Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Регуляция водного обмена в организ,ме млекопитающих. Роль вазопрессина 9
1.2. Почка как основной эффектор регуляции водного гомеостаза 13
1.3. Транспорт воды через эпителий собирательных трубок почки млекопитающих 16
1.3.1. Пути реабсорбции воды через эпителий собирательных трубок 16
1.3.2. Аквапорины - белки, формирующие водные каналы 18
1.4. Механизм регуляции транспорта воды через эпителий собирательных трубок почки 24
1.4.1. Механизм регуляции вазопрессином водной проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок 24
1.4.2. Альтернативаная регуляция водной проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок 29
1.4.3. Регуляция водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок 30
1.5. Становление механизма трансдукции сигнала АДГ в постнатальном онтогенезе 32
1.6. Заключение 35
Глава II. Материалы и методы 36
2.1. Экспериментальные животные 36
2.2. Измерение водной проницаемости эпителия собирательных трубок 36
2.2.1. Получение фрагментов собирательных трубок 36
2.2.2. Оценка коэффициента водной проницаемости базолатеральной мембраны 37
2.2.3. Исследование влияния dDAVP и HgCl2na водную проницаемость базолатеральной мембраны собирательных трубок 39
2.2.4. Исследование водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок 40
2.3. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция 41
2.3.1. Выделение тотальной матричной РНК 41
2.3.2, Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция 42
2.4. Расчеты 45
2.4.1. Расчет коэффициента водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательных трубок 45
2.4.2. Расчет коэффициента водной проницаемости общей поверхности собирательных трубок 46
2.4.3. Статистика 47
Глава III. Результаты исследований 48
3.1. Оценка водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательных трубок наружного и внутреннего мозгового вещества почки крыс 48
3.2. Экспрессия генов AQP 2,3,4 и V2 рецептора вазопрессина в наружном и внутреннем мозговом веществе почки при дегидратации животных 51
3.3. Влияние dDAVP на водную проницаемость общей поверхности клеток собирательных трубок мозгового вещества почки крыс в постнатальном онтогенезе 56
3.4. Влияние dDAVP на водную проницаемость базолатеральной поверхности OMCD животных в постнатальном онтогенезе 58
3.5. Экспрессия генов AQP 2,3,4 в мозговом веществе почки крыс в ходе постнатального развития 61
3.6. Заключение 65
Глава IV. Обсуждение 66
Выводы 76
Список цитированной литературы 77
- Почка как основной эффектор регуляции водного гомеостаза
- Становление механизма трансдукции сигнала АДГ в постнатальном онтогенезе
- Оценка водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательных трубок наружного и внутреннего мозгового вещества почки крыс
- Экспрессия генов AQP 2,3,4 в мозговом веществе почки крыс в ходе постнатального развития
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из фундаментальных функций живого организма, определяющих его жизнеспособность, является поддержание водно-солевого гомеостаза. В реализации этой функции у млекопитающих основная роль принадлежит почке. Важнейшим регулятором водовыделительной функции почки является нейро-гипофизарный гормон - вазопрессин (антидиуретический гормон - АДГ) (Berliner, Benett, 1967). В основе антидиуретического действия вазопрессина лежит повышение реабсорбции воды в эпителии собирательных трубок (Morel, Doucet, 1986). Поскольку функционирование каждого звена передачи гормонального сигнала необходимо для осуществления почкой ее осморегулирую-щей роли в организме, значимость изучения молекулярных механизмов действия этого гормона не вызывает сомнений. В настоящее время значительный успех в исследовании внутриклеточных событий, вовлекаемых в антидиуретическое действие вазопрессина, связан с открытием специфических белков -аквапоринов, обеспечивающих поток воды через клеточную мембрану (Agre et al., 1993; Preston et al., 1992; Ma T, 1993; Inase et al., 1995; Frigeri et al., 1995; Sasaki et al., 1998; Verkman, Mitra, 2000). Однако, несмотря на прогресс знаний в этой области, многие аспекты действия вазопрессина остаются неясными. Среди них - процессы созревания механизма передачи сигнала вазопрессина в клетках эпителия почки незрелорождающих млекопитающих в постнатальном онтогенезе, включая период вининга. В период вининга завершается формирование всего комплекса регуляторных систем водно-солевого гомеостаза, приспосабливающих работу почки к потребностям организма (DIouha, 1976). Наряду с интенсивным изучением клеточного механизма действия вазопрессина в зрелой почке, исследования его формирования в онтогенезе относительно немногочисленны и носят фрагментарный характер. В то же время, понимание процесса становления гормональной компетентности почки необходимо для прояснения путей поддержания водно-солевого гомеостаза в ходе лостнаталь-ного развития.
Другой важный аспект проблемы - влияние вазопрессина на транспорт воды через базолатеральную мембрану клеток собирательных трубок, В настоящее время принята точка зрения, согласно которой трансцеллюлярный поток воды
через эпителий собирательных трубок определяется проницаемостью апикальной мембраны клетки, а водная проницаемость базолатеральной мембраны не является лимитирующей и не регулируется (Flamion, Spring, 1990). Вместе с тем, показано, что при длительной водной депривации животных или при воздействии вазопрессина, увеличивается экспрессия генов водных каналов, локализованных в базолатеральной мембране собирательных трубок (Terris et al., 1995; Umenishi etal., 1996; Murillo-Carretero etal., 1999). Таким образом, изучение механизмов регуляции водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток эпителия собирательных трубок, а также их формирование в ходе пост-натального онтогенеза становятся актуальной задачей в исследовании осморе-гулирующей функции почки.
Сложная морфофункциональная организация почки и многоступенчатая система контроля ее осморегулирующей функции делают необходимым для изучения действия вазопрессина на водную проницаемость эпителия вычленение роли отдельных частей нефрона и собирательных трубок. Создание в нашей группе ряда методов оценки водной проницаемости эпителия позволило проводить исследования на изолированных фрагментах собирательных трубок почки.
Учитывая все вышеизложенное, были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.
Целью исследования являлось изучение механизмов становления реакции осморегулирующего эпителия собирательных трубок почки крыс на вазопрес-син в ходе постнатального онтогенеза.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Получить данные о влиянии водной депривации и dDAVP на водную проницаемость базолатеральной мембраны эпителия собирательных трубок внутреннего и наружного мозгового вещества почки взрослых крыс. Оценить содержание мРНК V2 рецептора вазопрессина и аквапо-ринов 2,3,4 типов в различных зонах мозгового вещества почки дегидратированных и гидратированных крыс.
Оценить коэффициент осмотической водной проницаемости (Р) общей поверхности клеток изолированных собирательных трубок мозгового вещества почки крыс разного возраста. Выявить влияние агониста V2
рецепторов вазопрессина dDAVP на данный параметр в ходе постнатального онтогенеза.
3. Исследовать онтогенетический профиль экспрессии в мозговом веще
стве почки крыс генов ключевых звеньев механизма передачи сигнала
вазопрессина - V2 рецептора, аквапорина 2-го типа, а также водных ка
налов базолатеральной мембраны — аквапоринов 3 и 4.
4, Изучить водную проницаемость базолатеральной мембраны эпителия
изолированных собирательных трубок почки крыс в ходе постнатально
го развития. Выявить влияние dDAVP на Р базолатеральной мембраны
эпителия собирательных трубок мозгового вещества почки крыс в онто
генезе.
Научная новизна.
С использованием разработанного в нашей лаборатории метода впервые показано, что водная проницаемость базолатеральной поверхности собирательных трубок взрослых крыс повышается как при 48-часовой дегидратации животных, так и при кратковременном воздействии агониста V2 рецепторов вазопрессина (dDAVP) на изолированные канальцы. Одним из механизмов, обеспечивающих это повышение, является активация экспрессии генов аквапоринов 2,3,4 и V2 рецептора вазопрессина.
Показано, что нестимулированная водная проницаемость общей поверхности клеток собирательных трубок, включающей апикальную и базолатераль-ную мембраны, в мозговом веществе почки не меняется в ходе постнатального онтогенеза. Установлено, что повышение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок в ответ на dDAVP отсутствует у 10 и 22-х дневных крысят, и может быть зарегистрировано только к 25-му дню постанального развития.
Методом ОТ-ПЦР показано, что содержание мРНК аквапорина 2 и V2 рецептора вазопрессина в мозговом веществе почки повышается в ходе постнатального развития, в то время как содержание мРНК аквапоринов 3 и 4 не меняется.
Установлено, что dDAVP вызывает повышение водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательных трубок наружного мозгового вещества почки начиная с 22-х дневного возраста. Впервые обнаружено, что нестиму-
лированная водная проницаемость базолатеральпой мембраны собирательных трубок понижается в ходе постнатального развития, в то время как амплитуда реакции на dDAVP возрастает.
Практическая значимость.
Полученные данные дополняют и расширяют существующие представления о механизмах действия вазопрессииа в эпителии собирательных трубок почки. Кроме того, результаты данного исследования могут иметь и прикладное значение, поскольку дефект любого из звеньев механизма передачи гормонального сигнала вазопрессииа приводит к нарушениям водно-солевого гомео-стаза.
Апробация материалов диссертации.
Материалы диссертации доложены на Всемирном конгрессе по нейроги-пофизарным гормонам (Edinburgh, 1999), на XXXIV интернациональном конгрессе физиологических наук (Christchurch, 2001), на IX Всероссийской конференции по физиологии почек (Санкт-Петербург, 2001), на конференции, посвященной 80- летию со дня рождения М. Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на XI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2003), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), на Всемирном конгрессе по нефрологии «Nephrology dialysis transplantation» (Berlin, 2003), на Объединенном конгрессе «Нефрология и диализ сегодня» (Новосибирск, 2003), на III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003).
По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах и 10 тезисов докладов.
Почка как основной эффектор регуляции водного гомеостаза
Во втором случае вода должна диффундировать через плотные контакты между клетками эпителия. Одним из приверженцев идеи об осмотическом токе воды через межклеточное пространство был А.Г. Гинецинский. В гликокаликсе клеток, в межклеточном пространстве и базальной мембране эпителия почки присутствуют гликозаминогликаны, основу которых образуют гиалуроновые кислоты. Согласно концепции Гинецинского, изменение состояния и содержания гликозаминогликанов в межклеточном пространстве и в соединительной ткани, окружающей собирательные трубки, прямые сосуды и тонкие нисходящие части петли Генле, может оказывать влияние на реабсорбцию воды. Одним из возможных механизмов регуляции движения воды по градиенту осмолярности представлялось изменение водной проницаемости гликокаликса клеток эпителия и интерстиция вокруг собирательных трубок под воздействием вазопрессина. Гинецинский предположил, что АДГ стимулирует отделение фермента гиалуронидазы, деполимеризугащей гиалуроновую кислоту межклеточных пространств эпителия собирательных трубок, и этот барьер становиться высокопроницаемым для потока воды по осмотическому градиенту (Ginetzinsky, 1958). В последнее время появились данные, подтверждающие возможность движения воды по межклеточному пространству. Эксперименты по оценке величин потоков через апикальную и базолатеральную мембраны показали, что пара-целлюлярный путь может составлять до 50% от величины суммарного потока воды через эпителий (Flamion, Spring, 1995).
Продемонстрировано изменение содержания гиалуроновых кислот в зависимости от водного баланса организма (Hansell et al., 2000), что подтверждает участие гликозаминогликанов в поцессах концентрирования мочи. В экспериментах по введению антисыворотки против гиалуронидазы мозгового вещества почки, крысы были не способны концентрировать мочу в ответ на водную депривацию или вазопрессин (Law, Roven, 1981). Помимо гиалуронидазы, под действием АДГ повышается активность и других ферментов в мозговом веществе почки, также участвующих в деградации гиалуроновой кислоты (Ivanova, Goryunova, 1981; Ivanova et al., 1985). В экспериментах на мочевом пузыре амфибий, который является функциональным аналогом собирательных трубок почки млекопитающих, было продемонстрировано, что вазопрессин повышает активность ферментов, вовлеченных в гидролиз гиалуроновых кислот, и вызывает их высвобождение из клеток посредством цАМФ-зависимого механизма (Ivanova, Melidi, 2001). Таким образом, идея о движения воды межклеточным путем подтверждена экспериментально и продолжает активно исследоваться. Тем не менее, широко распространенным является представление о транцел-люлярном потоке воды, как основном пути диффузии воды (Strange, Spring, 1987). Уникальные транспортные характеристики каждого эпителия обусловлены наличием специфического профиля функционально различных транспортеров и каналов, распределенных между апикальной и базолатеральной поверхностью клеток в зависимости от клеточного типа. Согласно современным представлениям, водная проницаемость плазматических мембран клеток обусловлена присутствием водных каналов, сформированных белками аквапорина-ми (AQP).
Предположение о существовании в мембране водных каналов было продиктовано расхождением между расчетным и фактическим значением энергии активации, необходимой для транспорта воды через бислой липидов (Sidel, Solomon, 1957). За открытие водных каналов, сформированных белками аква-поринами, Peter Agre был удостоен Нобелевской премии по химии в 2003 году. Это открытие позволило разрешить проблему избирательной проницаемоси для воды биологических мембран (Agre et al., 1987; Preston, Agre, 1991).
К семейству аквапоринов относятся белки, обладающие высокой степенью гомологии с МІР белком (МІР - major intrinsic protein). МІР или AQPO - белок размером 26 kDa, осуществляющий транспорт воды в хрусталике (Fitzgerald et alM 1983; Francis et al., 2000; Shiels et al., 2001; Verkman, 2003).
Аквапорины представляют собой гидрофобные белки с шестью трансмембранными доменами и цитоплазматическими NH2 и СООН концами (Preston et al,, 1994; Skach et al., 1994; Bai et al., 1996). Молекулярный размер аквапоринов варьирует от 26 до 40 kDa. Аквапорины формируют каналы, осуществляющие транспорт воды через клеточные мембраны по осмотическому градиенту. При электронно-микроскопическом исследовании мембран клеток, методом замораживания-скалывания было показано, что в мембране аквапорины образуют тетрамеры, но при этом каждый мономер формирует функциональную водную пору (Smith, 1991; Verbavatz et al., 1993; Jung et al., 1994; Shi et ah, 1994; Walz et al., 1997). Идентичность экспериментально измеренных величин осмотической водной проницаемости при набухании и осмотическом сжатии Xenopas ооцитов, экспрессирующих различные типы аквапоринов, послужило доказательством двусторонней проницаемости каналов для воды (Meinild et al., 1998).
Аквапорины были обнаружены в клетках растений, бактерий и животных. В настоящее время у млекопитающих клонировано и охарактеризовано около 10 типов аквапоринов, экспрессирующихся в различных тканях (Nielsen et al., 2002). Соответственно структуре гена, гомологии аминокислотной последовательности и функции все водные каналы млекопитающих можно разделить на две большие группы: строго специфичные «аквапорины», проницаемые только для воды, и «акваглицеропорины» помимо воды пропускающие глицерин, мочевину и даже более крупные молекулы (Inase et al., 1995; Sasaki et al., 1998). К первой группе относятся AQPO, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6, AQP8 ко второй AQP3, AQP7, AQP9 (Verkman, Mitra, 2000; Agre, 2000). Акваглицеропо-рины содержат дополнительные 15-20 аминокислот во внеклеточных петлях (Verkman, Mitra, 2000).
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей выявил несколько консервативных последовательностей, характерных для всех аквапоринов. Физиологическое значение придают двум «NPA» (Asn-Pro-Ala) мотивам, присутствующим в В и Е внеклеточных петлах (Рис.3). Были предложены 3 модели структурной организации аквапоринов: модель «песочных часов», модель а-спирали и 0- структурная модель.
Становление механизма трансдукции сигнала АДГ в постнатальном онтогенезе
Известно, что почки новорожденных незрелорождающих млекопитающих не способны продуциовать мочу, гипертоничную по отношению к плазме крови (Nash, Edelman, 1973; Dlouha, 1976;Elinderatal., 1980). При этом иммунологические исследования показали присутствие вазопрессина в нейрогипофизе эмбрионов крыс (Almazan et. al., 1989; Laurent et al., 1989). Новорожденные крысята способны повышать уровень циркулирующего гормона в ответ на осмотический стимул или водную депривацию (Sinding et al., 1980).
Гиперосмомия интерстиция мозгового вещества почки обусловлена его структурно-функциональной организацией. Система канальцев мозгового вещества почки у крыс развивается после рождения, при этом происходит удлинение петель отдельных нефронов и увеличения их числа (Goncharevskaya, Dlouha, 1975; Subdelin, Bohman, 1990). Из этого следует, что противоточная система осмотического концентрирования должна постепенно формироваться в постнатальном онтогенезе. Вазопрессин начинает играть регуляторную роль у крыс между 2-й и 3-й неделей после рождения. Критическим для развития осморегулирующих механизмов является период перехода от молочного вскармливания к самостоятельному питанию (вининг) (Aperia, НегІп, 1975; Dlouha, 1976; Zing, Horster, 1977). Именно в этом возрасте значительно повышается осмолярность мочи в ответ на 24 часовую дегидратацию. По-видимому, одной из причин отсутствия функционального ответа на вазопрессин, на уровне эпителия собирательных трубок, является незрелость внутриклеточных механизмов обусловливающих передачу гормонального сигнала.
На биохимическом уровне V2 рецепторы определяются в развивающейся почке крыс. С момента рождения до конца периода вининга показано постепенное возрастание их количества в собирательных трубках (Ammar et al., 1992).
В процессе созревания почечной функции продемонстрировано параллельное повышение вазопрессин-связывающей способности и гормонального ответа (Соленов, Иванова, 1985; Ammar et al., 1992). Но, по всей видимости, природа формирования рецепции вазопрессина более сложна, чем просто повышение числа рецепторных единиц. В процессе развития почечных канальцев происходят значительные качественные изменения структуры рецепторов вазопрессина. Оценка молекулярной массы солюбилизированных рецепторов путем гель-фильтрации позволила предположить, что V2 рецептор состоит из нескольких субъединиц относительно небольшого размера. В отсутствии гормона у взрослых животных эти субъединицы удерживаются в агрегированном состоянии, но легко разъединяются у животных раннего возраста. Природа фактора, способного удерживать субъединицы рецептора в агрегированном состоянии еще не выяснена (Иванова и др., 1989). Существуют данные, позволяющие предположить что в раннем постнатальном периоде существует несовершенство как самого рецептора, так и сопрягающего компонента при наличии функционально способного каталитического компонента аденилатциклазного комплекса (Иванова и др., 1990). Согласно результатам Imberteboul et al. вазопрессин-зависимая активация аденилатциклазы у 3-х дневных крысят составляет 25-30% от уровня взрослых животных (Imberteboul et al., 1984).
В процессе становления физиологической реакции на вазопрессин происходят определенные изменения и свойств сопрягающих G-белков. Причины наблюдаемых различий функциональных показателей и хроматографической подвижности мембранных комплексов гуанин-связывающих белков у животных раннего возраста, ареактивных к вазопрессипу, и взрослых пока остаются не ясными (Соленов, Иванова, 1997).
Значительный вклад в цитоплазматическую рецепцию цАМФ обусловлен регуляторными субъединицами цАМФ-зависимой протеинкиназы (РКА). Было показано, что свойства цитозольных рецепторов цАМФ меняются в период созревания почки и проявления эффекта вазопрессина. Не исключено, что в период вининга происходит смена типов регуляторных субъединиц, и свойства цАМФ-связывающих белков становятся более адекватными для регуляции активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (Соленов, Иванова, 1985). AQP2 и AQP3 экспрессируются во время эмбриональной жизни и в период непосредственно после рождения в почках крыс, хотя и в меньшей степени чем у взрослых (Baumetal., 1998; Yasuietal., 1996;Tsukaharaetal., 1998). Показано что в довининговом периоде постнатального онтогенеза экспрессия AQP2 повышается при дегидратации. Кроме того, при действии аналога вазопрессина AQP2, локализованный во внутриклеточных везикулах, встраивается в плазматическую мембрану (Bonilla-Felix, Jiang, 1997). Следовательно, отсутствие ответа на вазопрессин и неспособность почек к концентрированию мочи во время эмбриогенеза и непосредственно после рождения не является следствием отсутствия экспрессии AQP2. Наиболее быстрое повышение концентрирующей функции почек наблюдается в период вининга. Подобный характер развития наблюдается в уровне AQP2 мРНК в мозговом веществе почки. Экспрессия мРНК трех других транспортеров, включенных в процесс концентрирования: а- субъединицы медуллярной Na-K-АТФаза , Na-K-2C1 переносчика, и эпителиального хлорного канала, также повышается во время вининга и регулируется глюко корти ко идами (Yasui et ah, 1996). По-видимому, существует синхронизированное развитие многих компонентов, определяющих способность почки к концентрированию мочи.
Таким образом, возникновение компетентности почки млекопитающих к вазопрессину в период вининга является результатом количественных и качественных изменений, происходящих в молекулярных механизмах гормонального ответа.
Регуляция вазопрессином реабсорбции воды в эпителии собирательных трубок является одним из главных компонентов в системе поддержания водно-солевого гомеостаза в организме млекопитающих. С развитием методов молекулярной биологии этот процесс начал активно изучаться и на субклеточном уровне. В последнее десятилетие прогресс в понимании молекулярных механизмов регуляции вазопрессином транспорта воды через эпителий собирательных трубок в значительной мере связан с клонированием V2 рецептора и аква-поринов AQP 2,3 и 4. Вместе с тем, открытие целого ряда белков, участвующих в передаче и реализации гормонального сигнала, ставит пред исследователями множество новых вопросов. Так, остаются неясными механизмы регуляции водной проницаемости через базолатеральные мембраны главных клеток. Кроме того, мы располагаем очень ограниченными сведениями в плане выяснения путей формирования почечного ответа на вазопрессин в онтогенезе.
В связи с этим целью настоящей работы было изучение становления гормональной компетентности эпителия собирательных трубок к вазопрессину в ходе постнатального развития. Особый интерес представляло исследование вазоп-рессин-зависимой регуляции базолатеральиой поверхности собирательных трубок.
Оценка водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательных трубок наружного и внутреннего мозгового вещества почки крыс
В настоящее время проблема регуляции водной проницаемости базолате-ральной мембраны клеток эпителия собирательных трубок остается в значительной мере нерешенной. Результаты исследований водной проницаемости плазматических мембран клеток собирательных трубок, проводимых разными исследовательскими группами, привели к заключению о том, что величина Р. базолатеральной мембраны не является лимитирующей для величины осмотической водной проницаемости эпителия. Согласно оценкам, площадь базолатеральной мембраны в 7-8 раз превышает площадь апикальной, и Р, базолатеральной мембраны в присутствии вазопрессина сравнима с Р. апикальной мембраны (Strange, Spring, 1987; Flamion, Spring, 1990). Вместе с тем, показано, что при длительном воздействии вазопрессин увеличивает количество белка и экспрессию гена AQP3 (Ecelbarger et al., 1995) и, следовательно, может повышать водную проницаемость базолатеральной мембраны.
Candia с соавторами оценили диффузионную водную проницаемость базолатеральной мебраны мочевого пузыря амфибий, который является функциональным аналогом собирательной трубок почки млекопитающих. В этих экспериментах водная проницаемость апикальной мембраны была повышена за счет обработки амфотерицином В и не являлась скорость-лимитирующей (Candia et al., 1997). Согласно полученным результатам, смена раствора, омывающего базолатеральную поверхность мочевого пузыря, на гипотонический, приводила к снижению диффузионной водной проницаемости на 32%. Авторы делают вывод о возможной регуляции водной проницаемости базолатеральной мембраны (Candia et al., 1997).
Для исследования транспорта воды через биологические мембраны широко применяются методы с использованием флюорофорных красителей (Chen et al., 1988; Srinivas, Bonanno, 1997; Zelenina, Brismar, 2000), помимо этого развиваются и новые аппаратные подходы на основе эффекта полного внутреннего отражения, интерферометрического измерения толщины клеточного монослоя, использование конфокального микроскопа и др (van Heeswijk. , van Os, 1986; Martial, Ripoche, 1991; Farinas et al., 1995; Rivers et al., 1996; Marie et al„ 2001; Solenov et al., 2002). Как правило, эти методы, за исключением микроперфузии, позволяют измерять водную проницаемость в монослоях культур клеток, которые как функциональная модель имеют ограничения, особенно для онтогенетических исследований. В этой связи нами был разработан новый метод для оценки транспорта воды через эпителий микродиссектированных собирательных трубок, основанный на видеозаписи изменения объема клеток собирательной трубки в ответ на создание трансмембранного осмотического градиента и последующей морфометрической обработки изображения. Используемый нами метод не позволяет учитывать парацеллюлярный путь движения воды через эпителий.
Мы провели ряд экспериментов по оценке осмотической водной проницаемости базолатеральной мембраны микродиссектированных фрагментов собирательных трубок внутреннего и наружного мозгового вещества почки. В первой серии экспериментов мы оценивали водную проницаемость базолатеральной мембраны собирательных трубок дегидратированных и гидратированных крыс. В условиях свободного доступа к пище и воде у крыс проявляются значительные индивидуальные колебания осмолярности мочи, обусловленные уровнем эндогенного вазопрессина. Для исключения этого, в качестве контрольных нами использовались гидратированные животные, с максимально пониженным уровнем эндогенного вазопрессина. Согласно полученным результатам, значения Р базолатеральной мембраны как OMCD так и IMCD, взятых от дегидратированных крыс, значительно выше по сравнению с таким же параметром у гидратированных животных. По-видимому, активация процессов реабсорбции воды в эпителии собирательных трубок при дегидратации требует облегчения транспорта воды как через апикальную, так и через базолатеральную мембраны. Этот факт указывает на существование связи между повышением уровня эндогенного вазопрессина и возрастанием водной проницаемости базолатеральной мембраны эпителия собирательной трубки.
Прогресс в понимании механизма действия вазопрессина на осморегули-рующий эпителий почки в последнее десятилетие был в значительной мере связан с открытием водных каналов, за которыми в настоящее время устоялось название аквапорины (Agre et al., 1987; Preston, Agre, 1991). Для объяснения повышенной водной проницаемости базолатеральной мембраны в условиях водной депривации наиболее вероятной представляется гипотеза об увеличении синтеза аквапоринов de novo. Как известно, водная проницаемость всех изученных водных каналов, за исключением AQP4, ингибируется препаратами ртути (Shi, Verkman, 1996). В базолатеральной мембране собирательных трубок мозгового вещества почки экспрессируются как AQP3, так и ртуть-нечувствительный AQP4 (Terris et al., 1995). В OMCD ртуть значительно подавляла перенос воды через базолатеральную мембрану как дегидратированных, так и гидратированных животных, у которых достигается наибольшее физиологическое подавление процесса реабсорбции. При этом процент подавления у дегидратированных крыс был меньше. По-видимому, в условиях водной деприв-ции в наружном мозговом веществе почки возрастает экспрессия ртуть-нечувствительного AQP4, что подтверждается данными ОТ-ПЦР. ВIMCD гидратированных животных водная проницаемость базолатеральной мембраны также снижалась при воздействии хлорной ртути. При этом процент снижения был значительно меньше, чем в OMCD. Эти результаты хорошо согласуются с данными литературы, согласно которым ртуть-нечувствительный AQP4 неравномерно распределен по собирательной трубке и экспрессируется, главным образом, во внутреннем мозговом веществе (Terris et al., 1995). У нокаут-ных по AQP4 мышей отмечена пониженная водная проницаемость собирательных трубок внутреннего мозгового вещества почек (Chou et al., 1998).
У дегидратированных животных хлорная ртуть подавляет водную проницаемость базолатеральной мембраны IMCD, но процент подавления меньше чем у гидратированных. Это может быть связано с повышением экспрессии генов ртуть-чувтсвительных аквапоринов, представленных, в нашем случае, AQP3 и, возможно, AQP2. Это предположение подтверждается результатами ОТ-ПЦР оценки, согласно которым при дегидратации в IMCD возрастает экспрессия как AQP4 так и аквапоринов 2 и 3. Повышение при дегидратации экспрессии аквапоринов 2 и 3 во внутреннем мозговом веществе почки, как на уровне мРНК, так и на уровне белка описано также в литературе (Terris et al., 1996; Ishibashi et al,, 1997). Механизмы регуляции экспрессии AQP2 широко описаны в литературе (Matsumura et al., 1997; Uchida et al., 1994; Hozawa et al., 1996; Rai et ah, 1997; Yasui et al., 1997; Sasaki et al., 1998), и главным образом связаны с активацией цАМФ/РКА системы. В то же время механизмы регуляции эксп рессии AQP3 изучены в меньшей степени. Введение вазопрессина крысам Brattleboro, с отсутствием эндогенного гормона, приводит к повышению экспрессии AQP3 (Terris et al., 1996). Данный факт говорит в пользу того, что сигнальной молекулой для усиления экспрессии AQP3 при дегидратации является вазопрессин. Изестно, что вазопрессин, действуя через V2 рецептор, вызывает также повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ (Star et al., 1988; Champigneulle et al., 1993; Maeda et al., 1993; Ecelbarger et al., 1996). В промо-торном регионе гена AQP3 присутствует цАМФ-респонсивный элемент (Inase et al., 1995). Однако, как было показано с использованием репортной системы, активность промотора гена AQP3 повышается при воздействии форболовыми эфирами, но не повышается цАМФ (Inase et al., 1995). Повышение содержания Са2+ может усиливать экспрессию AQP3 через АР2 сайт. Следовательно, можно предположить, что стимуляция вазопрессином генной экспрессии AQP3 может быть опосредована Са2+-зависимыми механизмами.
В ряде работ было показано, что активация РКС подавляет экспрессию гена AQP4 (Nakahama et al., 1999; Yamamoto et al., 2001). Механизмы регуляции экспрессии гена AQP4 в условиях водной депривации организма остаются неясными.
Экспрессия генов AQP 2,3,4 в мозговом веществе почки крыс в ходе постнатального развития
В экспериментах по оценке осмотической водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок мы показали, что нестимулирован-ная водная проницаемость общей поверхности клеток собирательных трубок не меняется в ходе постнатального онтогенеза. Физиологический ответ эпителий собирательных трубок на агонист V2 рецепторов вазопрессина отсутствует у 10 и 22-х дневных животных. Десмопрессин повышает водную проницаемость клеток собирательных трубок крыс начиная с 25-ти дневного возраста. Это хорошо согласуется с данными литературы, согласно которым в этот период онтогенеза происходит интенсивное становление механизмов, обеспечивающих в дальнейшем регуляцию транспорта воды через эпителий (Aperia, Herin, 1975; DIouha, 1976). Согласно полученным результатам, десмопрессин вызывает увеличение водной проницаемости клеток собирательных трубок 60-ти дневных животных в 2.4 раза, в то время как по данным литературы вазопрес-син увеличивает водную проницаемость изолированных собирательных трубок в 10-20 раз (Horster, Zink, 1982; Reif et al., 1984). Эта разница объясняется достаточно высокой водной проницаемостью клеток собирательных трубок в отсутствие гормона в наших условиях эксперимента. В наших экспериментах, когда тестируемые клетки непосредственно контактируют со средой как минимум с двух сторон, эффект изменения проницаемости апикальной поверхности в гиперосмотической среде маскируется высокой проницаемостью базолате-рапьных мембран.
Основная роль в изменении водной проницаемости эпителия собирательных трубок при действии вазопрессина в настоящее время отводится аквапори-ну 2. В условиях действия вазопрессина AQP2 перемещается в апикальную мембрану главных клеток, обусловливая ее повышенную проницаемость для воды (Hayashi et al., 1994; Hayashi et al., 1996; Marples et al,, 1998; Takeaki et al., 1999). В данной работе мы показали постепенное повышение содержания мРНК AQP2 и V2 рецептора в мозговом веществе почки в ходе постнатального онтогенеза, что может указывать на увеличение экспрессии соответствующих генов. Пониженная, по сравнению с взрослыми животными, экспрессия гена AQP2 была отмечена ранее у новорожденных крысят (Nielsen et al., 1996), В литературе также описано повышение плотности V2 рецепторов в мембране в ходе постнатального онтогенеза (Ammar et al., 1992). Вероятно, недостаточная экспрессия генов, кодирующих V2 рецептор и AQP2, вносит свой вклад в отсутствие реакции почек животных раннего возраста на АДГ. Вместе с тем, согласно нашим результатам и данным литературы (Ammar et al., 1992; Bonilla-Felix, Jiang, 1997; Baum et al., 1998; Tsukahara et al., 1998), экспрессия AQP2 и V2 рецептора в довининговый период постнатального онтогенеза хотя и ниже чем у взрослых животных, но может быть достаточна, чтобы обеспечить заметный физиологический ответ. По-видимому, в основе становления реакции главных клеток собирательных трубок на вазопрессин, лежит консолидация всех звеньев механизма передачи гормонального сигнала. Таким образом, к 20-22-му дню жизни эпителий собирательных трубок почки крыс еще нечувствителен к АДГ, о чем говорит отсутствие эффекта данного гормона на водную проницаемость общей поверхности клеток собирательных трубок. Однако в это время в клетке активизируются молекулярные механизмы, обеспечивающие в дальнейшем увеличение экспрессии V2 рецептора и AQP2,
В экспериментах по оценке і5 базолатеральной мембраны мы показали, что нести мул ированная водная проницаемость базолатералыюй поверхности OMCD у 10 и 22-х дневных крысят достоверно выше, чем у взрослых животных. В то же время, экспрессия мРНК AQP3 и AQP4 не меняется в ходе постнатального онтогенеза. Подобный характер эксперссии белка AQP4 в мозговом веществе почки крыс в ходе постнатального онтогенеза был продемонстрирован и с использованием иммуногистохимических методов (Kim et al., 2001). Содержание мРНК аквапорина 2 в мозговом веществе почки повышается с 10 -го по 60-ый день жизни. По-видимому, понижение нестимулированной водной проницаемости базолатеральной мембраны OMCD в онтогенезе не связано с уменьшением экспрессии водных каналов в клетке. Одним из возможных объяснений данного феномена является предположение о незрелости у животных раннего возраста механизмов обеспечивающих направленное движение AQP2 в апикальную мембрану. Другим возможным предположением является смена изо-форм аквапоринов в ходе постнатального онтогенеза. Так, известно, что две изоформы белка AQP4 -Мій М23 кодируются, по крайней мере, четырьмя изоформами мРНК - Ml, М23, М23Х и М23А (Бондарь и др., 2002; Zelenin et al., 2000). Экспрессия различных изоформ мРНК данного белка в мозге отличается у новорожденных и взрослых животных (Zelenin et al., 2000). Изоформы мРНК М23, М23Х и М23А имеют далеко разнесенные по гену старты транскрипции и кодируют одну изоформу белка- М23 (Бондарь и др., 2002; Ma et al., 1996; Zelenin et al., 2000). По-видимому, экспрессия различных изоформ мРНК контролируется разными, возможно независимо функционирующими, промоторами гена AQP4, активность которых может значительно отличаться на разных стадиях онтогенеза.
Величина водной проницаемости базолатеральной мембраны OMCD 10-ти дневных животных совпадает с Р. 22-х дневных и взрослых животных после инкубации с десмопрессином. Можно предположить, что данный уровень водной проницаемости является максимально возможным для базолатеральной поверхности OMCD. По-видимому, в ходе постнаталыюго развития происходит формирование механизмов, обеспечивающих снижение максимального уровня проницаемости для воды базолатеральной мембраны в контрольных условиях. В экспериментах по оценке водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок в онтогенезе, мы не наблюдали изменение нестимулированной водной проницаемости общей поверхности клеток эпителия OMCD в онтогенезе, тогда как нестимулированная проницаемость базолатеральной мембраны достоверно понижается. Следовательно, можно предположить, что постоянная величина Р общей поверхности клеток собирательных трубок в ходе постнатального онтогенеза, при снижении водной проницаемости базолатеральной мембраны, говорит о возрастании Pf апикальной мембраны.
Обнаружив влияние десмопрессина на базолатеральную мембрану OMCD, мы сделали попытку проследить появление этого эффекта в ходе постнатального онтогенеза. Согласно полученным данным, десмопрессин не влияет на водную проницаемость эпителия собирательных трубок 10-ти дневных крысят, достоверное повышение Pf в ответ на инкубацию с dDAVP наблюдается с 22-х дневного возраста. Эти результаты хорошо коррелируют с данными по изучению водной проницаемости общей поверхности клеток OMCD в онтогенезе, согласно которым клетки эпителия собирательных трубок приобретают способность реагировать на вазопрессин к 25-му дню жизни. Как известно из литературных источников, в это время происходит синхронизированное развитие многих компонентов, определяющих способность почки к концентрированию мочи (Длоуга и др., 1981). Следовательно, созревание механизмов, обеспечивающих проницаемость для воды базолатералыюй мембраны собирательных трубок, вносит свой вклад в появление реакции главных клеток на вазопрессин к концу вининга. Вместе с тем, по-видимому, здесь присутствует другой тип онтогенетической регуляции, поскольку эффект вазопрессина проявляется на фоне снижения нестимулированной водной проницаемости. Таким образом, изучение механизма регуляции водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательных трубок является одним из этапов на пути к пониманию появления гормональной компетентности почки к вазопрессину.
