Содержание к диссертации
I. ВВЕДЕНИЕ 6
И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
Трансплантация ткани в ЦНС и переднюю камеру
глаза 13
Гистогематические барьеры 15
Иммунологические аспекты трансплантации ткани в мозг и
переднюю камеру глаза 20
История вопроса о трансплантации ткани в ЦНС и переднюю
камеру глаза 23
Нейротоксическое повреждение норадренергическои системы
мозга 28
Эндогенные воздействия на различные системы организма. Тимус,
старение, стресс 31
Сахарный диабет, осложнения, аспекты консервативной
терапии 39
Аллоксановый диабет 43
Органная трансплантация поджелудочной железы при сахарном
диабете 46
Клеточная трансплантация инсулинпродуцирующей ткани при
сахарном диабете 48
Роль способа и места алло- и ксенотрансплантации для выживания
пересаженных островковых клеток 58
Семенник как место для трансплантации островковых
клеток 63
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные 68
Получение крыс с норадренергической недостаточностью 68
Трансплантация участков синего пятна 69
Определение норадреналина в структурах мозга
экспериментальных животных 70
Изучение ориентировочно-исследовательской двигательной
активности 70
Регистрация конфликтов в группах животных 71
Трансплантация тимуса и костного мозга в переднюю камеру глаза
животных 71
Определение количества тимоцитов у животных 72
Облучение животных 73
Определение фрагментированной ДНК 73
Получение экспериментального диабета 74
Получение абортивного материала 74
Тестирование уровня глюкозы в биологических жидкостях
экспериментальных животных 74
Определение инсулина в поджелудочной железе, трансплантате и
сыворотке крови 75
Определение потребления воды 76
Алло- и ксенорансплантация поджелудочной железы в переднюю
камеру глаза крыс 76
Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в
переднюю камеру глаза кроликов 78
Аллотрансплантация эмбриональной поджелудочной железы в
боковые желудочки мозга крыс 79
Гистологические исследования ткани 80
Иммуногистохимические исследования 80
Подготовка микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной
железы крыс для трансплантации 82
Микрохирургический метод аллотрансплантации
микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в
паравазальную клетчаточную щель семенника 83
Одностороннее пересечение семявыносящего протока интактного семенника после аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы в контрлатеральный
семенник 88
Тест на фертильность 89
Статистика 89
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 90
Глава 1.
Компенсация норадренергической недостаточности и
поведенческих реакций после воздействия 6-ОДА и последующей
трансплантации ткани синего пятна 90
Глава 2.
Регистрация социального стресса во вновь образованных
иерархических группах животных 94
Глава 3.
Алло- и ксенотрансплантация тимуса 98
Глава 4.
Трансплантация иммунокомпетентных тканей (тимус, костный
мозг) после радиационного облучения 106
Глава 5.
Алло- и ксенотрансплантация поджелудочной железы в переднюю
камеру глаза и боковые желудочки мозга с целью компенсации
физиологических и биохимических отклонений при
экспериментальном диабете 111
Глава 6.
Аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонатальной
поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель
семенника с целью компенсации при экспериментальном
диабете 132
У.ЗАКЛЮЧЕНИЕ 165
VL ВЫВОДЫ 174
VIL СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 178
VUL ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 179-248
Введение к работе
Известно, что некоторые области организма млекопитающих
обладают свойствами относительной иммунопривилегированности.
Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без
применения иммуносупрессивнои терапии или минимизировать ее. К
иммунопривилегированным зонам, в первую очередь, относят
некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза и
семенник. Связано это с особым строением гисто-гематических
барьеров этих областей, в норме не пропускающих
иммунокомпетентные клетки. Те же активированные иммунные
клетки, которые все же проникают в иммунопривилегированные
области, элиминируются под действием Fas-ligand,
экспрессированного в этих участках. Функционирующие в яичках клетки Сертоли вырабатывают Fas-L, который, соединяясь со своим рецептором на активированных лимфоцитах, индуцирует их апоптоз (Сепиашвили, 2003; Nagata, 1995; Chen, 1999). Функционально активный Fas-L обнаружен также в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L - система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).
К настоящему времени в область ЦНС трансплантированы почти все участки эмбрионального и фетального мозга от соматосенсорной коры, гиппокампа и мозжечка (Александрова, 1999; Bragin et al., 1988; Shetty et al., 1997; Sommer et al., 1997) до участков спинного мозга (Nornes et al., 1984) и других видов нейронов, способных к выживанию и росту в области ЦНС.
Если в мозг пересаживали, в основном, ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза (ПКГ) трансплантировали ткани самой различной природы, от неирональных и опухолевых до эндокринных (Schochet, 1920; Goodmann, 1943; Krametz , Greene, 1953; Falck, 1959; Green, 1967; Hoffer, Seiger, 1974; Weber et al., 1975; Брагин, Виноградова, 1983; Миронов, 1988; Adeghate,1998; Adeghate, Donath, 2000).
В семенник пересаживали тиреоидную ткань, Лейдиговские клетки, клетки гипофиза, ядер переднего гипоталамуса и др. (Scothorne 1977; Setchell et al., 1995; Кирпатовский и др., 1994, 1999; Каитова, 2003).
Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в ЦНС, переднюю камеру глаза и тестикул успешных работ по компенсации неирональных или эндокринных дефектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al.,1979; Bjorklund, Stenevi, 1979).
В восьмидесятые годы прошлого века широкое применение получила экспериментальная алло- и ксенотрансплантация инсулинпродуцирующих клеток и тканей в печень, в пульпу селезенки, внутрибрюшинно, под капсулу почки (Скалецкий 1987; Скалецкий, Шальнев 1988; Tze, Tai, 1983; Brown et al., 1984; Bretzel, 1984; David et al., 1988; Powell, 1987; Kaufman et al., 1990; Hiller et al., 1991). По результатам исследований в этом направлении разработан ряд новых подходов для клинической трансплантации.
Разработанная в НИИТиИО МЗ РФ в эксперименте и внедренная в клиническую практику трансплантация культур островковых клеток аллогенного и ксеногенного происхождения приводит к тому, что в процессе культивирования происходит снижение иммуногенности трансплантата. Этот способ позволяет применять в качестве места для пересадки не только печень и селезенку, но и мышцы передней брюшной стенки, что делает операцию значительно менее травматичной для пациента. Трансплантация проходит без иммуносупрессии. Положительное влияние пересадки проявляется в виде снижения потребности экзогенного инсулина, стабилизации лабильного течения диабета и торможения прогрессирования поздних осложнений диабета (Шумаков и др. 1981; 1998;Скалецкий, Онищненко, 2001; Скалецкий и др. 2002; Shumakov et al, 1989).
Несомненный интерес представляет возможность
пролонгировать выживание трансплантата путем помещения его в те области, в которых в силу анатомического строения и выработки иммуномодулирующих агентов они могут функционировать длительное время. В настоящее время накоплен значительный клинический опыт в области нейротрансплантации при болезни Паркинсона, начаты операции при других неиродегенеративных заболеваниях ЦНС - хорее Гентингтона, при эпилепсии, травме спинного мозга (Макаренко и др., 1998; Lindval et al., 1994; Ugrumov et al., 1996; Olanow et al., 1997). Несмотря на значительное количество экспериментальных и клинических работ по трансплантации тканей в относительно иммунопривилегированные зоны организма, в этой области осталось еще большое количество нерешенных проблем. В ходе выполнения работы были поставлены задачи, которые до сих пор не были решены методами пересадки адекватных тканей. В результате
проведенных исследований нами предложены оригинальные модели компенсации экспериментального диабета, норадренергической недостаточности, возрастной и стрессорной дегенерации тимуса.
Несомненно, с помощью экспериментальных физиологических работ в этом направлении можно заложить основу для разработки новых медицинских методов долговременной компенсации ряда нейродегенеративных и эндокринных патологий
Цель работы
Используя свойства относительной иммунологической привилегированности мозга, передней камеры глаза и семенника разработать трансплантологические способы компенсации патологических состояний у животных. Оптимизация использования этих способов в экспериментальной биологии.
Задачи исследования
1. Разработка трансплантологических способов компенсации
норадренергической недостаточности, возрастной и стрессорной
дегенерации тимуса, диабета. Разработка методов оценки их
эффективности.
2. Исследование физиологических, биохимических и
иммунологических особенностей протекания экспериментальных
патологий в период их инициации, течения и долговременной
компенсации с помощью трансплантации тканей в мозг, переднюю
камеру глаза, семенник.
Научная новизна работы
Показана впервые возможность долговременной компенсации норадренергической недостаточности и поведенческих реакций после воздействия нейротоксина (6-ОДА) и последующей трансплантации ткани синего пятна.
Разработаны новые способы алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей в переднюю камеру глаза крыс. Показана возможность приостановки возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных.
Разработан новый автоматизированный метод регистрации социальных конфликтов в больших выборках мышей в период установления нового иерархического порядка.
Разработаны новые способы долговременной компенсации экспериментального аллоксанового диабета с помощью трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в относительно иммунопривилегированные участки организма - мозг, передняя камера глаза, семенник. Показано, что при этом происходит полная или частичная нормализация основных физиологических и биохимических показателей. При трансплантации поджелудочной железы в семенник сохраняется фертильность животных. Перечисленные результаты исследований носят приоритетный характер.
Положения, выносимые на защиту
1. С помощью нейротрансплантации можно добиться заметной
нормализации экспериментальной норадренергической
недостаточности и связанного с ней нарушения поведенческих реакций у животных.
Возможна приостановка возрастной инволюции тимуса и ускорение восстановления клеточности вилочковой железы после радиационного облучения животных с помощью алло- и ксенотрансплантации иммунокомпетентных тканей.
Относительная иммунологическая привилегированность мозга и передней камеры глаза позволяет с помощью трансплантации эмбриональной поджелудочной железы частично или полностью компенсировать экспериментальный диабет у животных на сроки соизмеримые с естественной продолжительностью их жизни.
Трансплантация неонатальнои поджелудочной железы в семенник при экспериментальном диабете восстанавливает основные метаболические показатели. Сама трансплантация поджелудочной железы в паравазальную клетчаточную щель семенника не влияет на фертильность животных.
Научно-теоретическое и практическое значение работы
Проведенные исследования направлены на решение нескольких
важных проблем. В первую очередь, это возможность восстановления
физиологических, биохимических, а в некоторых случаях,
иммунологических сдвигов при различных патофизиологических
состояниях. Разработанные трансплантологические способы
позволяют проследить особенности метаболических изменений в
различных системах организма в период возникновения, течения и
компенсации таких патофизиологических состояний, как диабет,
старение, последствия радиационного облучения,
нейродегенеративные изменения. В процессе выполнения работы использованы различные схемы алло- и ксенотрансплантации ткани в
различные области организма, что позволяет сравнить их преимущества и недостатки.
Разработанные модели могут быть использованы как сравнительные при проверке влияния новых лекарственных препаратов в период проведения их доклинических испытаний.
Полученные данные расширяют возможности оценки метаболических сдвигов, наблюдающихся в организме больных, получивших радиационное облучение либо подвергшихся серьезному стрессу, страдающих диабетом, а также у пожилых людей.
Отсутствие значительного воздействия трансплантации неонатальной поджелудочной железы в семенник на фертильность позволяет предположить возможность разработки метода для применения в клинической практике.
