Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
2. Собственные исследования 40
2.2. Результаты собственных исследований 54
2.2.1. Определение показателей качества спермы и рН среды в яйцеводах птиц 54
2.2.2. Разработка сред для криоконсервации спериы гусаков и селезней 56
2.2.3. Определение оптимальных режимов подготовки спериы к криоконсервации 68
2.2.4. Разбавление спермы криозащитной средой 71
2.2.5. Определение оптимального периода выдержки (эк ви либрации) спериы перед замораживанием 72
2.2.6. Определение оптимальных режимов замораживания и оттаивания спермы гусаков и селезней 76
2.2.7. Оптимизация температуры оттаивания спермы 83
2.2.8. Испытание эффективности разработанного способа криоконсервации спермы птиц 85
3. Совершенствование способа замораживания спермы птиц 88
3.1. Изыскание способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы 88
Обсуждение 92
Выводы 102
Предложения производству 104
Список литературы 105
- Разработка сред для криоконсервации спериы гусаков и селезней
- Определение оптимальных режимов подготовки спериы к криоконсервации
- Определение оптимального периода выдержки (эк ви либрации) спериы перед замораживанием
- Изыскание способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы
Введение к работе
Актуальность темы. В Постановлении ХХУІ съезда КПСС по проекту ЦК КПСС "Основные направления экономического и социального развития СССР на І98І-І985 годы и на период до 1990 года" намечается существенно повысить продуктивность скота и птицы. Довести среднегодовое производство мяса до 17,0-17,5 млн. тонн (в убойном весе).
Для успешного выполнения поставленных задач по производству мяса необходимо создание новых высокопродуктивных пород, линий птицы и скота. Решение этого вопроса стало реальным благодаря разработке метода длительного хранения половых клеток, позволившего использовать сперму только выдающихся производителей не зависимо от сезона года, места их содержания и продолжительности жизни.
В птицеводстве технологии криоконсервации спермы птиц все еще находятся на стадии разработки и совершенствования. Тем не менее полученные в опытах советских и зарубежных исследователей результаты по использованию замороженно-оттаянной спермы для искусственного осеменения кур,гусынь и индеек позволяют надеяться, что в ближайшее время этот метод получит широкое распространение и в практике птицеводства. Тормозом в этом вопросе является недостаточная изученность влияния низких температур на выживаемость спермиев птиц, способов криозащиты и удаления криопротекторов из деконсервированной спермы. Применение метода криоконсервации спермы в птицеводстве позволит значительно повысить эффективность селекционно-генетической работы. Что особенно важно при создании гибридов птицы, например, между мускусными и общепользовательными утками, обладающими высокой интенсивностью роста. Переход на осеменение замороженно-оттаянной спермой в гусеводстве позволит наиболее эффективно использовать ценных гусаков-производителей, проверенных по качеству потомства, повысить половую нагрузку на гусака и оплодотво-ренность яиц. Наконец,разработка метода криоконсервации сперш водоплавающих птиц позволит создать спермобанк малоиспользуемых в настоящее время пород гусей и уток, особенно аборигенных, определенные гены которых могут понадобиться селекционерам в будущем.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение влияния низких температур на выживаемость спермиев сельскохозяйственных животных, в частности, гусаков и селезней для усовершенствования и разработки практических способов криоконсер 5
вирования спермы птиц и млекопитающих, а также создания на этой основе банков глубокозамороженной спермы для генотипичес-кой селекции. Исходя из этого в задачу наших исследований входило:
1. Используя физиологические показатели полноценности спермиев разработать среду и определить лучший криопротектор для крио-консервации спермы гусаков и селезней.
2. Определить оптимальные режимы подготовки спермы птиц к замораживанию - температуру разбавления, скорость охлаждения от 40 до 0 С, продолжительность выдержки спермы перед замораживанием.
3. Определить оптимальные режимы охлаждения и отогрева спермы водоплавающих птиц от 0 до -196°С и от -196°С до 0 -4°С.
4. Изучить влияние способов удаления криопротекторов из де-консервированной спермы на её биологически полноценность.
Научная новизна. Разработана физиологически обоснованная среда и определен лучший криопротектор для криоконсервирования спермы водоплавающих птиц. Определены оптимальные режимы подготовки спермы птиц к замораживанию, режимы заморанивания и оттаивания. Изучена динамика выживаемости спермиев водопяавающих птиц в зависимости от режимов охлаждения спермы от 0 до -196°С к отогрева. Изучена эффективность способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы.
Основные положения диссертационной работы защищены авторскими свидетельствами на изобретения: № 641962, № 69П32, К& 91.2165 и опубликованы в 9 печатных работах.
Настоящая работа выполнена в лаборатории популяционной генетики и сохранения генофонда птиц Украинского научно-исследовательского института птицеводства.
Исследования по диссертационной работе проведены в соответствии с плановым заданием № 166 ГК СМ СССР по науке и технике от 12.У.1976г. "Разработать технологию хранения и использования глубокозамороженной спермы гусей" (№ Гос.per.77079182) и темы 0.С.Х.77; 02.01.04. (PH.5I.06) "Усовершенствовать технологию искусственного осеменения индеек и гусей при многолетнем использовании и замораживании спермы, повышающую на 3-5% воспроизводительные качества птицы" (№ Гос.per. 01820079883).
На защиту выносятся следующие положения диссертации:
1. Среда для криоконсервирования спермы водоплавающих птиц и использование в качестве криопротектора диметилформ&мида.
2. Режим подготовки спермы гусаков и селезней к криоконсервированию.
3. Динамика изменения выживаемости спермиев водоплавающих птиц в зависимости от режимов охлаждения и отогрева.
4. Эффективность способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы.
Разработка сред для криоконсервации спериы гусаков и селезней
Результаты анализа литературных данных по вопросам криоконсервации спермы млекопитающих и птиц показали преимущество буферных сред при замораживании над простыми солевыми растворами. В связи с этим наши исследования,проведенные в 1977-1979 гг., были направлены на поиск оптимальной буферной среды, обеспечивающей лучшую сохранность спермиев в процессе криоконсервации. Используемые для этой цели среды не должны снижать биологической полноценности спермиев до замораживания и после оттаивания, то есть быть максимально безвредными. В связи с этим вначале изучали выживаемость спермиев при температуре 2-4С в перспективных для криоконсервации средах: ВНИТИП-А-2, Олевера, фосфатно-угле-водной, и забуференном физиологическом растворе, состав которых.
Абсолютный показатель выживаемости спермы гусаков в этих средах составил соответственно (ед) 151,2; 374,3; 216,4; 166,8. Таким образом, более высокий показатель выживаемости обнаружен в среде Олевера, в состав которой входит цитратный буфер. В дальнейших исследованиях эта среда служила контролем. Её эффективность сравнивали с трис-углеводной и цитратно-фосфатно-углеводной средой (табл. I).
Приведенные данные показывают, что лучшая выживаемость спер-миев гусаков и селезней наблюдалась в цитратно-фосфатно углеводной среде. По сравнению с этой средой, трис-буфер и среда Олевера снижают (Р 0,99) выживаемость спермиев. В связи с этим цитратно-фосфатный буфер был взят за основу среды. Целью следующего опыта явилось изыскание перспективного неэлектролитного компонента (углевода) для включения в состав среды. Для этого в 0,17 Ш цитратно-фосфатный буфер вводили по 0,1 г/моль: лактозы, рамнозы, глюкозы, сахарозы, рафинозы, фруктозы. Концентрацию осмотически активных веществ доводили до изотоничной - гликоколом. Абсолютный показатель выживаемости спермиев гусаков в этих вариантах составил соответственно: 173,2; 118,1; 165,0; 177,5; 131,6; 153,8; 138,2 (ед). Анализ результатов показал преимущество (Р 0,99) включения в цитратно-фосфатный буфер в качестве неэлектролитного компонента ера-бинозы и глюкозы. Учитывая существенное влияние на выживаемость спермиев концентрации водородных ионов, было изучено влияние различных значений рН цитратно-фосфатной среды (6,1; 6,3; 6,45; 6,7; 6,9; 7,15; 7,2; 7,5; 7,6; 8,05; 8,15). Наибольший абсолютный показатель выживаемости спермиев гусаков наблюдался при рН 6,3-6,45 (202,5 ед),селезней при рН 6,9 (332,5 ед). Повышение рН до 7,15 приводит к усилению интенсивности движения спермиев в первые сутки после разбавления и быстрому её снижению в последующие. Полученные в опыте результаты определения оптимума рН среды для разбавления спермы согласуются с предыдущими исследованиями рН в яйцеводах птиц. Что еще раз подтверждает тот факт, что длительное пребывание биологически полноценных спермиев в половых путях самок обусловлено не только наличием обмена веществ между спермиями - средой окружающей спермин и криптами, но и слабокислой реакцией среды,приводящей половые клетки в состояние частичного кислотного анабиоза.
Таким образом, на первом этапе наших исследований основное внимание уделялось повышению выживаемости спермиев в исследуемых средах при температуре 2-4С. Лучшей средой по изучаемому показателю была цитратно-фосфатно-углеводная среда.
Кроме сохранения биологической полноценности спермиев при плюсовых температурах основное предназначение криозащитных сред заключается в создании оптимальных условий при замораживании - оттаивании. Исходя из этого целью следующего опыта явилось испытание эффективности ранее изученных сред для крио-консервации спермы гусаков и селезней. Дополнительно в каждую среду в качестве криопротектора было введено 15% этиленглико-ля. Сперму гусаков и селезней после разбавления замораживали разработанным нами способом (а.св. № 69ІІ32). Оттаивание замороженной до -196С спермы проводили в водяной бане при 40С.
Примечание: х Основу 1-3 среды составил фосфатный буфер, отличие их заключается в том, что среда I состоит из фосфатов натрия; 2 - фосфатов калия, 3 - калия фосфорнокислого однозамещенного и едкого натрия. Среды 4-5 - модификации цитратно-фосфатно-углеводной среды. Разница между ними состоит в том, что в состав среды 4 входит 0,15 М цитратно-фосфатного буфера, а среды 5 - 0,075 М. Среда б приготовлена на основе цитратного буфера. В состав сред 7-8 входит трис-солянокислый буфер. Причем в среду 7 включен трис-гидроксиметил-аминометан, в среду 8 - трис-оксиметил-аминометан.
Результаты опыта приведенные в таблице показывают лучшую сохранность спермиев при криоконсервации в жидком азоте - в среде 7 (условно названной - среда Б-7). В состав среды входит: трис-гидроксиметиламинометан - 0,6 г, глюкоза или фруктоза -3,250 г, гликокол - 0,3 г, поливиниллирролидон - 0,5, соляная кислота - 0,1 М до рй 6,4; этиленгликоль - 15 мл, дистиллированная вода до 100 мл.
Определение оптимальных режимов подготовки спериы к криоконсервации
Основными технологическими приемами подготовки спермы к криоконсервации является охлаждение до температуры 0-5С, разбавлен ние криозащитной средой, выдержка (эквилибрация) перед замораживанием. Имеющиеся в литературе сведения по указанным вопросам для спермы птиц противоречивы и требуют уточнения.
Изучение режимов охлаждения сперш в зоне плюсовых т емператур
Известно, что спермин млекопитающих подвержены гибели при резком охлаждении в зоне плюсовых температур. В связи с этим для охлаждения спермы, в частности быков, применяют медленные (0,5-1С мин) режимы охлаждения.
Причиной гибели спермиев при резком охлаждении является температурный шок, имеющий осмотическую природу (Ф.И.Остагако, 1968, 1978). Причем, чем больше перепад температуры между содержимым клетки и внешней средой, тем сильнее проявляется термоосмос на цитоплазматической мембране. Величина термоосмоса зависит, в основном, от разности теплопроводностей цитоплазмы спермиев и окружающей их плазмы, а также от термоизоляционных свойств цитоплазматической мембраны.
Что касается температурного шока спермиев птиц, то, как видно из обзора литературы, единого мнения по этому вопросу у криобиологов нет. Кроме того, в известных способах криоконсерви-рования спермы птиц (А.Д.Курбатов и соавт., 1976), в частности гусаков (Р.Г.Царенко и соавт., 1980), отсутствуют сведения о режимах охлаждения спермы в зоне плюсовых температур. В связи с этим нами было изучено влияние различных режимов охлаждения спермы гусаков и селезней на активность и оплодотворяющую способность спермиев. Результаты опыта, проведенного на сперме гусаков, представлены в таблице ID . Данные таблицы показывают, что охлаждение свежеполученной спермы от 40 до 0 С вызывает гибель от 18 до 35% спермиев, независимо от скорос ти падения температуры. Однако, причины гибели спермиев, по нашему мнению, могут быть различны. Так, при охлаждении со ско ростью 1С/мин (5 группа) весь процесс протекает за 40 минут, из них 20 минут сперма находится при температуре 40-20С . За этот период, вследствие высокой метаболической активности спермиев птиц, расходуется значительная часть их энергетических ресурсов и выделяются токсичные продукты распада, это, очевидно, является причиной снижения оплодотворенности яиц на 32,1% (р 0,99). Приведенный вывод согласуется с данными многих авторов, отметивших, что цельная сперма птиц быстро (в течение 20-30 мин.) снижает оплодотворяющую способность при хранении в зоне плюсовых температур. При охлаждении спермы со скоростью 2С/мин. (2 группа) длительность всего процесса составила 20 минут, оплодотворенность яиц в этой группе снизилась аналогично предыдущей на 31,2$, а вывод гусят на 38,9$ (р 0,99). Причины снижения оплодотворен-ности яиц и вывода гусят в I и 2 группах, очевидно, однозначны.
Процесс охлаждения спермы со скоростью 4 С/мин. протекает за 10 минут, втечение этого времени, очевидно, не происходит заметного разрушения спермиев за счет процессов метаболизма, аутоинтоксикации и термоосмоса. Вследствие этого оплодотворенность яиц в 3 группе снизилась всего на 4,1%, а вывод гусят повысился на 5,7%, по сравнению с контролем. Гусынь 4 группы осеменяли спермой, охлажденной со скоростью 20С/мин., оплодотворенность яиц при этом вновь снизилась на 20,6%, а вывод гусят на 23,6% (р 0,99). Наиболее вероятной причиной снижения оплодотворенности яиц и вывода гусят в этой группе явилось проявление температурного шока. Возникновение процессов термоосмоса на цитоплазматической мембране спермиев возможно, по нашему мнению, и при более медленных скоростях охлаждения (1-4С/мин), однако их интенсивность слишком мала, чтобы вызвать существенные разрушения спермиев. Следовательно, в результате проведенного опыта, можно прийти к выводу, что сперма гусаков чувствительна к термоосмотическим повреждениям, которые следует избегать путем оптимизации режимов охлаждения или, как известно из литературных источников, путем использования специальных разбавителей.
Ошибочное мнение, что сперма птиц не чувствительна к температурному шоку может привести к частичной потере оплодотворяющей способности половых клеток еще до замораживания. При чрезмерно медленных режимах охлаждения спермин также повреждаются, однако по другим причинам. Наименьшее повреждение спермиев гусаков происходит при охлаждении от 40 до 0С со скоростью 4 С/мин., что согласуется с данными многих исследователей по охлаждению спермы других видов птиц.
Приведенные выводы справедливы и для спермы селезней. Так, при охлаждении свежеполученной спермы от 40 до 0С со скоростью 2, 4, 7, 13, 51гС/мин., количество активных спермиев составило соответственно - 90, 90, 80, 80, 75%. То есть при увеличении скорости охлаждения с 4С/мин. до 7-13С/мин. гибнет 10% спермиев, а до 51С/мин.-25% (В.И.Андреев, 1979).
Определение оптимального периода выдержки (эк ви либрации) спериы перед замораживанием
Если на ранних этапах развития криобиологии целесообразность проведения длительного периода выдержки (эквилибрации) спермы перед замораживанием не вызывала сомнения, то в последнее время, многими исследователями получена хорошая результативность криоконсервации половых клеток при кратковременной выдержке. Кроме того в литературе имеются сообщения о целесообразности выдержки биологических объектов перед замораживанием в полях постоянных магнитов.
В связи с этим, нами было изучено влияние постоянных электрических и магнитных полей в период выдержки спермы на результативность криоконсервации. Опыт проводили на сперме гусаков, которую разбавляли 1:1 средой Б-26, содержащей 10% диметилформа-мида. Выдержку половых клеток проводили одновременно в 3 вариантах опыта. В отличие от контрольных образцов опытные - выдерживали перед замораживанием в магнитных и электрических полях от I до 60 минут. Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что при 1-Ю минутной выдержке спермы перед замораживанием в среде, содержащей диметилформамид,активность и выживаемость спермиев была достоверно выше (р 0,95), чем при 20-60 минутной, как в контроле, так и при воздействии магнитного и электрического полей. Причем, по результатам активности спермиев после замораживания-оттаивания 1-Ю минутная или более дли-гельная выдержка спермы в магнитном поле ни улучшения, ни ухудшения не дала. При воздействии электрического поля активность и переживаемость спермиев снижалась, даже при кратковременной обработке (I мин.). Аналогичное действие оказывало более слабое электрическое поле. Влияние на сперму магнитного поля меньшей напряженности обнаружить не удалось. Следовательно, попытка улучшить активность и выживаемость спермиев путем воздействия магнитных и электрических полей не увенчалась успехом.
Анализируя результаты опыта представленные в таблице И ЙОЖНО прийти . к выводу, что продолжительность выдержки (эквилиб-рации) спермы гусаков в среде Б-26, содержащей Ь% диметилформами-ца (в конечной концентрации) не должна превышать 10 минут.
Теоретически это объясняется тем, что диметилформамид, являясь Есриопротектором смешанного действия, имея малую молекулу (СН$) рСН0 и молекулярную массу (88), быстро проникает через лембраны спермиев. Для проявления в полной мере защитных свойств этого криопротектора достаточно хорошо перемешать сперму с крио-защитной средой. Длительная выдержка спермы перед замораживанием зама по себе снижает жизнеспособность спермиев.
Таким образом, лабораторными методами установлено отсутствие целесообразности длительной выдержки спермы птиц разбавленной средой, включающей в качестве криопротектора диметилформамид. Проверку этого вывода осуществляли по сохранению спермиями оплодотворяющей способности при криоконсервации (табл. 1Z ).
Как видно из таблицы, оплодотворенность яиц, полученных от гусынь после осеменения замороженно-оттаянной спермой зависит от длительности выдержки спермы при 0-2С. Причем при I минутной выдержке оплодотворенность яиц составила 75%, что на 8,3-12,0% выше, чем при 20-60 минутной (р 0,95). Следует отметить, что разница по оплодотворенности яиц собранных от гусынь 2-4 групп статистически недостоверна. Не обнаружена также достоверная разница между 1-5 группами. Это подтверждает выводы полученные в предыдущем опыте. Учитывая результаты опыта, для проникновения диметилформамида в сперму гусаков достаточен период в одну минуту; более длительная выдержка нецелесообразна, так как проводит к снижению оплодотворяющей способности спермяев, очевидно в результате протекания процессов катаболизма. Это справедливо и для спермы селезней. Так при определении оптимального периода выдержки (эквилибрации) спермы этого вида птиц изучали: 0-; 10; 30; 60; 120- инутный режим (при О -2С). Лучшую активность замороженно-оттаянной спермы наблюдали при выдержке в течение I - 10 минут (Андреев В.И., 1979).
Изыскание способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы
Изыскание способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы На основании многочисленных литературных источников, а также результатов собственных исследований можно с полной определенностью утверждать, что различные криопротекторы, в частности, органические растворители - этиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерин, в той или иной степени оказывают токсический эффект на спермин. Известно, что токсическое действие криопротекторов проявляется на различных этапах технологии криоконсервации спермы. I. После разбавления спермы при плюсовых температурах, очевидно вследствие чрезмерных изменений физико-химических условий среды, например, рН, осмотического давления, диэлектрической проницаемости и т.п. На этом этапе токсический эффект криопротекторов можно снизить путем введения в состав криозащитной среды, например, гликокола (П.Д/зу, 1980) или солей («&z xton. 1979), а также путем снижения температуры разбавления спермы, 2. После искусственного осеменения под действием осмотических процессов, возникающих при резком выходе криопротектора в половых путях самок.
Кроме того, не исключено проявление токсического действия криопротекторов на слизистую оболочку половых путей и организм самок в целом, так как в отличие от млекопитающих, осеменение птицы проводят в течение всего племенного сезона. Следовательно, при разработке технологии криоконсервирования спермы птиц необходимо на каждом из этапов предусматривать мамсимальное снижение токсичности криопротекторов.
В связи с этим нами были испытаны известные способы удаления криопротекторов из оттаянной спермы путем центрифугирования, диализа, а также модифицированный нами метод сорбционной фильтрации (Ф.И.Осташко, В.И.Андреев, 1982). Исследования по удалению криопротекторов из спермы селезней проведены на утках пекинской породы в конце племенного сезона. Для этого были сформированы 5 групп аналогов уток, содержащихся в секциях селекционного птичника опытного хозяйства "Борки". Содержание селезней клеточное в виварии УНИШІ. Сперму селезней консервировали в жидком азоте по разработанному нами способу (а.с. №912165). Сперму хранили и перевозили на селекционный птичник в сосуде Дьюара "Харьков--34", После оттаивания из спермы удаляли криопротектор и осеменяли уток 1-3 групп. Уток 4 группы осеменяли замороженно-оттаянной спермой без предварительного удаления криопротектора; 5 группу уток осеменяли свежеполученной спермой (табл. 19).
Представленные в таблице результаты исследований свидетельствуют о том, что лучшим способом удаления диметилформамида из оттаянной спермы является сорбционный. Наряду с наибольшей опло-дотворенностью яиц, полученные эмбрионы обладали высокой жизнеспособностью, выводимость яиц достигла 100%. При использовании диализного метода удаления диметилформамида оплодотворения яиц не наблюдалось, следовательно, этот метод не пригоден для практического применения.
Поэтому в дальнейших исследованиях по испытанию способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы гусаков диализный Подготовку спермы гусаков к замораживанию, режимы охлаждения и оттаивания осуществляли разработанным нами способом (а.с. № 9I2I65). После оттаивания, перед искусственным осеменением гусынь, проводили удаление криопротекторов описанными выше методом центрифугирования и сорбционной фильтрации. Контролем служила группа гусынь, осеменение которой проводили замороженно-оттаянной спермой без удаления криопротектора. Результаты опыта представлены в таблице 20.
Приведенные в таблице данные показывают, что по результатам оплодотворенности яиц и вывода гусят удаление диметилформамида, . не зависимо от метода, играет положительную роль. Тем не менее по сохранению оплодотворяющей способности метод сорбционной фильтрации достоверно (р 0,99) превосходит метод центрифугирования, однако по выводу гусят на 6% уступает последнему (разница статистически недостоверна (р 0,95).
Таким образом, результаты опыта по изучению способов удаления криопротектора из оттаянной спермы гусаков и селезней показывают преимущество сорбционного метода над другими. Следовательно этот метод эффективен не только в клинической практике при удалении токсинов из крови, но и в криобиологии при удалении криопротекторов из оттаянной спермы.
