Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1 .Общая характеристика внутриклеточных кальциевых депо нейронов 10
2.Рианодиновые рецепторы 12
2.1.Основные характеристики рианодиновых рецепторов 12
2.2, Регуляция активности рианодиновых рецепторов 13
2.3.Рианодин и дантролен как модуляторы активности
рианодиновых рецепторов 15
Рианодин 15
Дантролен 16
Взаимодействие дантролена и рианодина 17
3 .Роль рианодин-чувствительных кальциевых депо в регуляции
секреции медиатора 18
4.Механизмы запуска выброса кальция из Са2+ депо нервных терминалей 20
5.Взаимодействие выброса кальция из внутриклеточных депо с
ионными каналами наружной мембраны , 21
6.Функциональные последствия опустошения кальциевых депо ...24
7.Спонтанная и вызванная секреция медиатора в нервно-мышечных
синапсах как функция выброса депонированного кальция 26
Спонтанный выброс медиатора 26
Вызванное высвобождение медиатора как многоквантовый выброс .29
Особенности вызванной ритмической активности синапса 31
Депрессия 32
Облегчение 34
Мобилизация медиатора 36
8.Использование кальциевых буферов для анализа
короткоживущих Са - сигналов 37
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
1 .Приготовление нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши 40
2.Внутриклеточная регистрация спонтанных миниатюрных потенциалов
и вызванных токов концевой пластинки 41
2.1. Метод регистрации спонтанной синаптической активности 41
2.2.Эксперименты на синапсах в условиях вызванной
синаптической активности 42
3.Статистическая обработка экспериментальных данных 44
4.Используемые в работе вещества 44
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 45
I.Действие блокаторов рианодиновых рецепторов на
спонтанный выброс медиатора 45
1 .Воздействие дантролена на спонтанный выброс медиатора 45
1.1. Эффекты дантролена на амплитуду и амплитудное
распределение МПКП 46
1.2. Эффекты дантролена на частоту спонтанного выброса 46
2.Воздействие рианодина как блокатора рианодиновых
рецепторов на спонтанный выброс медиатора 49
З.Дантролен как блокатор эффектов рианодина 51
3.1 .Эффекты рианодина на спонтанный выброс медиатора 51
3.2.Эффекты рианодина на фоне действия дантролена 56
Изменения частоты МПКП 56
Изменения средней амплитуды и амплитудного распределения МПКП 57
П.Действие блокаторов рианодиновых рецепторов на
вызванный выброс медиатора 61
1 .Действие дантролена на одиночные ТКП 61
2.Изменение параметров одиночных ТКП на фоне блокады
рианодиновых рецепторов рианодином 62
III.Изменения ритмической активности нервно-мышечных синапсов диафрагмальной мышцы в присутствии
блокаторов рианодиновых рецепторов 64
1 .Частото-зависимые особенности ритмической активности синапсов 64
2.Частото-зависимые эффекты действия дантролена на
рисунки залповой активности синапсов 69
3 .Частото-зависимые эффекты действия рианодина на
рисунки залповой активности синапсов 74
IV.Действие рианодина как активатора рианодиновых
рецепторов на вызванный выброс медиатора 77
1 .Действие активации рианодиновых рецепторов рианодином
на одиночные ТКП 78
2.Эффекты рианодина на рисунки залповой активности синапсов 79
V. Действие блокатора Са2+-АТФазы - тапсигар джина на спонтанный
и вызванный выброс медиатора 83
1 .Действие тапсигарджина на спонтанный выброс ацетилхолина 83
2.Действие тапсигарджина на одиночные ТКП 91
3.Эффекты тапсигарджина на рисунки залповой активности синапсов 93
VI. Действие Са2+-буфера ВАРТА-AM на спонтанный и
вызванный выброс медиатора 97
1 .Действие В APT A-AM на спонтанный выброс ацетилхолина 98
2.Действие ВАРТА-АМ на одиночные ТКП 98
3.Эффекты В АРТА-АМ на рисунки залповой активности синапсов 100
4.Эффекты активатора рианодиновых рецепторов - рианодина
на фоне действия ВАРТА-АМ 102
5.Действие верапамила на спонтанный и вызванный выброс ацетилхолина. 107 б.Эффекты верапамила и рианодина на рисунки залповой активности синапсов на фоне предварительной
инкубации мышцы в растворе ВАРТ А-АМ 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 111
ВЫВОДЫ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124
Введение к работе
Известно, что спонтанная секреция отдельных квантов медиатора относительно независима от поступления кальция из наружной среды и более чувствительна к кальцию, выбрасываемому из внутриклеточных источников (Losavio, Muchnik, 1997). Вместе с тем, сведения о корреляции частоты спонтанной секреции квантов, размеров кванта и других параметров спонтанной секреции с модуляцией активности РиР и наполненностью Са2+-депо кальцием носят фрагментарный характер (Балезина, 2002).
Еще менее изучена связь вызванной многоквантовой секреции медиатора с Са2+-активируемым выбросом депонированного кальция в условиях одиночной и ритмической залповой активности синапсов. Известно, что в моторных синапсах мыши имеют место характерные изменения уровня
выброса медиатора на разных фазах ритмического залпа импульсов. Сначала наблюдается кратковременное облегчение передачи (т.н. начальная фасилятация), сменяющаяся процессом депрессии передачи (постепенного снижения секреции медиатора) с последующей стабилизацией уровня выброса медиатора на сниженном уровне (т. н. фаза «плато» в ритмическом залпе) (Silinsky, 1985; Zucker, Regehr, 2002). Показано, что большинство этих изменений зависят от колебаний уровня внутритерминального кальция (Silinsky, 1985; Zucker, Regehr, 2002; Балезина, 2002). Какой вклад в регуляцию процессов ранней фасилятции, последующей кратковременной депрессии передачи и в процесс стабилизации выброса медиатора на фазе «плато» осуществляет кальций, высвобождаемый из внутритерминальных Са24-депо, остается не изученным. Рассмотрение перечисленных вопросов представляется актуальным как для фундаментальной синаптологии, так и для патофизиологии синапсов и поисков новых путей фармакологической коррекции синаптической передачи.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследовать роль внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляции режимов спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора ацетилхолина (АХ) в моторных синапсах диафрагмы мыши в условиях облегчения, либо подавления активности пресинаптических РиР и рианодин-чувствительных Са -депо терминален.
В работе решались следующие конкретные задачи.
1. Используя регистрацию спонтанных миниатюрных потенциалов концевой
пластинки (МПКП) диафрагмы мыши, выявить изменения частоты и других
параметров МПКП на фоне действия двух блокаторов пресинаптических РиР-
дантролена (10-100 мкМ) и рианодина (в высоких 10-100 мкМ)
концентрациях.
2. Исследовать изменения частоты МПКП под действием экзогенных
избирательных агонистов РиР - кофеина (5мМ) и рианодина (в низких
субмикромолярных концентрациях).
Описать частото-зависимые изменения квантового состава ТКП на фазе начальной фасилятации, последующей депрессии передачи и на фазе «плато» в ходе ритмической активности моторных синапсов.
Исследовать частото-зависимые изменения квантового состава ТКП по ходу ритмического залпа на фоне усиления, либо торможения выброса депонированного кальция с помощью рианодина и дантролена.
Исследовать изменения режима спонтанных МПКП и вызванных ТКП на фоне утечки депонированного Са2+ и опустошения пресинаптических Са2+-депо в условиях блокады тапсигар джином Са2+-АТФазы Са2+-депо терминалей.
6. Исследовать воздействие рианодина (как агониста РиР и стимулятора
высвобождения депонированного кальция) на выброс медиатора на фоне
процедуры забуферивания колебаний [Са2+]вн быстрым Са2+ буфером ВАРТА.
Новизна полученных результатов. В работе получен ряд новых фактов, касающихся участия кальция, выбрасываемого из внутриклеточных депо, в регуляции спонтанной и вызванной секреции квантов АХ. Впервые установлено, что блокада пресинаптических РиР рианодином (10-100 мкМ) вызывает дозозависимое подавление частоты следования МПКП, а также квантового состава одиночных ТКП в моторных синапсах диафрагмы мыши.
Обнаружена ранее неизвестная способность кальция, выбрасываемого из Са2+-депо под действием рианодина (0,5 мкМ), вызывать двунаправленные изменения секреции квантов медиатора в ходе ритмической активности синапсов: при низких (порядка 4 Гц) частотах рианодин подавляет, а при высоких - 70-100 Гц - увеличивает вызванный выброс АХ на фазе "плато". Впервые установлено, что тормозный эффект рианодина обусловлен активацией Са2+-активируемых К+-каналов под действием внутриклеточно высвобождаемого кальция.
Новыми являются и данные, демонстрирующие участие L-типа Са2+-каналов (растормаживаемых под действием внутриклеточного буфера ВАРТА) в активации РиР и опосредовании облегчающих эффектов рианодина
(как агониста РиР) в отношении вызванного выброса медиатора в моторных синапсах мыши.
В работе выявлены ранее неизвестные факты, демонстрирующие связь между опустошением Са2+-депо терминален и активацией каналов наружной мембраны, проводящих ионы кальция в аксоплазму из наружной среды.
Положения, выносимые на зашиту.
В интактных моторных терминалях мыши частота спонтанной секреции на 20-50% зависит от выброса внутриклеточно депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.
В условиях ритмической залповой активности моторных синапсов частично кураризированного нервно-мышечного препарата характерные изменения квантового состава ТКП по ходу залпа (такие как начальная фасилятация, депрессия и процесс стабилизации передачи на фазе "плато") регулируются частотно-зависимым образом со стороны кальция, выбрасываемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.
3. Усиленный рианодином выброс депонированного кальция в
терминалях при ритмической активности моторных синапсов может
приводить к разнонаправленным эффектам: при низких частотах (4 Гц) -
уменьшать квантовый состав ТКП на фазе "плато" за счет активации апамин-
чувствительных Са2+-зависимых К+-каналов терминали, а при высоких
частотах (70-100 Гц) - вызывать увеличение квантового состава ТКП на фазе
"плато".
Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе данные расширяют современные представления о роли рианодин-чувствительных Са2+-депо нервных терминалей в регуляции секреции квантов медиатора в периферических моторных синапсах млекопитающих. В результате проведенных исследований получены новые важные сведения о вовлечении РиР и внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляцию как спонтанной, так и вызванной квантовой секреции медиатора. Впервые в условиях ритмической активности синапсов показана способность
внутриклеточно высвобождаемого кальция вызывать не только облегчающее, но и тормозное действие на секрецшо АХ путем вовлечения в активность Са +-зависмых К+-каналов наружной мембраны. Этот факт позволяет говорить о наличии в терминалях моторных синапсов мыши тесной функциональной сопряженности работы Са2+-зависимых каналов наружной мембраны, Са2+-активируемых Са2+-депо и процессов Са2+-зависимой секреции АХ. Научную ценность представляют и описанные особенности участия депонированного кальция в регуляции рисунка залповой активности моторных синапсов: способность частото-зависимым образом контролировать процесс начальной фасилятации, а также - уровень выброса АХ на поздних, отставленных стадиях залпа, в особенности - на фазе "плато". Обнаруженная в работе способность избирательных агонистов РиР облегчать и поддерживать ритмическую синаптическую передачу путем усиления вызванного выброса медиатора, имеет ценность не только для фундаментальных знаний о Са2+-зависимой регуляции секреции медиатора, но и для решения прикладных задач: поиска новых классов фармакологических соединений, способных усиливать ослабленную синаптическую передачу в условиях ее патологии у моторных синапсов млекопитающих.
