмой трансмембранный домен, и он неактивен в аденилатциклазном пути (Firsov et al., 1994).
Наиболее обоснованной и общепринятой моделью регуляции водной проницаемости эпителия собирательных трубок вазопрессином является «челночная» гипотеза, которую предложил Wade (Wade et.al., 1981). Согласно этой гипотезе, вазопрессин индуцирует встраивание везикул, содержащих проводящие воду «частицы» в апикальную мембрану. В настоящее время уже известны ключевые моменты механизма регуляции водной проницаемости апикальной мембраны главных клеток собирательных трубок под действием АДГ (Yamamoto et al., 1995). V2 рецептор вазопрессина, локализованный в главных клетках собирательных связан с as субъединицей G-белка (Orloff, Handler, 1967; Star et.al., 1988; Birnbaumer M et al., 1992). При связывании вазопрессина с V2 рецептором происходит диссоциация гетеротримерного G белка на as субъединицу и Ру димер. Свободная as субъединица, связанная с ГТФ, активирует фермент аденилатциклазу, это приводит к повышению содержания цАМФ в клетке (Bimbaumer, 1992), что в свою очередь активирует протеинкиназу А (РКА).
В настоящее время описано . и клонировано 10 типов аденилатциалазы. В почке идентифицируют несколько аденилатциклаз: АЦ4, АЦ5, АЦ6, АЦ7 и АЦ 9 (цит. по Defer et al, 2000). В главных и вставочных клетках собирательных трубок экспрессируется АЦЗ, АЦ6, АЦ7, тогда как во вставочных клетках показано наличие и АЦ5 (He lieV Toussaint et al., 2000). Аденилатциклаза третьего типа экспрессируется в собирательных трубках, восходящем и нисходящем колене петли Генле, способна активироваться РКС и подавляться кальмодулином. АЦ6 обнаружена преимущественно в главных клетках СТ, толстом восходящем сегменте, она также активируется РКС, ингибирующее действие оказывают Gcti, РКА, Са2+ (цит. по Defer et al., 2000). Показано, что АЦ6 в клетках собирательных трубок колокализована с кальциевым рецептором, чувствительным к внеклеточной концентрации Са (Ostrom et.al., 2001) АЦ7 при детекции дает слабый сигнал во всей почке, этот фермент на настоящий момент изучен слабо. Специфическое активирующее действие на аденилатциклазы всех типов оказывает форсколин, в связи с этим он широко применяется в экспериментах как инструмент для выяснения роли аденилатциклазы в реализации различных биологичеких функций. (Liu et al., 1997).
Измерение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок
Система канальцев мозгового вещества почки у крыс развивается после рождения, при этом происходит удлинение петель отдельных нефронов и увеличения их числа (Goncharevskaya, Dlouha, 1975; Sundelin, Bohman, 1990), таким образом, противоточная система осмотического концентрирования постепенно формируется в ходе постанатльного развития.
С момента рождения до конца периода вининга показано постепенное возрастание количества V2 рецепторов в собирательных трубках (Ammar et al., 1992). При этом, в процессе созревания почечной функции продемонстрировано параллельное повышение вазопрессин-связывающей способности и гормонального ответа (Ammar et al., 1992; Соленов, Иванова, 1997). Вероятно, природа формирования рецепции вазопрессина более сложна, чем просто повышение числа рецепторных единиц. В процессе развития почечных канальцев происходят значительные качественные изменения структуры рецепторов вазопрессина. Оценка молекулярной массы солюбилизированных рецепторов путем гель-фильтрации позволила предположить, что V2 присутствует в мембране в кластерах относительно небольшого размера. В отсутствие гормона у взрослых животных эти субъединицы удерживаются в агрегированном состоянии, но легко разъединяются у животных раннего возраста. Природа фактора, способного удерживать субъединицы рецептора в агрегированном состоянии еще не выяснена (Соленов, Иванова, 1997). Существуют данные, позволяющие предположить, что в раннем постнатальном периоде существует несовершенство, как самого рецептора, так и сопрягающего компонента при наличии функционально способного каталитического компонента аденилатциклазного комплекса (Иванова и др., 1990).
В процессе становления физиологической реакции на вазопрессин происходят определенные изменения и свойств сопрягающих G-белков. Причины наблюдаемых различий функциональных показателей и хроматографической подвижности мембранных комплексов гуанин-связывающих белков у животных раннего возраста, ареактивных к вазопрессину, и взрослых пока остаются неясными (Соленов, Иванова, 1997).
Существуют данные, согласно которым, вазопрессин зависимая активация аденилатциклазы у 3-х дневных крысят составляет 25-30% от уровня взрослых животных (Imberteboul et.al.,1984). Значительный вклад в цитоплазматическую рецепцию цАМФ обусловлен регуляторными субъединицами цАМФ-зависимой протеинкиназы (РКА). Было показано, что свойства цитозольных рецепторов цАМФ меняются в период созревания почки и проявления эффекта вазопрессина. В период вининга происходит смена типов регуляторных субъединиц, и свойства цАМФ-связывающих белков становятся , по видимому, более адекватными для регуляции активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (Соленов, Иванова, 1985). AQP2 и AQP3 экспрессируются в пренатальний период и непосредственно после рождения в почках крыс, хотя и в меньшей степени чем у взрослых (Baum et al., 1998; Yasui et al., 1996; Tsukahara et al., 1998). Показано, что до периода вининга в постнатальном онтогенезе, экспрессия AQP2 повышается при дегидратации. Кроме того, при действии аналога вазопрессина AQP2, локализованный во внутриклеточных везикулах, встраивается в плазматическую мембрану (Bonilla-Felix, Jiang, 1997). Следовательно, отсутствие ответа на вазопрессин и неспособность почек к концентрированию мочи во время эмбриогенеза и непосредственно после рождения не является следствием отсутствия экспрессии AQP2. Наиболее быстрое повышение концентрирующей функции почек наблюдается в период вининга. Подобный характер развития наблюдается в уровне мРНК AQP2 в мозговом веществе почки. Экспрессия мРНК трех других транспортеров, включенных в процесс концентрирования: а- субъединицы медуллярной Na+-K+-ATOa3bi , Na-K-2C1 переносчика, и эпителиального хлорного канала, также повышается во время вининга и регулируется глюкокортикоидами (Yasui et al., 1996).
Большое значение придают активности фосфодиэстеразы. Так, например, у новорожденных кроликов активность фосфодиэстеразы повышена по сравнению со взрослыми животными, и в ходе развития активность этого фермента падает. Вазопрессин на фоне ингибитора фосфодиэстеразы (IBMX) приводит к увеличению водной проницаемости эпителия собирательных трубок (Quigley et al, 2004). Возможно, значительную роль в становлении гормональной компетенстности почки крыс на вазопрессин играет Са . Активация кальций - зависимых форм протеинкиназы С (РКС), по видимому, может приводить к модулированию эффекта вазопрессина. Долговремененное ингибирование функции РКС в ходе развития приводит к нарушению нефрогенеза (Serlachius et al., 1997). На мышах с мутацией в гене, кодирующем РКСа показан факт снижения концентрирующей способности почек (Yao et al., 2004), что может служить дополнительным аргументом в пользу возможности участия этого фермента в развитии чувствительности эпителия в вазопрессину.
В целом, возникновение компетентности почки млекопитающих к вазопрессину в период вининга является результатом количественных и качественных изменений, происходящих в молекулярных механизмах гормонального ответа.
Получение срезов почки и их инкубация с различными агентами
После декапитации животного почки извлекали и помещали на лед. Почки декортицировали, сохраняя наружную зону мозгового вещества, сосочек удаляли. С помошью бритвенного лезвия выделенное наружное мозговое вещество разделяли на срезы толщиной 2-3 мм. и помещали их в среду MEM с 15 мМ HEPES на лед. Инкубацию с различными агентами проводили в той же среде при 37 С в атмосфере 5% СОг и 95% воздуха.
Для оценки влияния dDAVP(10 М) срезы инкубировали в течение 30 мин. В качестве контроля использовали срезы проинкубированные в течение 30 мин. в тех же условиях, но без добавления dDAVP. Для выявления эффекта связывания ионов кальция внутри клетки на содержание белка AQP2, AQP3 и РКСа с каждой почки получали 4 среза наружного мозгового вещества и помещали их в разные пробирки. После этого в третью и четвертую пробирки добаляли ВАРТА до концентрации 50 мкМ. Все срезы инкубировали в течение 30 мин. После чего во вторую и четвертую пробирки добавляли dDAVP до концентрации 10" М и инкубировали еще 30 мин. После инкубации каждый срез разделяли на 2 части для получения цитозольной и мембранной фракций. Для выявления действия ингибитора протеинкиназы С на содержание белка РКСа с каждой почки получали 4 среза наружного мозгового вещества и помещали их в разные пробирки. После этого в третью и четвертую пробирки добаляли Ro-31-8220 до концентрации 0,1 мкМ. Все срезы инкубировали в течение 10 мин. После чего во вторую и четвертую пробирки добавляли dDAVP до концентрации 10" М и инкубировали еще 30 мин. После инкубации каждый срез разделяли на 2 части для получения цитозольной и мембранной фракций. мозгового вещества почки. Для получения препарата плазматических мембран наружное мозговое вещество почки гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе со свободным пестом в трис-хлоридном буфере, содержащем сахарозу и ингибиторы протеаз (10 мМ Трис-С1 рН 7.4, 0.25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, ингибиторы протеаз). Ингибиторы протеаз (Complete protease inhibitor tablete, Santa Cruz) использовали в рекомендованных проихводителем концентрациях. Гомогенат центрифугировали 15 мин. при 3000 g , супернатант повторно центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Все процедуры выполняли на холоду. Полученный осадок растворяли в буфере содержащим SDS. (10 мМ Трис-С1 рН 7.4, 0.25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, ингибиторы протеаз, 1% SDS). Для получения цитозольной фракции наружное мозговое вещество почки гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе со свободным пестом в трис-хлоридном буфере, без сахарозы (10 мМ Трис-С1 рН 7.4, 1 мМ ЭДТА, 2-меркаптоэтанол 1 ОмМ, ингибиторы протеаз). Гомогенат центрифугировали 50 мин. при 40000 g , отбирали супернатант. Измерение концентрации белка проводили с помощью Protein assay реагента (BioRad). После 4-х кратного разведения, в 0,4 мл. реагента добавляли по 5 мкл. препарата мембранной или цитозольной фракции. Через 10 мин. проводили измерение оптической плотности на фотометре SPEKOL 20 при длине воды 595 нм. Концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой построенной по БСА. Электрофоретическое разделение белков, перенос белко на PVDF мембрану. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Концентрирующий гель содержал 4%-акриламид (0,13 М Трис-С1 (рН 8,8), 0,1 %, SDS, 0,1 %, персульфат аммония, 1мкл/мл TEMED, 13% стоковый раствор), разделяющий гель состоял из 12% акриламида (0,13 М Трис-С1 (рН 6,8), 0,1 %, SDS, 0,1 %, персульфат аммония, 1мкл/мл TEMED, 40% стоковый раствор). Стоковый раствор содержал 29% акриламида и 1% N-метил-бис-акриламида. Полученные препараты цитозольной и мембранной фракции разбавляли до концентрации 1мкг. белка в 10 мкл. раствора для гомогенизации, после чего 10 мкл. полученнго раствора смешиавли с 5 мкл. буфером для нанесения, содержащем 100 мМ Трис-С1 (рН 6,8) , 20 %, сахарозу, 4 %, SDS, 5%, 2-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий, нагревали в течение 10 мин. при 80С и наносили на гель. Электрофорез проводили в течение двух-трех часов при комнатной температуре в буфере 0.025М Трис-глицин (рН 8.8), 0,1% SDS при 200V. Для определения молекулярной массы детектируемых белков на гель наносили маркеры массы (SDS-PAGE Standards, BioRad), при электрофоретическом разделение дающие 6 окрашенных полосок массой от 112 кД до 21кД. После разделения белки переносили на PVDF мембрану в буфере содержащем 50мМ Трис, 40мМ Глицин, 0,5% SDS, 20% Метанол в камере для полусухого переноса (Hoefer scientific) в течение ночи при 50 мА. Для контроля переноса белков мембраны окрашивали раствором амидо черного (0.1% амидо черный; 10% объема метанола; 2% объема уксусной кислоты, вода) в течение 5 мин. при комнатной температуре, затем промывали раствором (45% объема метанола; 7% объема уксусной кислоты, вода) 3 раза по 5 мин. Мембрану высушивали и проводили визуальный контроль переноса белков на мембрану.
После переноса белков на мембрану ее помещали в блокирующий раствор (0.2% раствор блокирующего реагента в PBST буфере, ЮОмМ содержащем NaCl, 80 мМ Na2HP04, 20мМ NaH2P04 H20, 0,001% Tween 20) и инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После чего добавляли раствор первичных антител в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном покачивании. Мембрану промывали PBST 3 раза по 5 мин. и добаляли раствор вторичных антител в блокирующем растворе, проводили инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре при постоянном покачивании. После чего, мембрану снова промывали PBST 3 раза по 5 мин. Для детекции сигнала использовали коммерческие наборы с хемилюминисцентной детекцией (ECL plus Western Blotting Detection System) согласно приложенным протоколам. Хемилюминисцентный сигнал детектировали с помощью фотопленки Kodak Biomax Light Film. После проявления автографы сканировали, величину оптической плотности измеряли с помощью программы Adobe Photoshop 5.0.
Антитела использовали в следующих разведениях: Первичные в разведении 1:4000, вторичные антитела в разведении 1:10000.
На атографах, полученных с помощью антител против AQP2 и AQP3 детектировали 2 полосы, размерами около 50 кД и ЗОкД, отражающие рибозилированную и нерибозилированную форму белка. При денситометрии учитывалась суммарная оптическая плотность 2-х полос. На атографах, полученных с помощью специфических антител против РКСа детектировали одну полосу размером около 80 кД, против РКСб- около 70 кД, против РКСС - около 75 кД.
Оценка экспрессии различных изоформ РКС в наружном мозговом веществе почки крыс разного возраста
РКС является одним из наиболее вероятных участников цАМФ независимого пути регуляции водной проницаемости собирательных трубок вазопрессином, и, вероятно, может принимать участие в механизмах созревания чувствительности почки к вазопрессину в ходе постнатального онтогенеза. Так, было показано снижение концентрирующей способности почек у мышей, нокаутных по гену, кодирующему протеинкиназу С (Yao et al, 2004). В экспериментах данной серии с помощью Вестерн-блот анализа оценивали содержание белка кальций-зависимой РКСа, кальций-независимой РКС5, атипичной РКС \ изоформ протеинкиназы С в мембранной и цитозольной фракции наружного мозгового вещества почки крысы у 9-12 дневных, 20-24 дневных и взрослых животных. При этом анализировали изменение общего содержания фермента, суммируя оптические плотности полос, детектируемых в цитозольной и мембранной фракциях, а также перераспределение РКС по отношению оптической плотностей сигнала, определяемого в мембранной фракции к цитозольной
Было показано, что суммарное содержание белка РКСа в мембранной и цитозольной фракции наружного мозгового вещества почки максимальна у животных в конце периода виннинга (Рис. 10) и достоверно выше у взрослых животных по сравнению с 9-12ти дневными. Кроме того, в ходе постнатального развития изменяется соотношение мембранной и цитозольной фракции РКСа. У 20-22 дневных животных преобладание мембранной формы фермента было выражено сильнее по сравнению со взрослыми и 9-12 дневными крысам. Поскольку присутствие РКС в мембранной форме принято связывать с увеличением вероятности нахождением фермента в функционально активном состоянии (Bazzi, Nelsesruen, 1988; Mochi-Rosen et.al., 1991), можно предположить, что активность этого фермента максимальна в период становления реакции на вазопрессин.
Количество измерений п=18, - р 0.05 по сравнению с 9-12 дневными. Было обнаружено, что экспрессия РКС5 достоверно выше у взрослых кивотных по сравнению с 9-12 и 20-22 дневными крысами (Рис. 11) При этом РКС8 шределялась только в Исходя из денситометрического анализа, можно заключить, что из исследуемых изоформ РКС, наиболее вероятным участником механизма передачи гормонального сигнала представляется кальций - зависимая альфа изоформа, поскольку ее содержание в мембранной фракции максимально у 20-24 дневных животных, что соответсвует возрасту появления реакции на десмопрессин. Для изучения возможного влияния вазопрессина на общее количество или перераспределение РКСа мы провели оценку содержания белка РКСа в цитозольной и мембранной фракциях наружного мозгового вещества почки после инкубации с десмопрессином и дегидратиратации у крыс разных возрастов.
Было показано, что у животных всех исследуемых возрастов 30 мин. инкубация слайсов наружного мозгового вещества почки с десмопрессином не приводит к достоверному изменению суммарного содержания РКСа в цитозольной и мембранной фракциях и не влияет на перераспределение фермента из цитозольной фракции в мембранную (Рис. 13). Кроме того, не было найдено каких либо различий в содержании фермента у дегидратированных 20-24 дневных и взрослых животных по сравнению с контрольными. Это согласуется с литературными данными, полученными на клеточной линии LLC-PK1 и микродиссектированных собирательных трубок внутреннего мозгового вещества согласно которым инкубация с вазопрессином не приводила к транслокации альфа изоформы РКС из цитозольной фракции в мембранную (Dibas et.al., 1996; Chouet.al., 1998). Количество измерений для каждой возрастной группы п=10 Таким образом, было показано, что экспрессия альфа и дельта изоформ РКС изменяется в ходе постнатального онтогенеза. При этом, из исследуемых изоформ РКС, наиболее вероятным участником механизма передачи гормонального сигнала представляется кальций зависимая альфа изоформа. Её содержание в мембранной фракции максимально у 20-24 дневных животных, период становления реакции на десмопрессин. При этом, общее количество РКСа и соотношение фермента в мембранной и цитозольной фракциях достоверно не изменяется при дегидратации животных и инкубации с десмопрессином. Однако, Вестерн-блот не позволяет исследовать вероятные кратковременные изменения активности фермента. Кроме того, стоит отметить, что используемая методика получения цитозольной фракции не исключает загрезнения препарата кусочками мембран, что может приводить к маскированию эффекта десмопрессина и дегидратации животных на перераспределение фермента из цитозольной в мембранную фракцию. Нельзя исключить, что разделение на более высоких скоростях (свыше 100 000g) позволило бы обнаружить влияние dDAVP или водной депривации животного.
