Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Особенности функционирования иммунной системы в условиях природного холода 13
1.2 Закаливание - модель криовоздействия на организм человека 19
1.3. Исследование температурного воздействия на иммунную систему «in vivo» и «in vitro» 23
1.4. Клеточные факторы иммунной системы, как объект исследования 27
ГЛАВА 2. Контингент и методы исследований
2.1. Контингент обследованных 37
2.2. Иммунологические методы исследования 38
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Сравнительная характеристика иммунного статуса любителей зимнего плаванья («моржи») и контрольной группы 50
3.2. Влияние погружения в ледяную воду на изменение параметров иммунной системы лиц, адаптированных и неадаптированных к периодическому воздействию холода 53
3.2.1. Влияние погружения в ледяную воду на показатели иммунного статуса лиц, адаптированных к периодическому воздействию холода 54
3.2.2. Влияние погружения в ледяную воду на показатели иммунного статуса лиц, впервые подвергшихся погружению в ледяную воду 57
3.3. Характеристика влияния различных режимов криовоздействия на изолированные ИКК in vitro в контрольной группе 60
3.3.1. Характеристика изменения субпопуляционного состава лимфоцитов после охлаждения при t+2C 61
3.3.1.1. Характеристика влияния различных по длительности режимов криовоздействия на способность к пролиферации и продукции цитокинов МНК in vitro 63
3.3.2. Влияние различных режимов криовоздействия на функциональную активность моноцитов 66
3.3.3. Влияние различных режимов криовоздействия на функциональную активность нейтрофил ьных лейкоцитов 72
3.4. Характеристика влияния различных режимов криовоздействия на изолированные ИКК «моржей» in vitro 80
3.4.1. Характеристика изменения субпопуляционного состава лимфоцитов после охлаждения при t+2C в группе «моржей» 81
3.4.1.1. Сравнительная характеристика влияния различных по длительности режимов криовоздействия на способность к пролиферации и продукции цитокинов МНК «моржей» in vitro 83
3.4.2. Сравнительная характеристика влияния различных температурных режимов на функциональную активность моноцитов «моржей» in vitro 85
3.4.3. Сравнительная характеристика влияния различных температурных режимов на функциональную активность нейтрофилов в группе «моржи» in vitro 95
Заключение 101
Выводы 115
Практические рекомендации 117
Список литературы 118
- Особенности функционирования иммунной системы в условиях природного холода
- Иммунологические методы исследования
- Влияние погружения в ледяную воду на показатели иммунного статуса лиц, адаптированных к периодическому воздействию холода
- Характеристика изменения субпопуляционного состава лимфоцитов после охлаждения при t+2C
Введение к работе
Проблема активизации защитных сил организма немедикаментозными средствами - одна из важнейших в современной медицине и физиологии (Виноградова Т. В., 1988, 2002; Лущицкиий М. А. с соавт. 1981; Аржакова Л. И.,2000).
Известно, что в качестве средств, активно влияющих на иммунную систему, могут выступать факторы внешней среды, среди которых одним из наиболее значимых является холод (Анохин П. К., 1980; Слоним А. Д., 1986; Казначеев В. П. 1980; Медведев В. И., 1984; Агаджанян Н. А. 1984; Сороко С. И., 1984; Агаджанян Н. А., 2001).
О влиянии низких температур на организм человека с целью оздоровления известно давно. Более того, существует естественная «модель» влияния периодически повторяющихся Холодовых воздействий - лица, увлекающиеся зимним плаванием, - «моржи» (Бутов М. А., 1983, 1984; Воронцов И. М. с соавт., 1991; Гуцалов Ю. П., с соавт., 1978; Гаркави Л. X. с соавт., 979; Зиньков Ю. И,, Смирнов Т. В., Иванов В. Т., 1970; Лазаренко П. В., Симонова Т. Г., Якименко М. А., 1985; Марачев А. Г., 1977; Ногаллер А. М., Бутов М. А., Калыгина Т. А.., 1984; Темнюк А. М, 1976). Однако, совокупность конечных эффектов холодового воздействия, не только положительных (Бутов М. А., 1984; Ногаллер А. М. с соавт., 1984; Литасова Е. Е. с соавт., 1997; Морозов В. Н., с соавт.,1999), но и отрицательных (Эмирбеков Э. 3. с соавт., 1998., Воронцов И. М. с соавт., 1991; Ветрова Ю. В. с соавт., 2000; Аржакова Л. И., 2000, 2003), в большей мере обусловлена реакцией иммунной системы (Коненков В. И., 1992; Евсеева И. В., Алексеев Л. П., 2001; Черешнев В. А. с соавт., 2001).
Безусловно, большинство эффектов экстремального закаливания обеспечиваются вовлечением практически всех систем организма (Гаркави Л. X., с соавт., 1989; Анохин П. К.Д980; Козлов В. А., 2002).
Хорошо известно, что развитие адаптивных изменений метаболизма и функций связано с повышением эффективности как химической, так и физической терморегуляции и обеспечивается перестройкой путей активации адренергической системы регуляции (Лукоянов Ю. Е., 1989; Иванов К. П., 1980; Морозов В. R, Фризен В. Э., 1999; Ветрова Ю. В. с соавт., 2000; Козырева Т. В., 2003; Солонин Ю. Г., Кацюба Е. А. 2003). При постоянном действии холода развивается активация мозгового слоя надпочечников (Никулина Н. С. с соавт., 1991; Козырева Т. В. с соавт., 2003; Therminarias А., Chirpaz M.F., Tanche М.,1975), что, в свою очередь, приводит к активации жирового (Баженов Ю. Ш., с соавт.,1998) и углеводного обмена (Морозов В. Н., Фризен В. Э., 1999; Ветрова Ю. В. с соавт., 2000). В развитии метаболической реакции на холод значительную роль играют и тиреоидные гормоны и гипоталамо-гипофизарная система (Божко А. П., Городецкая И. В., 1991; 1994; Барашков В. А., Фомин, В. Н., 1994; Максимов А. Л., Горбачев А. Л., 2001, 2003; Madden K.S., Felten D.L., 1995). При периодическом действии холода изменяются режимы активности Холодовых рецепторов, развивается их демобилизация (Данилова Н. К., 1992; Козырева Т. В., с соавт., 1979; 1987; 1992; Ефес Е. Д., 1992; Арокина Н. К., Кузьмина Н. В.,1993; Jessen R., 1981; Van Someren R. N. M., Colesh.aw S. R. E., Mincer P. J., 1982; Brenner I., 1999), снижается порог чувствительности (Бочаров М. И., Сорока С. И., 1992), возрастают васкуляризация и кровоток (Темнюк А. М., 1976; Николаева Л. Я., Глико Л. И., 1993; Ананьев В. Н. с соавт., 2001; Солонин 10. Г., Кацюба Е. А. 2003). Однако иммунологическим механизмам уделяется не достаточно внимания (Аржакова Л. И. 2000; Морозов В. Н., Фризен В. Э., 1999; Ветрова Ю. В. с соавт., 2000).
Холодовое воздействие имеет ряд характеристик, наиболее значимыми из которых являются интенсивность (температура), длительность и периодичность (повторяемость) воздействия (Барбараш Н. А., 1996). Сочетания этих параметров определяют «режим» воздействия. Именно режим холодового воздействия в первую очередь должен определять ответную реакцию организма в целом и иммунологических механизмов в частности.
Поскольку патогенетические механизмы реагирования иммунной системы на влияние различных режимов крио воздействия не достаточно изучены, то конечные эффекты плохо предсказуемы, следовательно, могут быть использованы с лечебно - профилактической целью лишь условно.
Изучение особенностей реагирования иммунной системы в целом и отдельных ИКК в частности на различные режимы холодового воздействия (кратковременное и длительное, слабое и интенсивное, однократное и повторяющееся, in vivo и in vitro) позволит разработать не только оптимальные режимы крио воздействия для повышения общей резистентности организма, но и способы избирательного регулирования иммунного ответа для более успешного лечения заболеваний, в патогенезе которых значимую роль играют иммунные нарушения.
Это позволило сформулировать цель и задачи. ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние различных режимов криовоздействия на сопряженность иммунофизиологических реакций макроорганизма и изолированных иммунекомпетентных клеток. ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Провести сравнительное исследование иммунного статуса лиц, подвергающихся периодическому холодовому воздействию и «практически здоровых», не занимающихся экстремальными видами закаливания.
Оценить влияние погружения в ледяную воду на изменения параметров иммунной системы лиц, адаптированных к периодическим Холодовым воздействиям (группа «моржей») в сравнении с группой неадаптированных (контрольная группа).
3. Провести сравнительное изучение влияния длительности криовоздействия на функциональную активность лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов группы «моржей» и контрольной группы (in vitro).
4. Изучить динамику функциональной активности моноцитов и нейтрофилов при циклическом холодовом воздействии в группе «моржей» по сравнению с контрольной группы (in vitro). НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые проведено комплексное исследование характера влияния периодического холодового воздействия на показатели иммунного статуса любителей зимнего плаванья - группа «моржей». Установлено, у любителей зимнего плавания формируется иной, отличный от контрольной группы тип поддержания здоровья. Особенность заключается в перераспределении рецепторно-субпопуляционных маркеров лимфоцитарно-клеточного звена, повышении уровня иммуноглобулинов классов М и G на фоне снижения уровня ЦИК (3,5 %) и достоверно более низких цифр интенсивности фагоцитоза нейтрофилов и активности кислородзависимого метаболизма моноцитов.
Впервые проведен сравнительный анализ параметров иммунной системы «практически здоровых» и «моржей» в ответ на погружение в ледяную воду. Привычное погружение (в группе «моржей») в ледяную воду приводит к увеличению абсолютного и относительного содержания активированных лимфоцитов (КІ67+) и CD95 позитивных клеток, зрелых Т-лимфоцитов, повышению уровня сывороточного IL-4. При первом погружении (контрольная группа) увеличивается уровень CD16+; КІ67+ и CD95+ клеток, снижается число CD3+ лимфоцитов, на фоне снижения IL-4, отмечен рост уровня сывороточного INF-y.
Впервые проведено комплексное исследование влияния различных по длительности, интенсивности и периодичности температурных режимов на функции нммунокомпетентных клеток (ИКК) (in vitro) в зависимости от исходной тренированности макроорганизма. Установлено, что ИКК обладают различной чувствительностью к количеству циклических Холодовых воздействий in vitro в зависимости от исходной тренированности макр о организма.
11 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Учитывая, что ИКК по-разному отвечают на криовоздействие, в зависимости от тренированности организма к Холодовым нагрузкам, полученные результаты могут послужить основанием для разработки диагностических тестов in vitro с целью прогнозирования чувствительности макроорганизма к Холодовым нагрузкам и эффективности закаливания.
Различия физиологических реакций ИКК на криовоздействие (in vitro) позволяют использовать данный феномен в качестве дополнительного критерия при выявлении возможной устойчивости макроорганизма к Холодовым нагрузкам, в частности лиц, работающих вахтовым методом в районах Крайнего Севера. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
У любителей зимнего плавания формируется иной тип иммунного статуса, проявляющийся в перераспределении активационно-пролиферативной составляющей лимфоцитарно-клеточного звена, повышении уровня иммуноглобулинов классов М и G на фоне уменьшения крупномолекулярных ЦИК, снижения интенсивности фагоцитоза нейтрофилов и активности кислородзависимого метаболизма моноцитов.
Реакция иммунной системы на эпизод холодового воздействия зависит от «тренированности» макроорганизма.
3. ИКК являются носителями памяти стереотипа реагирования макроорганизма на холодовое воздействие.
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ
Результаты работы внедрены в лечебно-профилактические программы ТФ ГУ НИИКИ СО РАМН, санатория-профилактория «Юность» ТюмГНГУ. Материалы исследования используются в лекционном курсе «Основы иммунологии» на кафедре анатомии и физиологии человека и животных ТюмГУ.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ
Основные положения работы доложены на Международной конференции «Криосфера земли как среда жизнеобеспечения» (Пущино, 2003); Ш-й конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); V-й конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005); совместном заседании Ученого совета ТФ ГУ НИИКИ СО РАМН и «НИИ общей и прикладной криологии» ТюмГНГУ (Тюмень, 2006); Международной конференции «Теория и практика оценки криосферы земли и прогноз ее изменений» (Тюмень, 2006). Материалы работы были включены в методические рекомендации «Криотерапия в практике врача клинициста». - Тюмень, 2005. -26 с.
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ
Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 33 диаграммы. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав с характеристикой обследуемого контингента и описанием методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 170 отечественных и 35 иностранных источника.
Особенности функционирования иммунной системы в условиях природного холода
Российский Север занимает две трети территории страны с населением 12 миллионов человек (Зайдфудим П. X., Дорожинкевич С. И., 1999; Кривошапкин В. Г. с соавт., 2002). В условиях Севера ведущим медико-географическим фактором является холод, т.к. неблагоприятное сочетание метеорологических факторов - пониженной температуры воздуха, сильного ветра, высокой влажности - создает условия для охлаждения организма (Майстрах Е. В. 1975). Хроническое охлаждение (длительная гипотермия) вызывает характерные нарушения тканевых структур, которые можно рассматривать как типичные трофические расстройства, и ведет к развитию так называемой «холодовой болезни» (Поплетеева С, 2000; Майстрах Е. В., 1984). Занимаясь более 30 лет изучением влияния холода на человеческий организм Орлов Г. А. (1978) показал, что хроническое поражение холодом характеризуется полиморфизмом клинической картины, часто является причиной нейроваскулитов, невритов, гастритов, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, заболеваний аллергического характера. Наиболее подвержены этим заболеваниям лесорубы, моряки, рыбообработчики, строители.
Ряд авторов отмечает, что общее охлаждение организма неблагоприятно отражается на устойчивости организма к инфекционным агентам, зачастую приводя к развитию воспалительных заболеваний вплоть до сепсиса (Анохин П. К. , 1980; Слоним А. Д., 1986; Сороко С. И., 1984; Казначеев В. П., 1980; Медведев В. И., 1984; Агаджанян Н. А., 1984, 2001; Арефьева, Н.А., 1992). Известно, что иммунная система является индикатором неблагоприятного влияния окружающей среды на организм человека (Черешнев В. А. с соавт., 2001). Следовательно, изучение сохранившихся северных природных популяций человека («антропологических изолятов») представляет особый интерес в связи с исследованием механизмов, ответственных за жизнеобеспечение и реализацию здоровья в этих условиях (Осипова Л. П., 1992; Пиковская Н. Б. с соавт., 1992; Ткачев А. В. с соавт., 2005).
На основании комплексной динамической оценки иммунного статуса коренного населения Северных регионов, установлено, что нормативные иммунологические показатели в условиях полярных широт имеют значительные отличия от сред неширотных (Хаитов Р. М, Пинегин Б. В., 2001). Ряд авторов (Казначеев В. П., 1980; Ветрова Ю. В. с соавт., 2000) отмечает, что в условиях Крайнего Севера иммунная система меняет свою активность - происходит угнетение синтеза специфических антител после иммунизации, снижение концентрации иммуноглобулинов, фагоцитарной активности, повышение уровня апоптоза иммунокомпетентных клеток.
Щеголевой Л. С. с соавт. (2003), Евсеевой И. В. с соавт. (2001), Divekar Н.М. et. all (1990) замечено, что у аборигенного населения северных районов число лейкоцитов на 1000-3000 меньше чем в средней полосе, причем, в большей степени за счет нейтрофилов, в то время как снижение количества лимфоцитов выражено в меньшей степени. Новиков B.C. с соавт. (1991) отмечает у коренных северян нормативное повышение количества лимфоцитов.
По данным литературы, общее повышение лимфоцитов коррелирует с повышением функциональной активности ИКК. Так Добродеева Л. К. с соавт. (2001), Щеголева Л. С. с соавт. (2001, 2003) отмечают у коренных северян повышение содержания в крови ИКК, экс премирующих рецепторы активации CD25+, HLA-DR(II), CD71+, а также цитотоксических лимфоцитов и клеток с маркером готовности к апоптозу (CD95+). Матаевым С. И., Суховеем Ю. Г. с соавторами (1997) у ненцев Самбургской тундры выявлено повышение относительных показателей субпопуляции клеток-предшественников (CD34+-), активированных Т-лимфоцитов (CD38+), супрессорно-цитотоксических клеток (CD8+), лимфоцитов - носителей маркера готовности к апоптозу (CD95+). Литасова Е. Е. с соавт. (1997) доказали, что под влиянием охлаждения активируются клеточные факторы иммунитета, повышается функциональная активность Т-лимфоцитов, усиливается ответ на поликлональные митогены, отмечается корригирующее влияние на гуморальные реакции организма.
Евсеева И. В. с соавт. (2001) отмечает, что из-за длительного преобладания активизации Т-клеточного звена развивается вторичное изменение Т-клеточного набора путем нарушения клонального равновесия, и указывают на то, что состояние иммунной системы аборигенного населения Севера отличается низким содержанием в крови функционально активных Т-лимфоцитов. Гельфгат Е. Л. с соавт. (1990), Новиков В. С. с соавт. (1995) при обследовании коренного населения Чукотки, Кольского полуострова выявили снижение относительного содержания Т-лимфоцитов в периферической крови, при этом у аборигенов Чукотки было отмечено значительное увеличение количества незрелых лимфоидных элементов крови, не имеющих маркеров В - и Т-лимфоцитов.
Данные литературы по уровню гуморальных факторов ИС коренных народов Севера неоднозначны. Новиков В. С. с соавт. (1991) отмечает у коренных северян снижение концентрации иммуноглобулинов. Евсеева И. В. с соавт. (2001) отмечают, что состояние иммунной системы аборигенного населения Севера отличается низким содержанием в крови IgA на фоне дисбаланса содержания IgM, относительно высокой концентраций IgG и IgE, повышенным уровнем циркулирующих иммунных комплексов. Матаев С. И. с соавт. (1997) указывает на более высокую концентрацию сывороточных IgA, IgM, IgG у ненцев Самбургской тундры в сравнении с жителями средней полосы. Ряд авторов указывают на то, что, на фоне длительного зимнего периода, в сравнении с летним, более комфортным, у коренного населения Крайнего Севера выявлено достоверное повышение в сыворотке крови иммуноглобулинов классов IgA, IgG и низкомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов (Вереснева Л. А., 2005; Вереснева Л. А.,Фишман Е. А., 2006). У северных аборигенов отмечается стойкая моноцитопения, угнетение функциональной активности фагоцитов, снижение в них пероксидазы (Попов В. А. 1965; Крылов А. А., 1967; Бобров Н. И. с соавт., 1979; Воронцов И. М. с соавт., 1991; Морозов В. Н. с соавт., 1999). Вышеперечисленные особенности иммунного ответа касаются преимущественно коренного населения северных территорий. Значительно меньше данных о динамике изменения иммунитета у пришлого населения, длительно проживающих в условиях арктической зоны, у родившихся и постоянно проживающего в данных условиях (Авеличев О.Н., 1976; Гельфгат Е. Л. с соавт., 1990).
Иммунологические методы исследования
В настоящей работе использованы методы лабораторного иммунологического обследования, подбор которых осуществлялся с учетом основных задач исследования, при этом учитывалась необходимость изучения не только количественных параметров различных звеньев иммунной системы, но и их функциональных характеристик. Комплекс лабораторных методов включал определение общеклиническими методами числа лейкоцитов (лейкоцитоз) и клеточного состава (лейкоцитарная формула), изучение параметров лимфоцитарно-клеточного звена, исследование функциональной активности гуморального, моноцитарно - и нейтрофильно - фагоцитарного звеньев иммунной системы. Так же проведены комплексные исследования на экспериментальных моделях с использованием иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов). 2.1. КОНТИНГЕНТ ОБСЛЕДОВАННЫХ Обследовано 67 человек, занимающихся зимним плаванием 37 мужчин и 30 женщин, в возрасте от 12 до 77 лет (клуб «Кристалл» г. Тюмень). Исследование проведено в феврале 2002 года. Средний возраст обследуемых составил 42,8±15,88 года. Средний срок занятия зимним плаванием 2,4±1,2 года. До года занимаются 35,8±0,53%, от года до двух лет 14,93±0,22%, от двух до пяти лет 22,9±0,33%, более 5 лет 2б,8±0,40% обследуемых. В контрольную группу обследованных вошли 51 «практически здоровых» человек (22 мужчины (43,1%) и 29 женщин (56,9%)) в возрасте от 19 до 47 лет, не страдающих повышенной частотой возникновения острых воспалительных процессов и не имеющих хронических инфекционно-воспалительных заболеваний. Пациенты сравниваемых групп находились под совместным динамическим наблюдением врачей-иммунологов, хирургов, терапевтов медико-санитарной ОГУЗ «им. Е.М. Нигинского» и ТФ ГУ НИИКИ СО РАМН. На момент проведения лабораторного обследования были
клинически здоровы, у них не отмечалось явлений острого воспалительного заболевания, общепринятые лабораторные показатели активности (СОЭ, СРВ, количество лейкоцитов, содержание форменных элементов крови) находились в пределах общепринятой нормы. 2.2. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для проведения исследований использовалась венозная гепаринизированная кровь, из которой стандартными методами выделяли лейковзвесь, мононуклеарные (МНК) клетки и сыворотку для дальнейшего исследования. Для этого кровь, взятую из локтевой вены, переносили в пробирку с гепарином из расчета 20 ЕД гепарина в 0,1 мл на 1,0 мл крови. Для предотвращения свертывания кровь тщательно перемешивали с антикоагулянтом. В пробирку наливали 3 мл раствора фиколл-верографина (плотность = 1,076 г/смЗ) и с помощью пипетки наслаивали 8 мл крови, разведенной раствором Версена в отношении 1:3. Подготовленные таким образом пробирки центрифугировали в горизонтальном роторе при 400 G в течение 45 минут. После чего пипеткой отбирали интерфазный слой МНК. Методы оценки функциональной характеристики лимфоцитов. Изучение лимфоцитарно-клеточного звена иммунной системы проводилось методом непрямой иммунофлуоресценции и иммуногистохимического анализа для определения фенотипа лимфоцитов с помощью моноклональных антител (МКА) (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., 1995), позволяющих идентифицировать субпопуляции лимфоцитов по наличию дифференцировочных антигенов (Барышников АЛО., 2002). Для фенотипирования клеток использовались МКА фирмы «Сорбент» (Москва) и «Becton Dickinson» (США).
Фенотип субпопуляции лимфоцитов оценивался с помощью расширенной панели МКА к антигенам: CD3 - комплекс поверхностных молекул, ассоциированных с ТКР, экспрессируется на всех Т-лимфоцитах; CD4 - рецептор для HLA II класса, экспрессируется на Т хел пер ах/и ндукторах; CDS - рецептор для HLA I класса, экспрессируется на Т супрессорах/цитотоксических; CD16 (Fcylll) - низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgG, экспрессируется на ЕК-клетках, активированных моноцитах/макрофагах, нейтрофилах; CD25 - экспрессируется на В-лимфоцитах и активированных Т-лимфоцитах, является рецептором для ИЛ-2, под влиянием ИФН -у и ИЛ-2 может экспрессироваться на макрофагах; CD38 - экспрессируется на незрелых и активированных Т - и В-лимфоцитах, незрелых моноцитах и нейтрофилах, принимает участие в активации и пролиферации лимфоцитов, адгезии с эндотелием, является мембранным активационным маркером клеток иммунной системы; CD71 - экспрессируется на активированных клетках и пролиферирующих лимфоцитах и макрофагах, является рецептором для трансферрина; CD95 - экспрессируется на активированных лимфоцитах, моноцитах/макрофагах и гранулоцитах, является акцептором проапоптотических сигналов и трансдуктором сигнала апоптоза; HLA-DR - экспрессируется на В-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах и активированных Т-хелперах, принимает участие в презентации антигена, выявляется в первую очередь на поверхности клеток, которые осуществляют контроль за антигенным гомеостазом организма и принимают участие в элиминации собственных модифицированных клеток или МНС-чужеродных белков; Annexin V (An V) - маркер апоптоза клеток, связывается с фосфатидилсериновыми рецепторами, которые экспрессируются на клетках, вступивших на путь апоптоза; PI - пропидиум иодид, маркер некроза клеток, окрашивает клетки с поврежденной мембраной; в качестве маркера пролиферации определяли экспрессию белков пролиферации КІ67- ядерного антигена, присутствующего в клетках во время активных фаз клеточного цикла Gl, G2, S, М. Постановка метода.
Влияние погружения в ледяную воду на показатели иммунного статуса лиц, адаптированных к периодическому воздействию холода
В таблицах 5, 6, 7, представлены основные изменения показателей иммунной системы, происходящие в результате погружения в ледяную воду, группы «моржи». Таблица 5 Изменения показателей периферической крови в группе любителей зимнсі о плавания, до и после погружения в ледяную воду, М±т достоверность различия по сравнению с контролем р 0,05; р 0,01; р 0,001 Из представленных в таблице данных видно, что после погружения в холодную воду у «моржей» достоверно повышается общее число лейкоцитов за счет увеличения основных клеточных популяций (сегментоядерных нейтрофилов (р 0,01), лимфоцитов (р 0,05) и моноцитов (р 0,01)), а их процентное соотношение между собой не изменяется. Таблица 6 Изменение поісазателсй лимфоцитарно-клеточного звена группы любителей зимнего плавания до и после погружения в ледяную воду, М±т достоверность различия по сравнению с контролем р 0,001 Результаты исследования, приведенные в таблице 6, демонстрируют изменения со стороны лимфоцитарно-клеточного звена в ответ на «привычное» охлаждение, которое характеризуется повышением в периферической крови абсолютных величин общего числа Т - лимфоцитов (CD3+) и активационных маркеров CD95+ и КІ67+. Таблица 7 Изменение концентрации у-ИНФ и ИЛ-4 в сыворотке крови у группы любителей зимнего плавания до и после погружения в ледяную воду, М+т достоверность различия по сравнению с контролем р 0,001 В группе «моржи» (таблица 7) в сыворотке крови достоверно (р 0,001) увеличивается содержание ИЛ-4 (более чем в 2,5 раза), при этом концентрация у-ИНФ имеет тенденцию к росту, но эти изменения не достоверны. Корреляционный и факторный анализ показал сильную положительную корреляционную связь уровня лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов (КК=0,674253, р 0,001; F=33,34298, р 0,001), моноцитов (КК=0,421578, р 0,01; F=8,645725, р 0,01) и лимфоцитов (KK=0,664435,p 0,001;F=31,61705,p 0,001). Активационный показатель CD95+ корреляционно связан с CD 16+ (КК=0,68; р 0,001) и КІ67+ (КК=0,41; р 0,01); показатель пролиферативной активности (КІ67+) имеет прямые связи с CD95+ (КК=0,33; р 0,05) и уровнем ИЛ-4 (КЮ=0,42; р 0,01). Факторный анализ выявил влияние клеток CD95+ на уровень параметров КІ67+ (F=19,78 при sig=0,0001). Не смотря на то, что уровень натуральных киллеров (CD16+ клеток) в крови обследуемых в результате купания достоверно не изменялся, по данным факторного анализа время пребывания в проруби оказывает существенное влияние на уровень CD16+ (F-12,0433, р 0,001) при отрицательной корреляционной взаимосвязи (КК=-0,6179, р 0,001). Таким образом, погружение в ледяную воду лиц, привычных к подобному холодовому воздействию приводит к повышению абсолютного числа нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов в периферической крови, что обуславливает увеличение общего числа лейкоцитов. Со стороны лимфоцитарно-клеточного звена наблюдается увеличение общего числа Т-лимфоцитов (CD3+), клеток экспрессирующих активационно-пролиферационные маркеры КІ67 и CD95. Кроме того, наблюдается значительное увеличение сывороточной концентрации ИЛ-4. Поскольку ИЛ-4 - является основным цитокином Th2 лимфоцитов, то преимущественный рост этого показателя может быть расценен, как продукт активации Th2 ответа. 3.2.2. ВЛИЯНИЕ ПОГРУЖЕНИЯ В ЛЕДЯНУЮ ВОДУ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУННОГО СТАТУСА ЛИЦ, ВПЕРВЫЕ ПОДВЕРГШИХСЯ ПОГРУЖЕНИЮ В ЛЕДЯНУЮ ВОДУ В этом разделе представлены изменения показателей иммунной системы у лиц, впервые погрузившихся в ледяную воду (до и после погружения). Таблица 8 Сравнительная характеристика показателей лейкоцитарной формулы контрольной группы до и после купания в ледяной воде, М±т достоверность различия по сравнению с контролем р 0.05; р 0.01 Из таблицы 8 следует, что в данной группе наблюдается достоверное повышение (р 0,01) моноцитов как относительных, так и абсолютных показателях в лейкоцитарной формуле, при достоверном снижении относительного содержания лимфоцитов (р 0,05). Таблица 9 Изменение показателей лимфоцитарно - клеточного звена контрольной группы до и после погружения в ледяную воду, М±ш достоверность различия по сравнению с контролем р 0,05; р 0,01 Из таблицы 9 следует, что после холодового воздействия в контрольной группе наблюдается достоверное увеличение (р 0,05) абсолютного и относительного содержания уровня натуральных киллеров (CD16+ клеток). Происходит рост количества лимфоцитов (р 0,01) , несущих маркеры КІ67 и CD95, при снижении (р 0,05) относительного числа зрелых Т-лимфоцитов (СЮЗ+клеток). Таблица 10 Изменение концентрации у-ИНФ и ИЛ-4 в сыворотке крови у контрольной і руппы до и после погружении в ледяную воду, М±т достоверность различия по сравнению с контролем р 0,001 Факт погружения в ледяную воду (таблица 10) достоверно повышает концентрацию сывороточного у-ИНФ (р 0,001) и снижает концентрацию IL-4(р 0,001). В результате корреляционного факторного анализа, выявлена сильная положительная корреляционная связь факта погружения и увеличения абсолютного уровня моноцитов (КЮ=0,368291, р 0,01; F=7,397062, р 0,01). Показатель CD16+ имеет сильные корреляционные связи с CD3+ (КК=0,94; р 0,001), CD95+ (КК=0,60; р 0,001) и уровнем у-ИФН (КК=0,68; р 0,01). Показатель пролиферативной активности (КІ67+) имеет сильные прямыми связи с CD95+ (КК=0,73; р 0,001) при (F=7,8 при sig=0,05). Факторный анализ свидетельствует о том, что на уровень CD3+ оказывает выраженное влияние клетки с маркерами CDI6+ (F=8,3 при sig = 0,01). Уровень у-ИФН влияет HaCD16+(F=4,5 при sig =0,01). Таким образом, результаты влияния экстремального криовоздействия впервые и при привычном погружении различны. Отличия заключаются в том, что привычное погружение в ледяную воду приводит к выбросу в периферическую кровь значительного числа лейкоцитов всех популяций, при первом погружении такая реакция отсутствует, но имеет место увеличение числа моноцитов при достоверном снижении уровня лимфоцитов.
Характеристика изменения субпопуляционного состава лимфоцитов после охлаждения при t+2C
Поскольку в доступной литературе данных об ответе ИКК на криовоздействие обнаружить не удалось, для оценки ответа в группе сравнения необходим «эталон» - контрольная группа. На первом этапе изучали влияние длительности холодового воздействия на лимфоциты контрольной группы. Дизайн эксперимента Оценка длительности холодового воздействия. Выделенные из периферической крови стандартным методом лимфоциты в количестве 2,5x10 подвергали холодовому воздействию при температуре +2С, в течение 5,10,15,20,25,30 и 60 минут. После каждой инкубации методом иммуногистохимического анализа изучали состояние мембранных маркеров: CD38, CD8, CD4, CD3, CD 71, CD25, CD16, HLA-DR, CD95, КІ67. После 5, 10, 15 ,20мин. охлаждения количество жизнеспособных клеток в суспензии достоверно не изменялось. При 25 минутной экспозиции количество жизнеспособных клеток составило 2,0x10б. При 30 минутной экспозиции количество жизнеспособных клеток в суспензии снизилось до 1,5х10б. Динамика изменения соотношения субпопуляции лимфоцитов представлена на диаграмме 1. Из диаграммы 1 видно, что на 5,10,15 и 20 минуте холодовой нагрузки достоверного изменения в субпопуляционном составе лимфоцитов не выявлено. После 20 минут зафиксировано перераспределение отдельных клеточных субпопуляций с максимумом на 30 минуте, при этом, количество жизнеспособных клеток снизилось на 25% (р 0.01). После 60 минутного воздействия на клетки наблюдается гибель 100% лимфоцитов. Диаграмма Таблица 11 Субпопуляционный состав лимфоцитов контрольной группы, после охлаждения в течение 30 минут (t+2C) in vitro (M+m), (n=30) достоверность различия по сравнению с контролем р 0,05, р 0,01, р 0,001 Анализ таблицы 11, представляющей соотношение субпопуляции лимфоцитов, свидетельствует, что после 30 минутного температурного воздействия отмечено повышение супрессорно - цитотоксической субпопуляции Т-лимфоцитов (CD8+; р 0,001) и снижение хелперно-индукторной субпопуляции (CD4+; р 0,01). Кроме того, достоверно увеличился уровень носителей маркеров (CD16+; р 0,05, CD25+; р 0,001, CD95+; р 0,01, Ki 67+; р 0,001). Одновременно снизилось количество клеток (CD38+; р 0,05) и носителей маркеров (HLA DR+; р 0,05). В абсолютных величинах наблюдаем достоверное снижение CD4+ (р 0,01), CD38+ (р 0,001) и достоверный рост уровня клеток носителей маркера Ki 67+(р 0,001). Таким образом, длительное холодовое воздействие (30 мин.) вызывает перераспределение популяционного состава лимфоцитов в пользу цитотоксической-ЫК-популяции, роста активационно - пролиферативных и проапоптотических маркеров с опережающим ростом пролиферативных. Одними из репертуарных лимфокинов, определяющими дивергенцию иммунного ответа можно назвать ИЛ-4, который вырабатывают Тп2-клетки, основными продуцентами у-ИФН являются ТЫ. Другим важнейшим коррелятором активности ИКК, с которого практически начинается формирование любого иммунного ответа как гуморального, так и клеточного типа, является РБТЛ. Дизайн эксперимента 1.Контроль - МНК в количестве 2х105 на лунку 96 луночного планшета инкубировали в полной культуральной среде (RPMI 1640,с 10% ЭТС,2мМ L-глутамина и 40мкг/мл гентомицина). 2. Серия 1 - МНК в количестве 2x105 на лунку 96 луночного планшета инкубировали в полной культуральной среде с добавлением фитогемагглютинина (ФГА) в концентрации 5мкг/мл. 3. Серия 2 - МНК в количестве 2х105 на лунку 96 луночного планшета подвергали холодовому воздействию при температуре +2 С, в течение 5 минут, затем инкубировали в полной культуральной среде. 4. Серия 3 - МНК в количестве 2x105 на лунку 96 луночного планшета подвергали холодовому воздействию при температуре +2 С, в течение 30 минут, затем инкубировали в полной культуральной среде.
