Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1.1 Взаимодействие наночастиц разного состава с компонентами крови 10
1.2 Исследования физиологического эффекта апконверсионных наноразмерных флюорофоров в системах in vitro и in vivo 19
1.3 Применение апконверсионных наночастиц в медико-биологических исследованиях 25
Материалы и методы исследования 39
2.1 Материалы исследования 39
2.2 Выделение нейтрофилов 43
2.3 Инкубация клеток крови с наночастицами 43
2.4 Оценка жизнеспособности нейтрофилов 43
2.5 Тест с нитросиним тетразолием 44
2.6 Исследование активности миелопероксидазы нейтрофилов 45
2.7 Исследование активности кислой фосфатазы 46
2.8 Исследование активности щелочной фосфатазы 47
2.9 Лизосомально-катионный тест 48
2.10 Определение количества гликогена 49
2.11 Исследование способности нейтрофилов к СЗb-зависимой адгезии 49
2.12 Исследование нейтрофилов методом атомно-силовой микроскопии в режиме реального времени 50
2.13 Метод FS-спектроскопии для изучения ригидности мембрано-цитоскелетного комплекса 51
2.14 Обработка данных, полученных методом атомно-силовой микроскопии 52
2.15 Статистический анализ данных 53
Результаты и их обсуждение 54
3.1 Влияние разных видов апконверсионных наночастиц на жизнеспособность нейтрофилов 54
3.2 Оценка функционального состояния нейтрофилов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами 63
3.2.1 Исследование изменения цитохимического статуса нейтрофильных гранулоцитов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами 63
3.2.2 Измерение ригидности мембрано-цитоскелетного комплекса нейтрофилов после взаимодействия с АК-НЧ 75
3.2.3 Исследование морфологических параметров нейтрофилов методом атомно-силовой микроскопии 79
Заключение 84
Выводы 89
Список сокращений 91
Список литертуры
- Исследования физиологического эффекта апконверсионных наноразмерных флюорофоров в системах in vitro и in vivo
- Инкубация клеток крови с наночастицами
- Исследование нейтрофилов методом атомно-силовой микроскопии в режиме реального времени
- Оценка функционального состояния нейтрофилов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами
Исследования физиологического эффекта апконверсионных наноразмерных флюорофоров в системах in vitro и in vivo
В последние годы возрос интерес к использованию НЧ в различных областях, в том числе оборонной, аэрокосмической промышленности, электронике, биологии, медицине. Таким образом, воздействие на человека наночастиц и наноматериалов является неизбежным и, несомненно, приводит к росту интереса к изучению токсичности наноматериалов. НЧ в зависимости от области применения и назначения имеют различную структуру и состав, а также обладают различными физико-химическими свойствами. Но особую роль имеют такие специфические свойства НЧ, как небольшой размер, форма, большая площадь поверхности по отношению к объему. Поэтому НЧ не могут рассматриваться как прочие объекты, т.к. они могут легко проникать через различные барьеры и индуцировать различные биологические эффекты и воздействовать как на организменном, так и на клеточном и молекулярном уровнях. Последствия влияния разных видов НЧ на клеточные линии животных и человека на данный момент хорошо освещены в литературе (Hussain и соавт., 2005; Soenen и соавт., 2011).
Исследования по воздействиию наноматериалов, как правило, условно разделяют на две группы: (1) ответ на НЧ, которые специально модифицированы, чтобы стимулировать иммунную систему (Веснина и соавт., 2012) и (2) нежелательные побочные эффекты (Dobrovolskaia, McNeil, 2007). При этом большая роль отводится способам введения НЧ в организм. НЧ могут попасть в организм интернозально, перорально, перкутанно, через слизистые оболочки и т.д. Многие исследования направлены на решение проблемы токсичности, связанные с различными способами введения НЧ.
Для правильного понимания механизмов взаимодействия НЧ в системе in vivo необходимо тщательно исследовать отдельно и в совокупности такие параметры, как: (1) состав, размер, архитектура и дзета-потенциал (заряд поверхности) НЧ, (2) плотность, толщину и устойчивость поверхностного покрытия к воздействию физиологических факторов; кроме того необходимо понять, как эти параметры влияют на токсические свойства НЧ на различных клеточных и животных моделях.
Ранние исследования показали, что модификация поверхности наноматериалов влияет на особенности взаимодействия НЧ с компонентами крови (Bulte, Kraitchman, 2004; Alivisatos и соавт., 2005). Кроме того, что связывание с белками плазмы играет важную роль в распознавании и связывании чужеродных агентов, процесс комплексообразования имеет большое значение для распределения НЧ в органах in vivo (Goppert, Muller, 2005). Способность связываться с белками зависит от поверхностных характеристик частицы, её состава и способа изготовления (Gessner и соавт., 2000; Gessner и соавт., 2002; Gessner и соавт., 2003; Xu, Du, 2003; Aggarwal и соавт., 2009).
Исследования показали, что поверхность НЧ опсонизируется в основном альбуминами, аполипопротеинами, иммуноглобулинами, компонентами комплемента и фибриногеном (Luck и соавт., 1997; Thode и соавт., 1997; Salvador-Morales и соавт., 2006). Было высказано предположение, что адсорбция белков плазмы зависит, прежде всего, от степени гидрофильности поверхности НЧ или ее заряда. Например, после покрытия НЧ полигексадецилцианоакрилата полиэтиленгликолем (ПЭГ) наблюдалось менее эффективное связывание белков на поверхности (Peracchia и соавт., 1999). В то же время было показано, что адсорбция белка уменьшается с увеличением заряда поверхности НЧ (Luck и соавт., 1997), однако противоположная тенденция также была продемонстрирована A. Gessner и соавт. (2002). С помощью двумерного электрофореза было определено, что с увеличением заряда поверхности НЧ возрастает количество связываемого белка плазмы человека. Различия в результатах исследования, вероятно, связаны с трудностями в проведении независимого измерения одного из физико-химических параметров. Например, изменение поверхностного заряда, которое часто связано с добавлением различных функциональных групп на поверхности частицы, может отражаться на гидрофобных свойствах поверхности (Aggarwal и соавт., 2009).
Одним из способов оценки безопасности НЧ является изучение взаимодействия НЧ с эритроцитами и тромбоцитами. Например, B. Balakrishnan и соавт. (2005) провели исследования in vitro по воздействию на цельную кровь человека частиц поливинилхлорида. Было показано, что происходит увеличение времени свертывания крови, а также агрегация тромбоцитов и их адгезия к частицам. Однако те же частицы, покрытые ПЭГ, не повлияли ни на тромбоциты, ни на свертывание крови (Balakrishnan и соавт., 2005). При исследовании дыхательной функции крови при однократном интрагастральном введении железооксидных наночастиц было установлено возрастание кислородной емкости крови, сопровождаемое снижением числа эритроцитов, уменьшением их размеров и усилением гиперхромности. Кроме того, было показано, что происходит неравномерное распределение наночастиц по периферии эритроцитов, где заметно возрастал модуль упругости (Скоркина и соавт., 2010).
Также было выявлено, что в суспензии под действием нанодисперсного шунгитового углерода происходит изменение формы эритроцитов, которое имеет необратимый характер, тогда как изменения степени агрегации клеток были обратимыми и наблюдались только в присутствии наноуглерода (Горюнов и соавт., 2009). В работе M. Simundic и соавт. (2013) также указано на негативное воздействие наночастиц TiO2 и ZnO на эритроциты, выражавшееся в прилипании НЧ к клеткам, что впоследствии приводило к изменению их морфологии и препятствовало их агрегации. Схожие результаты были ранее получены B.M. Rothen-Rutishauser и соавт. (2006) с флуоресцентными наночастицами. Автором T. Mocan (2013) было показано, что под действием НЧ происходит лизис эритроцитов. Покрытые фолиевой кислотой и ПЭГ НЧ гадолиния не вызывали агрегацию тромбоцитов и активацию нейтрофилов по результатам Oyewumi и соавт. (2004).
Инкубация клеток крови с наночастицами
Некоторые авторы, модифицируя структуру АК-НЧ, использовали их для совмещения двух методов исследования: оптическая визуализация и магнитно-резонансной томографии (МРТ) (Hifumi и соавт., 2006; Li и соавт., 2008). Например, J. Zhou и соавт. (2010) использовали Tm3+/Er3+/Yb3+ НЧ, кодопированные NaGdF4. Эффективность применения этой технологии была продемонстрирована на опытах с мышами.
АК-НЧ были успешно применены в качестве контрастного вещества для МРТ в естественных условиях, что позволяет рассматривать АК-НЧ в качестве бифункциональной технологической платформы нового поколения датчиков. Целевая визуализация in vivo оказалась перспективной и в диагностике опухолей, и в доставке лекарств. L. Xiong и соавт. (2009) разработали протокол высококонтрастного биоимиджинга, основанный на АК-НЧ в качестве люминесцентных меток, для целевой визуализации опухолей, как in vivo, так и in vitro. Этот метод основан на применении АК-НЧ, меченных апоптоз-индуцирующими RGD-содержащими пептидами, в качестве люминесцентных меток. В режиме 3D-сканирования конфокального микроскопа были получены оптические срезы тканей, на которых видно, что для образцов с применением АК-НЧ не характерна аутофлуоресценция даже при высокой глубине проникновения ( 600 мкм). Более того, для изображений, полученных с помощью АК-НЧ, характерно высокое соотношение сигнал-шум ( 24) между опухолью и окружающими тканями. Эти результаты продемонстрировали, что метод визуализации с помощью АК-НЧ особенно эффективен для маркировки компонентов сложных биологических систем.
АК-НЧ вызывают интерес в области фотодинамической терапии (ФДТ). Некоторые наноматериалы, такие как НЧ золота (Asadishad, Vossoughi, Alemzadeh, 2010; Brown и соавт., 2010), КТ (Hsieh и соавт., 2006; Ratanatawanate, Chyao, Balkus, 2011), наночастицы TiO2 (Smith и соавт., 2012) и полимеры (Shen и соавт., 2011) уже используются в ФДТ. Тем не менее, большинство из них излучают за счет обычного механизма люминесценции с понижением длины волны излучаемого света (стоксов сдвиг). За счет этого они нуждаются в высокой энергии накачки для активации фотосенсибилизаторов. Кроме того, свет, необходимый для активации фотосенсибилизатора способен проникнуть только на глубину около сантиметра и может приводить к гибели нецелевых (не трансформированных) клеток.
Все эти факторы являются причиной, ограничивающей дальнейшее применение таких НЧ в биомедицинской области. Поэтому важно найти лучший способ проведения ФДТ, характеризующися более глубоким проникновением возбуждающего сигнала и меньшим количеством побочных эффектов. АК-НЧ как раз удовлетворяют этим требованиям. Их, как правило, предварительно покрывают оболочкой, которая выполняет следующие функции: (1) является матрицей для включения фотосенсибилизаторов, (2) служит для прикрепления адресных молекул, и (3) способствует стабилизации НЧ.
Обычно для применения в ФДТ используются АК-НЧ на основе фторидных матриц, поскольку для таких АК-НЧ характерна наиболее высокая эффективность протекания апконверсионного процесса (Chatterjee, Zhong, 2008; Guo и соавт., 2010). Zhang и соавт. (2007) впервые продемонстрировали модификацию метода ФДТ, основанную на применении АК-НЧ, и рассмотрели возможность его применения для лечения рака мочевого пузыря. АК-НЧ покрывали оболочкой из мезопористого кремния, легированной фотосенсибилизатором. Антитела, специфичные к опухолевым клеткам, ковалентно привязывали к поверхности оболочки из диоксида кремния.
В связи с тем, что спектр поглощения сенсебилизатора и спектр излучения апконверсионного люминофора перекрываются, легированные фотосенсебилизатором АК-НЧ могли гененрировать кислород при облучении в БИК диапазоне и повреждали клетку-мишень. Фотосенсибилизатор в оболочке из кремния был защищен от разрушения под действием биологической среды, но образующийся синглетный кислород легко высвобождался. В работе H.S. Qian и соавт. (2009) было показано влияние таких НЧ на клетки рака мочевого пузыря мышей при возбуждении на длине волны 980 нм. Различия в жизнеспособности клеток, подвергшихся воздействию АК-НЧ, легированных фотосенсибилизатором, и без него, наблюдается уже после 5 мин засвечивания ИК-лазером, что подтверждает выделение синглетного кислорода. В работе группы Wang и соавт. (2011) были разработаны НЧ для ФДТ, в которых молекула хлора 6 (CE6), выступающая в качестве фотосенсебилизатора была адсорбированна на пэгилированные АК-НЧ, образуя АК-НЧ-СЕ6 нанокомплексы. Было обнаружено, что 70% опухолей у экспериментальных животных было полностью устранено после введения таких нанокомплексов для ФДТ и последующего их облучения в БИК-диапазоне. Ни одна из опухолей не проявляла повторного роста в течение 2 месяцев, что также говорит о высокой эффективности такого метода.
На данный момент ограничением для широкого применения АК-НЧ служит недостаточная оснащенность и доступность приборной базы, поскольку стандартные флуориметры и планшетные фотометры должны быть адаптированы к БИК возбуждению (Salthouse и соавт., 2008; Yu и соавт., 2009). Однако апконверсионные материалы имеют огромный потенциал для улучшения производительности современных оптических анализаторов и сенсоров. Их фотостабильность обеспечивает продолжительное свечение без обесцвечивания, а легкодоступные недорогие источники возбуждения позволят снизить экономические затраты. Как известно, АК-НЧ при возбуждении на одной длине волны (980 нм) могут излучать хорошо разделимые узкие пики флюоресценции, что позволяет расширить возможности визуализации с применением АК-НЧ (Prodi и соавт., 2011).
Исследование нейтрофилов методом атомно-силовой микроскопии в режиме реального времени
Из рисунка 9 видно, что НЧ локализовались в основном в области ядра в виде крупных агрегатов, тогда как, например, для КТ характерно более равномерное распределение по периметру клетки (Xing и соавт., 2006; Беляева и соавт., 2009). Кроме того, выявленный токсический эффект вероятно усугубляется наличием в составе F3:Er/Yb НЧ соединений фтора. Существуют данные, свидетельствующие о том, что фториды металлов, которые можно обнаружить в составе F3:Er/Yb НЧ, обладают угнетающим действием на ряд ферментативных реакций, что также может вызывать нарушения в процессе нормального функционирования клеток (Шалина, Васильева, 2009). Этот аспект будет рассмотрен подробнее в следующем подразделе.
Для нейтрофилов, проинкубированных с АК-НЧ вида -Са3(РО4)2:Er3+,Yb3+, не было выявлено таких явных изменений в морфологии. Для них не обнаружен эффект «вскипания» цитоплазмы, напротив, клетки сохраняли однородную целостную структуру. Тем не менее, АК-НЧ поглощаются нейтрофилами, о чем свидетельствует образование псевдоподий и наличие внутриклеточных включений наночастиц и их агрегатов (Рисунок 11). Рис. 11. Нейтрофилы после инкубации (30 мин, 37 С) с АК-НЧ вида -Са3(РО4)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,17) (10-4 М). Изображение получено с помощью оптического микроскопа Olympus IX71, увеличение х60
Однако процесс гибели клеток, проинкубированных с АК-НЧ с таким составом, был отмечен в случае внесения АК-НЧ в высоких концентрациях. Прежде всего, некроз был характерен для тех клеток, у которых определялось большое количество включений в цитоплазме, т.е. тех, что предположительно поглотили наибольшее количество НЧ (Рисунок 12). Для них было характерно более интенсивное локальное свечение PI в области ядра. В целом нужно отметить, что если при добавлении суспензии наноматериалов они не визуализировались ни в обычном свете, ни после возбуждения ИК-лазером, то их совместная инкубация с нейтрофильными гранулоцитами сопровождалась выраженной агрегацией наночастиц. Образованные крупные агрегаты четко визуализировались внутри фагоцитов.
Таким образом, с использованием метода оптической флуоресцентной микроскопии мы наблюдали, что АК-НЧ вида F3:Er/Yb после 30 мин инкубации вызывают интенсивные морфологические перестройки клеток и клеточную гибель. Такой эффект был менее выражен для АК-НЧ вида -Са3(РО4)2:Er3+,Yb3+.
Мы показали, что инкубация нейтрофильных гранулоцитов с АК-НЧ разного состава приводит к гибели клеток. Основным механизмом клеточной гибели является некроз, который начинается с блеббинга. Этот вариант клеточной гибели наблюдается при любом химическом составе наночастиц. Учитывая высокий цитотоксический потенциал нейтрофила, высвобождающийся при некротической гибели клеток можно сделать вывод о том, что при взаимодействии нейтрофилов с АК-НЧ происходит срыв гомеостатических реакций клеток и такого рода взаимодействие не безопасно для окружающих тканей. Данные по исследованию медиальных летальных доз дают отчетливое представление о том, что границы резистентности клеток к воздействию АК-НЧ полностью обусловлены составом матрицы НЧ, поскольку фторсодержащая матрица обуславливает гибель клеток даже при очень низкой концентрации НЧ, тогда как замена матрицы на биогенный витлокит способствует выживанию клеток даже при достаточно высоких концентрациях наноматериала. Вместе с тем, изменение соотношения и концентрации ионов лантаноидов Er и Yb в составе АК-НЧ практически не изменяют жизнеспособности клеток. 3.2 Оценка функционального состояния нейтрофилов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами
Разными авторами было показано, что токсичность НЧ зависит не только от хмической природы, размеров, структуры, но и по-разному проявляется в зависимости от биологической модели, на которой проводится исследование. Клетки-мишени и механизмы развития токсического эффекта очень разнообразны. Одни наноматериалы благодаря своей химической природе способны индуцировать образование активных форм кислорода (Long и соавт., 2007, Kang исоавт., 2008, Reevesa и соавт., 2008). Другие способны проникать через тканевые барьеры, внутрь клеток, и взаимодействовать с внутриклеточными компонентами (Глушкова и соавт., 2007, Kaura и соавт., 2008). Третьи могут повышать проницаемость мембран (Hong и соавт., 2004). Поэтому для изучения механизмов и последствий взаимодействия каждой отдельно взятой системы «клетки-наночастицы» необходим свой особый подход. В литературных источниках достаточно мало информации о механизмах и последствиях взаимодействия НЧ с нейтрофилами, поэтому не существует особой общепринятой схемы для изучения их взаимодействия. Исходя из этого, в нашей работе использовались, кроме микроскопических, стандартные методы определения функционального статуса нейтрофилов. Для исследования влияния АК-НЧ на морфофункциональный и биохимический статус нейтрофилов в работе использовались АК-НЧ вида F3:Er/Yb. Этот вид НЧ является наиболее распространенным и широкоиспользуемым в медико-биологических исследованиях. АК-НЧ именно этого вида проявили себя как наиболее токсичные и, по результатам оптической микроскопии, вызывали наиболее выраженные изменения морфологии клеток даже в небольших концентрациях. Именно поэтому они были выбраны для более подробного изучения механизмов воздействия АК-НЧ на нейтрофил. Нейтрофилы инактивируют чужеродные объекты с помощью двух основных механизмов: (I) респираторный взрыв, который является кислород-зависимым процессом, приводящим к генерации активных форм кислорода (АФК) и других химически активных кислородсодержащих соединений и (II) кислороднезависимый механизм, посредством которого нейтрофилы высвобождают высокоактивные продукты, находящиеся в гранулах (в основном -а- и Р-дефензины, кателицидины, проферины и др.).
Неспособность продуцировать АФК делает нейтрофил функционально неполноценным и неспособным реализовывать свой бактерицидный потенциал. Одним из основных методов оценки функционального состояния нейтрофила и его кислородзависимой защитной системы является тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Он характеризует окислительно-восстановительный потенциал нейтрофилов, которой является одним из важнейших показателей их фагоцитарной активности и косвенно указывает на уровень выработки супероксиданиона, являющегося одним из наиболее агрессивных кислородных радикалов (Виксман М.Е., Маянский А.Н., 1979; Покровский, Нагоев, 1983). НСТ-тест основан на поглощении нейтрофилами раствора нитросинего тетразолия (НСТ) и накоплении его в фагоцитарных вакуолях с последующим восстановлением и превращением растворимого бесцветного НСТ в нерастворимый темно-синий диформазан, который легко идентифицировать в нейтрофилах визуально при микроскопическом исследовании (Щербаков В.И., 1989, Маянский А.Н., 1989).
Оценка функционального состояния нейтрофилов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами
Нейтрофилы являются первой линией защиты организма. При воспалении они элиминируют ксенобиотики, реализуют комплекс бактерицидной активности, продуцируют хематоксины и медиаторы, регулирующие и координирующие другие клетки. Поэтому функциональная активность и жизнеспособность нейтрофилов периферической крови играет важную роль в поддержании гомеостаза организма и его защиты от чужеродных агентов. Основываясь на этом можно говорить о том, что изучение нейтрофила в процессе взаимодействия с новыми видами ксенобиотиков является важной составляющей актуальных на сегодняшний день токсикологических исследований, методологии оценки риска использования наночастиц для решения медицинских и биологических задач.
В процессе системного анализа отечественных и зарубежных источников было выявлено, что на данный момент недостаточно сведений о взаимодействии наноматериалов с клеточной и гуморальной составляющей системы неспецифической резистентности организма. При этом, если рассматривать апконверсионные наночастицы в качестве перспективного материала для новых методов диагностики и визуализации, то об их влиянии на клеточном уровне почти ничего не известно. Таким образом, при обилии информации о методах синтеза, визуализации, а также последствиях воздействия апконверсионных наночастиц на организм лабораторных животных, отсутствуют данные о взаимодействии с клеточным и гуморальным звеном неспецифической резистентности. Вместе с тем, необходимость таких исследований очевидна с учетом особенностей химического строения новых классов флюорофоров.
Уже на начальном этапе исследований, когда были определены медиальные летальные дозы, обнаружено, что, несмотря на привлекательные с точки зрения применения в живых системах оптические свойства, апконверсионные наночастицы на основе фторидной матрицы, которые чаще всего применяются исследователями, сильно алтерируют клетки даже по сравнению с некоторыми видами квантовых точек. Это следует учитывать при дальнейшей разработке систем диагностики и визуализации in vivo, поскольку основываясь на этом можно сделать вывод о необходимости создания химически стабильных и устойчивых оболочек. Либо, как в нашем случае, рассмотреть возможность применения матриц на основе биогенных материалов, поскольку они оказывают меньшее влияние на морфологию и выживаемость нейтрофилов.
На следующем этапе был проведен анализ механизмов физиологических и биохимических перестроек нейтрофила под действием апконверсионных частиц на основе фторидной матрицы. На рисунке 22 схематически изображены последствия влияния АК-НЧ на клетку.
Под действием апконверсионных наночастиц происходило снижение показателей спонтанного и стимулированного НСТ-теста, характеризующего кислородзависимую систему нейтрофила. Исследование кислородзависимой защитной системы нейтрофилов помогло охарактеризовать их окислительно-восстановительный потенциал, которой является одним из важнейших показателей их фагоцитарной активности и указывает на уровень выработки АФК. Кроме того, этот показатель косвенно указывает на состояние мембран и мембранных комплексов клетки, поскольку реализация процесса кислородного взрыва невозможна без участия НАДФH-оксидазной системы, локализующейся на мембранах. Изменения физических свойств и структуры мембрано-цитоскелетного комплекса были подтверждены с применением атомно-силовой микроскопии. Снижение показателей НСТ-теста является одним из основных доказательств негативного воздействия апконверсионных наночастиц на основе фторидной матрицы на функциональный статус нейтрофила.
Эти результаты сопоставимы с данными о влиянии НЧ на нейтрофилы, полученными другими авторами с НЧ h-фуллерена (Jovanovic и соавт., 2011), ПЛК или ПЛК/ПЭГ (Mainardes и соавт., 2009), холестерин-бутиратными НЧ (Dianzani и соавт., 2006) и НЧ алмаза (Karpukhin и соавт., 2011). Однако не все НЧ ингибируют респираторную активность нейтрофилов. Рис. 22. Схематическое изображение последствий взаимодействия нейтрофила с апконверсионными наночастицами на основе фторидной матрицы (F3:Ei7Yb). НЧ - наночастицы, КБ - катионные белки, КФ - кислая фосфатаза, ЩФ - щелочная фосфатаза, АГ - азурофильные гранулы, СГ - специфические гранулы, Г - гликоген. В частности прямо противоположный эффект наблюдается для наночастиц оксидов металлов, что по всей видимости связано с их химической природой (Hedenborg, 1988; Kumazawa и соавт., 2002; Babin и соавт., 2013). На фоне подавления выработки АФК нейтрофилом под действием апконверсионных наночастиц наблюдалась активация миелопероксидазной системы. Это достаточно характерно для клеток под воздействием НЧ и свидетельствует о том, что за счет увеличения активности фермента компенсация «утраченной» гомеостатической функции. (Kagan и соавт., 2010, Gregg и соавт., 2013)
Другим важным показателем функционального состояния нейтрофилов, который был изучен, является активность лизосомально-катионных белков и ферментов, поскольку за счет них осуществляется воздействие на чужеродные агенты после образования фаголизосомы. После инкубации с АК-НЧ лишь небольшой процент клеток сохраняло активность лизосомально-катионных белков. Кроме того было отмечено подавление активности кислой и щелочной фосфатаз, что свидетельствует о подавлении метаболической активности клетки. Эти результаты подтверждаются наличием больших запасов гликогена в клетках, что вероятно говорит о том, что они не задействуются в процессе инкубации клеток с наноматериалами. В комплексе, полученные данные свидетельствуют о нарушении работы ферментативной системы клетки и разобщении мембранных процессов.
Наиболее резистентным к воздействию апконверсионных наночастиц оказался рецепторный аппарат нейтрофила, а именно рецепторы CD18/CD11b. Это вероятно объясняется тем, что апконверсионный наночастицы не вызывали изменений в структуре молекул рецепторного аппарата.
В работе впервые была изучена и такая важная характеристика клетки, как ригидность мембрано-цитоскелетного комплекса. Она статистически значимо снижалась после взаимодействия с апконверсионными наночастицами. При этом было показано, что неспецифическая опсонизация белками сыворотки снижает негативный эффект от воздействия наноматериалов. Прохождение нейтрофила по капиллярам, а также переход клеток в ткани через эндотелий и дальнейшее передвижение под действием хемоаттрактантов напрямую зависит от механических свойств мембраны и цитоскелета. Поэтому изменения их состяния также можно отнести к негативному воздействию на функциональные характеристики нейтрофила. Кондиционирующие особенности предварительной инкубации НЧ в сыворотке были показаны и при изучении морфологии нейтрофилов методом атомно-силовой микроскопии. Эти данные играют важную роль в понимании реакции нейтрофилов на присутствие наноматериалов и при выборе состава НЧ или их покрытия. При этом в процессе конструирования НЧ важно понимать, для решения каких задач они предназначены, поскольку в случае, когда поверхность НЧ легко подвергается опсонизации, они оказывают меньший токсический эффект, при этом повышается вероятность того, что они будут захвачены фагоцитами и не выполнят свою диагностическую или терапевтическую функцию.
Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что под действием АК-НЧ происходит подавление функций нейтрофила, выражающееся в ингибировании литического потенциала, снижении активности кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма, снижении фагоцитарной и метаболической активности и деструкции мембрано-цитоскелетного комплекса. Всё это приводит к тому, что нейтрофил не может выполнять свои защитные функции. Если рассматривать нейтрофил как важнейшее звено неспецифической резистентности организма, то можно сказать, что происходит подавление одного из ключевых факторов поддержания гомеостаза организма.Также показано, что основным механизмом клеточной гибели является некроз, который начинается с блеббинга. Учитывая высокий цитотоксический потенциал нейтрофила, высвобождающийся при некротической гибели клеток, можно сделать вывод о том, что при взаимодействии нейтрофилов с АК-НЧ происходит срыв гомеостатических реакций клеток и такого рода взаимодействие не безопасно для окружающих тканей.
