Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1. Объект исследования 9
2. Обзор литературы по подвижности протоплазмы в клетках харовых водорослей 4А
3. Обзор литературы по электрофизиологическим характеристикам мембран клеток харовых водорослей 33
ГЛАВА II. Исследование нестационарного течения протоплазм в клетках водоросли Klmdcl методом лазерной доплеровской спектроскопии
1, Метод лазерной доплеровской спектроскопии и его применение для исследования биологических объектов
2. Измерительно-вычислительный комплекс "Лазерный доплеровский спектрометр на базе ЭВМ ЕС-1010% Основные метрологические характеристики 67
3. Сигнал ЛДС и его спектр от стационарного потока в клетках Кинетика изменения формы спектра при остановке и восстановлении течения протоплазмы 77
4. Выделение компонент спектра, непосредственно связанных с потоком протоплазмы. Их временные характеристики и связь с распределением скоростей в потоке
5. Алгоритм определения скорости потока по форме спектра. Происхождение флуктуации скорости .
6. Кинетика восстановления скорости течения протоплазмы после временной остановки 95
7. Двухточечные измерения кинетики восстановления скорости течения протоплазмы после временной остановки 99
8. Тонкая структура спектра сигнала ЛДС от клеток водоросли KilePPopsLS 103
ГЛАВА III. О корреляционное связи между подвижностью протоплазмы и суммарным потенциалом мембран клеток водоросли
1. Методика отведения потенциала
2. Одновременная регистрация потенциала "вакуоль-внешняя среда" и скорости течения протоплазмы .118
3, Одновременная регистрация потенциала "вакуоль-внешняя среда" и скорости течения протоплазмы при изменяющихся световых условиях 125
ГЛАВА ІV. Математическая модмь подвижности протоплазмы в клетках водоросли
1. Постановка задачи. Обзор математических моделей подвижности протоплазмы в клетках харовых водорослей
2. Блок-схема математической модели 138
3. Математическая модель стационарного и нестационарного течения протоплазмы под действием заданного распределения движущей силы 140
4. Математические модели молекулярного механизма генерации движущей силы течения и их анализ .151
Заключение
Список литературы 171
Приложения . 158
- Обзор литературы по электрофизиологическим характеристикам мембран клеток харовых водорослей
- Сигнал ЛДС и его спектр от стационарного потока в клетках Кинетика изменения формы спектра при остановке и восстановлении течения протоплазмы
- Одновременная регистрация потенциала "вакуоль-внешняя среда" и скорости течения протоплазмы
- Математическая модель стационарного и нестационарного течения протоплазмы под действием заданного распределения движущей силы
Обзор литературы по электрофизиологическим характеристикам мембран клеток харовых водорослей
Во всей толще эндоплазмы были обнаружены эндоплазматиче-ские филаменты [16,32] диаметром 0,1 мкм и более длинные, чем размер поля зрения микроскопа. Подсчет числа филаментов в поле зрения микроскопа позволил рассчитать, что для клетки
длиной 2 см общая длина филаментов составляет около 52 м. Средняя плотность расположения филаментов - 16-17 шт. на 100 мкм .
Поскольку максимальный диаметр филаментов находится на пределе разрешающей способности микроскопа, то, очевидно, более тонкие филаменты лежали за пределами видимости, и поэтому приведенная выше цифра является, по-видимому, нижним пределом реальной величины. К сожалению, Аллен не приводит никаких, даже приблизительных оценок распределения филаментов по диаметрам. Самые толстые из них наблюдались визуально только в момент остановки течения, при этом они были направлены по существовавшей до этого скорости течения. При восстановлении течения их очертания размывались, и движение филаментов наблюдалось по движению связанных с ними частиц - сферосом. На исследованных кадрах снятого Аллен микрофильма были выделены поступательно перемещающиеся в направлении течения волнообразные цуги частиц. Автор предположила, что эти частицы связаны каким-то образом с филаментами, и что их движение отражает движение самих филаментов. Цуги частиц перемещались на расстояние порядка нескольких длин волн, после чего происходил распад цуга. Параметры этих волнообразных движений сильно варьировали: длина волны - от 17 до 144 мкм, амплитуда - от 2 до 7 мкм, скорость распространения волны (то есть скорость поступательного пере-мещения цуга) - 88 мкм/с. Средние по наблюдавшимся значения параметров: длина волны - 25 мкм/с, амплитуда - 5 мкм.
Наблюдения того же автора за восстановлением течения после остановки, вызванной механическим шоком, показали, что сначала появляются салтации этих частиц вдоль филаментов, а потом они интегрируются непрерывным течением, В той же работе на основании развитых для передвижения жгутиковых организмов математических моделей приведены оценки движущей силы течения, создаваемой системой волнообразно-колеблющихся филаментов, которая дала значение 9,3 дин/см Следовательно, в первом приближении система таких филаментов может обеспечить достаточную плотность движущей силы.
Было показано, что эндоплазматические филаменты являются ответвлениями субкортикальных фибрилл [32,33] . Результаты электронно-микроскопических исследований эндоплазматических филаментов показали, что их диаметр варьирует от 80 до 410 нм [ЗІ, 32]. Каждый филамент представляет собой связку из 50-100 мик-рофиламентов толщиной а 7 нм. Плотность упаковки микрофиламен-тов 9,3 10 филамента на мгаг. Геометрической регулярности упаковки нет [34] Эти пучки микрофиламентов обнаруживают поперечную периодичность с периодом 38 шл, обусловленную, по-видимому, поперечными связками, удерживающими филаменты в едином пучке [34].
В той же работе изучена структура связанных с филаментами сферосом. Они представляют собой сферические органеллы, обладающие одним или несколькими выростами, с помощью которых они закрепляются и передвигаются по филаментам. Средний диаметр выроста - 50 нм, длина сильно варьирует. Внешняя сторона выроста покрыта глобулами диаметром 20-30 нм на расстоянии 100 - 130 нм друг от друга, диаметр самих сферосом изменяется в пределах 0,2-2 мкм по данным [34] и 0,2-0,8 мкм по данным [4]. Распределение сферосом по размерам определено не было.
В пользу того, что генерация движущей силы течения происходит на поверхности эндоплазматических филаментов и субкортикальных фибрилл, свидетельствуют наблюдения линейных и циклических фибрилл в каплях цитоплазмы, изолированной из клеток
Спссга [Зб], а также внутри слабоцентрифугированных клеток междоузлий miQccCL и Слага [ЗО]. В, каплях цитоплазмы, помещенных в клеточный сок этих клеток, в течение нескольких часов наблюдались фибриллярные структуры, как линейные, так и образующие многогранники. Линейные фибриллы проявляли бурные волнообразные движения наряду с продольным перемещением, а замкнутые - вращались с изменением формы.
С целью проверки предположения о присутствии этих фибриллярных структур внутри клетки Камитсубо были проведены аналогичные наблюдения на частично-центрифугированных клетках и Cna.2CL . В свободной от хлоропластов зоне центрифугированной клетки обнаружены разные типы свободно движущихся фибрилл. Их свойства оказались в основном теми же, что у фибрилл, наблюдавшихся в каплях изолированной цитоплазмы
Они принимают различные формы: от круговых и полукруговых до многоугольников. Диаметр кругов или многогранников колебался в пределах 10 - 20 мкм. По подвижности фибриллы могут быть разделены на 2 типа: I. Волнообразный тип, к которому принадлежат фибриллярные петли, обнаруживающие непрерывное волнообразное изменение своей формы. 2. Вращательный тип, к которому относятся петли, быстро вращающиеся без изменения формы. Фибриллы первого типа почти всегда покрыты частицами, наломинающими сферосомы, которые могут двигаться как в направлении проявляемого иногда этими петлями медленного вращения, так и в противоположном направлении. Сравнительно близко расположенные частицы пассивно колеблются около некоторого первоначального положения в результате ундуляции фибрилл. Частицы, находящиеся очень близко или в контакте с петлей, движутся со- или антинаправленно по отношению к направлению распространения волны. Первый случай движения частиц встречается реже, чем второй.
Сигнал ЛДС и его спектр от стационарного потока в клетках Кинетика изменения формы спектра при остановке и восстановлении течения протоплазмы
Процессы, происходящие при освещении адаптированных к темноте клеток харовых водорослей в целом качественно сходны для разных их видов. Так, проведенное в работе [85І детальное изучение фотоответа клеток nLieiwpsls Oozasa показало, что и в этих клетках наблюдается сходный с соответствующей реакцией клеток РііІессо. фотоответ плазмалеммы и тонопласта клетки, сопровождающийся подкислением вакуолярного сока. Для этих клеток деполяризация мембраны после включения света начинается на 10 - 15 с позже, чем изменение рН вакуолярного сока. Причем изменения рН большой амплитуды могут протекать при незначительном изменении Жвс Для клеток, адаптированных к темноте, зависимость рНвак# от рН не проявлялась. Это указывает на повышение проводимости плазмалеммы для ионов п под действием света. На основании этих данных авторы делают вывод о том, что увеличение активного потока п и (или) уменьшение пассивного потока Н является, вероятнее всего, следствием увеличения активности л в эндоплазме в результате включения фотосинтеза. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о выделении ионов при освещении интактных хлоропластов [79] .
Одной из причин широкого использования клеток харовых водорослей в качестве объектов электрофизиологического исследования является способность их мембран к возбуждению под действием разнообразных стимулов: резких изменений концентраций некоторых ионов во внешнем растворе или световых условий, температуры окружающей среды, механического шока, деполяризующего плазмалем-му импульса тока, превышающего некоторое пороговое значение [з,б] . Другие семейства водорослей с гигантскими клетками этим свойством не обладают [з]. Возбуждение мембраны выражается в генерации короткого импульса деполяризации, потенциала действия (ПД), распространяющегося по мембране во все стороны от точки стимуляции [з] . ПД, возбужденный на одной из клеток водоросли, передается через узловые клетки на соседние междоузлия [з,4,73] . Это обусловлено достаточно низким сопротивлением связи клеток друг с другом, осуществляемой через систему плазмадесматических пор [з,4] . Поскольку для генерации ПД необходимо возникновение локальных токов через мембрану, то его распространение по поверхности мембраны может быть блокировано повышением сопротивления внешней среды [з] После генерации ПД наступает рефрактерный период, в течение которого возбуждение невозможно [3,5]. Длительность рефрактерного периода составляет несколько секунд [65] .
Потенциал действия этих клеток имеет ряд особенностей, отличающих его от ПД нервных клеток. Одной из них является его двухфазный вид; в ответ на стимул, а также и при самопроизвольном возбуждении, происходит резкий скачок потенциала (быстрая фаза) и затем более медленная деполяризация (медленная фаза) с возвращением к исходному уровню (рис. 1.8) [бб]. У клеток некоторых видов харовых водорослей обе фазы могут слиться в одну.
При стимуляции клетки возбуждаются обе мембраны клетки. Одно из детальных исследований особенностей ПД на плазмалемме и тонопласте клеток syncaZjoa проведено в [бб] . Его результаты сводятся к следующему. При возбуждении плазмалемма деполяризуется от -150 мВ до -40 -f -20 мВ, а тонопласт гиперполяризуется от 0 —20 мВ до -40 -г -60 мВ. ПД на тонопласте начинается на несколько миллисекунд позже и не имеет быстрой фазы (рис. 1.8). Длительность быстрого пика - около 500 мс, медленного - от 2 до нескольких деятков секунд. ПД на тонопласте и медленная фаза ПД на плазмалемме зависят от величины стимулирующего импульса (рис. 1.9). Возбуждение ПД на плазмалемме носит пороговый характер, на тонопласте - нет. Действие ингибиторов дыхания и разобщителей фосфорилирования показывает, что медленная фаза ПД более тесно связана с метаболизмом клетки.
На основе этих и некоторых других данных авторы предполагают, что в основе ЦЦ тонопласта лежат механизмы, отличающиеся от таковых на плазмалемме; и что изменения потенциала на тоно-пласте можно назвать ПД только условно. А изменения токов через тонопласт могут быть вызваны также и изменением активностей ионов в эндоплазме.
Исследования по идентификации ионных каналов, участвующих в возбуждении [86-89] , показали, что обе мембраны имеют подобные ионные каналы: потенциалзависимые Са-Ла каналы и возбудимые хлорные каналы. Активация Са Ла каналов любой из мембран происходит при смещении на ней потенциала в сторону деполяризации. Активация СИ -каналов осуществляется ионами Са , вошедшими через любую из мембран. Отсюда следует, что возбуждение одной из мембран приводит к возбуждению другой, причем раньше возбуждается та мембрана, напряжение на которой смещается в сторону деполяризации. При этом последовательность событий будет следующей: при деполяризации одной из мембран активируются ее La-Mi каналы, а затем вошедший через них Са активирует хлорные каналы обеих мембран. Это хорошо согласуется с экспериментом.
Методом встраивания выделенных из клетки каналов в БЛМ по-казано, что La - каналы являются агрегатами элементарных каналов - субъединиц,которые включаются и выключаются как одно целое, то есть кластерами. Термодинамически выгодная сборка имеет проводимость 200 пСм в 0,1 М КС и состоит примерно из 80 субъединиц [87].
Одновременная регистрация потенциала "вакуоль-внешняя среда" и скорости течения протоплазмы
Поскольку выделенные компоненты спектра прямо обусловлены потоком в клетке, то, с точностью до различного рода уширений, кривые л№) можно считать отражением распределения скоростей в потоке. Для наиболее часто используемых больших размеров измерительного объема (300 - 500 мкм) времяпролетное уширение в исследуемом диапазоне скоростей в сумме с оптическим уширением дает не более 2 Гц.
Для кривых ЧГ() является характерным практически линейный рост величины времени восстановления гармоники с возрастанием ее номера, начиная с номера первой гармоники, проявившей реакцию на остановку потока. Рост кривой Tff) продолжается до значений , соответствующих положению максимума кривой A(f) , и выше этих значений выходит на насыщение. Неизменность времен восстановления для гармоник, лежащих правее максимума кривой свидетельствует о том, что эти гармоники спектра не отражают наличия в потоке протоплазмы соответствующих значений скорости, а являются уширением последних гармоник, для которых еще наблюдался линейный рост 2 " , то есть гармоник, лежащих в области максимума кривой Л (+) Так как ширина правого крыла этих кривых в среднем составляет 10 т 5 Гц, а суммарное аппаратное уширение в этой области не превышает 2 Гц, то естественно отнести оставшееся уширение за счет уширения спектра вследствие нарушения пространственной когерентности зондирующего пучка оптическими неоднородностями стенок. Оценка радиуса корреляции неоднородности по полученной величине уширения приводит к значению 5 - 10 мкм, что хорошо соответствует размерам хлоропластов, покрывающих стенки клетки. Эта же величина уширения из-за неоднородности стенок получается при анализе полуширины НК спектра при наличии потока в клетке с учетом полуширины шумового пьедестала (аппаратное уширение в этой области спектра намного мень-ше указанных выше значений).
Таким образом, полученные кривые А(-р) можно считать отражением распределения скоростей в потоке протоплазмы, а кривые Ф СР) - характеризующими время восстановления различных компонент скорости потока только с учетом рассмотренных выше величин уширения спектра.
Для спектров, проявлявших ярко выраженный максимум в ДК определялась наивероятная скорость течения протоплазмы как положение максимума ДК на оси частот. Если спектр представлял собой плато, или максимум ДК не был резким, то определялась максимальная скорость течения протоплазмы как положение среза плато, то есть как положение максимума производной сглаженной спектральной кривой в этой области. В ряде случаев время нестационарности исследуемого процесса не позволяло обеспечить большое время усреднения при получении одного спектра, что приводило к более сильной зашумленности спектральной кривой. Тогда применялся алгоритм, основанный на неизменности формы среза сглаженного отнормированного спектра для одной клетки как при стационарном потоке, так и при восстановлении течения.
Сравнение результатов обработки одной и той же серии спектров каждым из трех алгоритмов показало полную идентичность формы полученных кривых. Одна из типичных кривых зависимости скорости от времени (момент стимуляции клетки отмечен стрелкой) приведена на рис. 2.18. Отметим наличие заметных флуктуации скорости около некоторого среднего значения как до, так и после стимуляции клетки. Их происхождение имеет несколько причин: 1) флуктуации определения скорости по форме спектра, связанные с конечностью времени усреднения при получении одного спектра; 2) наличие некоторого разброса скоростей движения частиц в клетке; со входом в измерительный объем одних частиц и выходом из него других распределение по скоростям в измерительном объеме несколько меняется, что отражается на положении среза ДК спектра. Средняя величина флуктуации скорости составляет обычно около 10% от ее среднего значения.
Для подтверждения доплеровского происхождения ДК спектра снята зависимость положения максимума или частоты среза ДК спектра от косинуса угла рассеяния (рис. 2.17), Как и кривая, полученная в [iio] , она отличается высокой степенью линейности и проходит через начало координат. Это подтверждает сделанный в этой работе вывод о независимости скорости движения частиц от их размера.
Математическая модель стационарного и нестационарного течения протоплазмы под действием заданного распределения движущей силы
Математическое моделирование дает возможность выявить ключевые моменты в исследуемом процессе и те факторы, которые оказывают решающее влияние на его протекание. Методы математического моделирования нашли успешное пршленение в биофизике и экологии, в описании автоколебательных химических реакций и иммунных процессов в организме, а также различного рода автоволновых процессов и процессов самоорганизации в живых системах [і2б] Последнее десятилетие характеризуется широким использованием математического подхода к исследованию биологической подвижности разных видов. В частности, большой цикл работ посвящен волновой форме подвижности жгутиковых и ресничковых микроорганизмов [I26-I30J , а также моделированию элементарных актов и кооперативных явлений в мышечном сокращении [131,132]
Что касается подвижности протоплазмы, то в этой области чувствуется, на наш взгляд, явный недостаток теоретических работ. Если некоторые модели, описывающие стационарные режимы течения протоплазмы под действием заданной силы, рассмотрены в работах [l5,133-135] , то, насколько нам известно, до начала наших работ не существовало моделей возможных механизмов генерании движущей силы течения, а также моделей переходных процессов в потоке протоплазмы. Тем не менее, имеющихся в настоящее время в литературе данных достаточно, на наш взгляд, для формулировки первого приближения таких моделей.
Ниже коротко изложены основные положения имеющихся в литературе феноменологических моделей течения протоплазмы. Одна из первых работ была сделана Дональдсоном [15,133], исходившим из равномерного распределения некоторой плотности движущей силы в узком ( 1 - 0,5 мкм) прикортикальном слое. Им рассматривалось неныотоновское приближение для эндоплазмы и были рас-_ считаны стационарные профили скорости при следующих упрощающих предположениях: I) существованием тонопласта пренебрегается; 2) граница эндоплазмы с вакуолярным соком считается свободной поверхностью, что основывается на большом различии вязкостей эндоплазмы и клеточного сока; 3) на поверхности кортекса выполняется условие прилипания; 4) кривизной цилиндрической формы клетки пренебрегается (рассматривается только слой эндоплазмы)
Путем максимального приближения теоретических кривых к имевшимся экспериментально им были получены соответствующие значения плотности движущей силы, толщины активного слоя (то есть слоя, по которому предполагалась распределенной движущая сила), а также вязкости эндоплазмы. Результаты приведенного в [іб] расчета приведены в таблице 4.1.
Отметим, что Дональдсоном для описания неньютоновских свойств эндоплазмы использовался реологический закон (І.І) с показателем степени, равным 1/3. Расчет одного из вариантов стационарного профиля скорости течения эндоплазмы и клеточного сока в неньютоновском приближении сделан в работе [l34] . Сравнение влияния локализации движущей силы на гидродинамические характеристики потока было сделано Нотнагелем и Уэб-бом fl35] в приближении эндоплазмы как ньютоновской жидкости. Ими определялась плотность движущей силы, исходя из заданной максимальной скорости течения эндоплазмы и некоторого закона распределения движущей силы, чисто умозрительно связываемого с тем или иным способом взаимодействия системы актиновых фила-ментов с растворенным в цитоплазме миозином. Таким образом, судя по имеющимся в литературе данным, полной модели подвижности протоплазмы в клетках харовых водорослей, включающей: I) один или несколько альтернативных молекулярных механизмов генерации движущей силы течения; 2) гидродинамические характеристики определяемого ими потока; 3) существующее, на наш взгляд, взаимовлияние механизма генерации движущей силы и потока протоплазмы; 4) удовлетворительно описывающей экспериментально наблюдаемый процесс возникновения и развития потока протоплазмы, - в настоящее время не существует. В данной главе сделана попытка построения замкнутой модели течения протоплазмы в клетках харовой водоросли, удовлетворяющей как имеющимся в литературе, так и полученным нами данным. Проведен также сравнительный анализ нескольких предполагаемых гипотез молекулярного механизма генерации движущей силы течения протоплазмы. Напомним, что существующие в настоящее время гипотезы механизма создания движущей силы течения протоплазмы можно разделить на 2 больших класса: 1) эндоплазму приводит в движение некоторое количество активно перемещающихся частиц; 2) существует некоторый молекулярный механизм создания распределенной движущей силы, вызывающий течение эндоплазмы, которое пассивно увлекает за собой внутриклеточные частицы. Против первого варианта создания течения эндоплазмы говорят как имеющиеся в литературе, так и полученные нами результаты (см. 3 главы П и 2 главы І). В то же время в пользу второго класса гипотез свидетельствуют эксперименты Яно и Шими-цу по реконструкции стационарного потока в системе "актиновые соиламенты - растворенный миозин" [41-44].
