Изучение адаптивных реакций клеток эпителия кишечника при культивировании в условиях микробиореактора Трушкин, Евгений Владиславович

Введение к работе

Актуальность исследования

Основная функция эпителия тонкого кишечника заключается в формировании гисто-гематического барьера, отделяющего соединительную ткань кишечника от потенциально вредных соединений, присутствующих в просвете кишки, а также препятствующего попаданию этих веществ в кровоток [Уголев, 1991]. Плотные контакты, образующиеся в апикальной области эпителия между соседними клетками, формируют структурный и функциональный барьер, который препятствует парацеллюлярному транспорту веществ. Нарушение плотных контактов наблюдается при ряде воспалительных заболеваний заболеваний кишечника.

Помимо барьерной функции, эпителиальные клетки кишечника выполняют транспортную. В тонком кишечнике осуществляется всасывание большинства жизненно-важных для организма веществ и перорально принимаемых лекарственных средств. Транспорт осуществляется пассивно, активно и путем пиноцитоза.

Клетки эпителия кишечника используются в качестве объекта исследований, направленных на изучение процессов всасывания биологически активных молекул и ксенобиотиков в тонком кишечнике человека, а также влияния различных физиологических факторов на барьерную функцию кишечного эпителия [Mathieu, 2005; Sambuy, 2005].

При этом наиболее распространенным подходом является культивирование клеток кишечника в виде монокультуры. Недостатком такого подхода является значительное упрощение модели по сравнению с нормальной стенкой кишечника, так как практически не удается воссоздать физиологичный ток питательной среды под базальной мембраной, что в значительной мере влияет на процессы активного или пассивного транспорта тех или иных веществ через эпителий тонкого кишечника. Распространенным подходом к решению данной проблемы является использование микробиореакторов (МБР), позволяющих моделировать и поддерживать ток питательной среды.

В настоящее время существует два основных типа МБР: статические и динамические [Biffi, 2012; Young, 2010]. В МБР статического типа отсутствует циркуляция среды, а питание клеток осуществляется по механизму диффузии через мембрану, на которой культивируются клетки [Zhang, 2009]. В МБР динамического типа микронасосы обеспечивают циркуляцию питательной среды в проточном и (или) замкнутом режимах [Vozzi, 2009]. Недостатком существующих МБР динамического типа является высокая скорость потока культуральной среды по микроканалам, соединяющим ячейки, в которых культивируются клетки, что приводит к постоянному гидродинамическому стрессированию клеток, в результате чего их жизнеспособность необратимо снижается [Imura, 2010].

Остаётся не выясненным вопрос, как культивирование в микробиореакторах влияет на функциональную активность клеток эпителия кишечника: остается ли она а пределах нормы, имеет ли место стрессирование клеток, в какой мере клетки, культивируемые в таких условиях могут быть использованы как модель нормального эпителия кишечника.

В этой связи целью исследования было изучение молекулярно-генетических особенностей функционального статуса клеток эпителия кишечника человека при их культивировании в условиях микробиореактора. Для решения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка микробиореактора динамического типа для культивирования клеточной модели ткани эпителия кишечника;

2. Изучение процесса диффузии маркерных молекул при микроциркуляции среды в условиях микробиореактора;

3. Получение стабильного монослоя дифференцированных клеток линии Сасо-2;

4. Экспериментальное обоснование выбора референсных генов для оценки изменения экспрессии генов в процессе дифференцировки клеток линии Сасо-2;

5. Исследование экспрессии генов белков-транспортеров в дифференцированных клетках линии Сасо-2;

6. Сравнение уровня экспрессии генов белков теплового шока при культивировании клеток Сасо-2 в условиях микробиореактора и в планшете;

7. Характеристика апикально-базальной поляризации клеток линии Сасо-2 при культивировании в условиях микробиореактора.

Научная новизна. Научная новизна исследования заключается в том, что разработан прибор, позволяющий проводить культивирование клеточного эквивалента эпителия тонкого кишечника в условиях непрерывной циркуляции питательной среды.

Впервые показано, что при дифференцировке клеток Сасо-2 гены SF3A1, SDHA и TBP, относящиеся к группе референсных генов, характеризуются наиболее стабильным уровнем экспрессии.

Культивирование клеток линии Сасо-2 в условиях микробиореактора не приводит к изменению экспрессии белков семейства теплового шока. Клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакторе динамического типа, имеют апикально- базальную поляризацию характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

Практическая значимость исследования. Создан и апробирован (Патентная заявка от 21 ноября 2012 г. № 2012149565) микробиореактор, позволяющий культивировать клеточные эквиваленты тканей млекопитающих. Выбраны референсные гены, которые позволяют более точно оценивать экспрессию целевых генов при дифференцировке клеток Сасо-2. Показана возможность культивирования клеток линии Сасо-2 в условиях микробиореактора и потенциальная применимость клеток Сасо-2, культивируемых в микробиореакторе, в качестве эффективной модели для исследования in vitro процессов активного и пассивного транспорта биологически активных веществ и ксенобиотиков через стенку тонкого кишечника.

Основные положения, выносимые на защиту:

7. 1. Микробиореактор позволяет поддерживать непрерывный ток среды под базальной поверхностью клеток, обеспечивая наличие градиента концентраций веществ между апикальной и базолатеральной сторонами эпителия кишечника;

   2. Гены SF3A1, SDHA и TBP характеризуются более стабильным уровнем экспрессии при дифференцировке клеток Сасо-2, чем обычно упоминаемые в литературе;

   3. Культивирование клеточной линии Сасо-2 в микробиореакторе не приводит к стрессированию клеток;

   4. Клетки линии Сасо-2, культивируемые в микробиореакторе, имеют апикально-базальную поляризацию характерную для клеток эпителия тонкого кишечника in vivo в норме.

   Структура и объем диссертации. Диссертация написана по традиционному типу, содержит 137 страниц машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает в себя 204 источника. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками.

   Похожие диссертации на Изучение адаптивных реакций клеток эпителия кишечника при культивировании в условиях микробиореактора

   

   Изучение функционирования сердечно-сосудистой системы студентов в условиях экзаменационного стресса с учетом индивидуальных психологических и биологических особенностейСапёрова Елена Владимировна

   Адаптивные реакции клеток крови млекопитающих на воздействие электромагнитных полей радиочастотного диапазонаКоломиец Ирина Александровна

   

   Роль нейроглиальных взаимодействий и кальциевой сигнальной системы в реакциях нейронов и глиальных клеток речного рака на фотодинамическое воздействиеЛобанов Андрей Владимирович

   

   Сопряженность иммунофизиологических реакций макроорганизма и изолированных иммунокомпетентных клеток при различных режимах криовоздействияКостоломова Елена Геннадьевна

   

   Закономерности компенсаторно-приспособительных реакций, реализуемых в популяциях стволовых кроветворных клеток при хроническом радиационном воздействии : экспериментальное исследованиеЕфимова Наталья Владимировна

   

   Роль протеинкиназы С и кальция в регуляции водной проницаемости клеток эпителия собирательных трубок почки крысы вазопрессином в постнатальном онтогенезеКаткова, Любовь Евгеньевна

   

   Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых, пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D на послеспиртовой бардеФадеева Ирина Васильевна

   

   Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств Ночевная Татьяна Владимировна

   Некоторые особенности внутриэритроцитарного развития возбудителей трехдневной и тропической малярии (P. vivax и P. falciparum) при различных условиях культивированияАлиева, Шахла Нихан кызы

   

   Исследование оптимальных условий культивирования бактерий рода Pseudomonas-продуцентов биологически активных веществАсабина Елена Антоновна